三種糖品中植物甾醇的測定

陳其釗，林燕純，劉志鵬*，陳嘉敏，李長成，王桂華，李家威，余構彬

1(廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業研究所)國家糖業質量監督檢驗中心，廣東 廣州，510316) 2(汕頭普羅凱融生物醫藥科技有限公司，廣東 汕頭，515000)

紅糖產品(紅糖，黑糖，赤砂糖)因其保留了甘蔗原有的風味和營養物質(蛋白質，礦物質，維生素，酚類物質，有機酸，植物甾醇等非糖成分)，符合天然健康的飲食觀念[1-2]，享有健脾養胃、溫中補氣、緩解精通的溫補美譽，深受消費者喜愛。國內外學者研究發現，其保健功能物質基礎可能與紅糖產品中的非糖成分有密切關系[3-9]。甘蔗甾醇含量高，抗炎、降血脂、緩解非酒精性脂肪肝化能力強[10-13]，紅糖作為甘蔗全汁濃縮物，甘蔗甾醇在傳統提取濃縮工藝中自然進入紅糖產品，但目前對傳統工藝紅糖產品的甾醇類成分研究報道較少。為探討傳統紅糖的保健功能及機制，了解紅糖產品中甾醇的含量及其在加工過程中的變化,本文建立了一種高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定紅糖產品中5種植物甾醇含量的方法，并對紅糖產品中3種常見的甾醇含量進行了分析測定,以期為紅糖產品的深入開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高效液相色譜儀(Agilent 1290)，安捷倫科技(中國)有限公司；旋轉蒸發儀(IKA RV8)、旋渦混合器(VORTEX 3)，艾卡(廣州)儀器設備有限公司；恒溫水浴鍋(DKZ-2B)，上海一恒科技有限公司；醫用離心機(CL5R)，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Milli-Q超純水系統，默克密理博公司。

甲醇、乙腈(色譜純)，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；石油醚、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、KOH，無水乙醇(分析純)，廣州化學試劑有限公司。

色譜柱 Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；Waters ACQUITY UPLC BEH C8(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；ZORBAX SB C8RRHD(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)

標準物質：麥角甾醇、膽甾醇、豆甾醇、β谷甾醇和菜油甾醇(純度≥95%)，上海安譜實驗科技股份有限公司。

96批次食糖樣品均來自2017～2019年廣東、廣西、云南3個不同產地，其中41個紅糖樣品，11個黑糖樣品，44個赤砂糖樣品。在分析之前，所有食糖樣品都儲存在塑料罐中，陰涼避光保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件：

Waters ACQUITY UPLC BEH C8(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)液相色譜柱；檢測波長205 nm(β-谷甾醇，菜油甾醇，膽甾醇和豆甾醇最大吸收波長)，282 nm(麥角甾醇最大吸收波長)；流速0.4 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量5 μL。流動相：A相為水，B相為乙腈；采用梯度洗脫，0～9.5 min 80%～90% B相。

1.2.2 供試品溶液的制備

取約3.0 g樣品置于錐形瓶中，加入無水乙醇溶液旋渦提取30 min，以體積比1∶1加入50%(質量分數)NaOH溶液，搖勻，在80 ℃水浴中皂化60 min，冷卻后加入水10 mL，并移入分液漏斗中，用15 mL二氯甲烷分3次萃取，合并萃取液，旋干，用甲醇2 mL復溶，用0.22 μm微孔濾膜過濾，用于HPLC進樣。

1.2.3 標準溶液的配制

分別稱取適量麥角甾醇、膽甾醇、豆甾醇、β谷甾醇和菜油甾醇，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，分別制成約1.0 mg/mL的儲備液，于4 ℃下避光儲存備用。取適量部分上述標準儲備液用甲醇配制成質量濃度為0.1～100 ng/mL系列標準工作液。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

2.1.1 檢測波長選擇

在190～400 nm下分別對5種甾醇標準溶液進行紫外掃描，發現麥角甾醇的最大吸收波長為282 nm，膽甾醇，豆甾醇，菜油甾醇和β-谷甾醇在205 nm處有最強吸收(見圖1)，因此麥角甾醇的檢測波長選擇282 nm，膽甾醇，豆甾醇，菜油甾醇和β-谷甾醇的檢測波長選擇205 nm。

A-麥角甾醇；B-膽甾醇；C-菜油甾醇； D-豆甾醇；E-β-谷甾醇圖1 5種植物甾醇的吸收光譜圖(掃描波長190～640 nm)Fig.1 Adsorption chromatography of 5 phytosterols

2.1.2 色譜柱選擇

嘗試了安捷倫ZORBAX SB C8RRHD(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，Waters ACQUITY UPLC BEH C8(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)三款色譜柱。發現C18對4種成分的分離效果好，但是運行比較長，在超高效色譜系統需要28 min才能完全出峰。不同牌子的C8色譜柱對于分離情況也有區別，相同流動相，相同梯度下ZORBAX SB C8RRHD柱不能分離菜油甾醇和豆甾醇，Waters ACQUITY UPLC BEH C8則能實現8 min內5種成分完全分離。

2.1.3 流動相選擇

流動相：甲醇截止波長為205 nm;乙腈截止波長為190 nm，而膽甾醇，豆甾醇，菜油甾醇和β-谷甾醇的最大吸收波長為205 nm，在甲醇水系統下，基線漂移嚴重。故選擇乙腈水作為流動相。嘗試了乙腈-水100∶0、98∶2、95∶5、90∶10、80∶20(體積比)等多種等度洗脫，均無法實現菜油甾醇和豆甾醇的分離。梯度洗脫：0～9.5 min乙腈80%～90%，則能5種成分完全基線分離；流速，柱溫對峰位和組分分離影響不大。在此條件下菜籽甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇分離情況良好，滿足定量分析要求，見圖2、圖3。

A-205 nm；B-282 nm；1-麥角甾醇;2-膽甾醇;3-菜油甾醇;4-豆甾醇;5-β-谷甾醇圖2 標準色譜圖Fig.2 Chromatogram of standard

A-205 nm；B-282 nm；1-麥角甾醇;2-膽甾醇;3-菜油甾醇;4-豆甾醇;5-β-谷甾醇圖3 樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of sample

2.1.4 提取方法的優化

文獻報道的提取方法大多數使用回流皂化，溶劑萃取再濃縮，耗費時間比較長，操作復雜[10-13]。也有針對樣品基質比較簡單的，僅需超聲或渦旋提取，皂化即得[14-20]。因為糖品的基質較簡單，所以本文也采用直接提取皂化法。前期在文獻總結的基礎上運用響應面法對超聲提取時間、料液比、皂化時間和萃取次數進行實驗探究和優化，得到5種甾醇的提取工藝條件為：料液比為1∶10，提取時間為19.58 min，皂化時間1 h，萃取次數3次，提取總量預測為20.012 μg。對預測的最佳工藝條件進行了驗證并結合實際操作，將驗證條件修正為料液比為1∶10，提取時間為20 min，皂化時間1 h，萃取次數3次。

2.2 方法學考察

2.2.1 線性范圍

精密吸取混合對照品儲備液一定體積，按倍數關系稀釋成不同質量濃度的標準溶液進行測定，采用優化后的前處理方法以及色譜條件，以5種甾醇色譜峰的峰面積平均值(Y)為縱坐標，對應的標準溶液濃度(X)為橫坐標，繪制標準曲線；以信噪比S/N=3確定儀器檢出限。結果如表1所示，5種植物甾醇在各自濃度范圍內線性關系良好，相關系數均不小于0.999 7；麥角甾醇檢出限均為0.023 mg/kg，膽甾醇為0.14 mg/kg，菜油甾醇為0.18 mg/kg，豆甾醇為0.11 mg/kg，β-谷甾醇為0.17 mg/kg，方法靈敏度較高，可滿足糖品中甾醇檢測需要。

表1 方法的線性范圍、回歸方程及檢出限Table 1 Linear range，linear equations and limits of detection of the method

2.2.2 精密度試驗

取供試品溶液按照1.2.1項下色譜條件連續進樣6次，結果顯示，麥角甾醇、膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇峰面積的精密度(相對標準偏差)分別為1.6%、3.9%、1.3%、0.20%、0.29%表明儀器的精密度良好。

2.2.3 加標回收率

精確稱取紅糖樣品3.0 g，按重復性結果計算得到5個甾醇成分的含量，分別加入3個水平的對照品，在最佳提取條件及色譜條件下，每一濃度平行3次測定紅糖中植物甾醇的回收率，結果見表2。由表2可知，紅糖中麥角甾醇的平均回收率為74.4%～95.8%，膽甾醇的平均回收率為82.3%～91.4%，菜油甾醇的平均回收率為84.6%～102.5%，豆甾醇的回收率為88.0%～92.1%，β-谷甾醇的回收率為75.4%～92.6%。

表2 方法的回收率(n=6)Table 2 Recovery of the method(n=6)

2.3 樣品含量測定與聚類分析

2.3.1 樣品含量測定

取96批不同產地和級別的紅糖，黑糖和赤砂糖樣品按優化后的最佳提取條件和最優色譜條件進行含量測定，按2.4.1中的線性方程計算麥角甾醇、膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇的含量，結果見表3。由表3可知，所測96個樣品中大部分含有5種植物甾醇。5種植物甾醇以豆甾醇和β-谷甾醇含量較高，可達244.41 mg/kg、67.38 mg/kg，麥角甾醇含量最低。

3種糖品中平均總甾醇含量差異明顯，分布為紅糖>黑糖>赤砂糖。GB/T 35886—2018[21]食糖分類中提到，紅糖是糖汁清凈處理后直接煉煮不經分蜜制成。而赤砂糖則是經過了分蜜制成，是工業化生產白砂糖的副產品。目前還沒有黑糖的國家標準，據DB 4413/T 10—2019[22]和QB/T 4567—2013[23]描述其生產工藝與紅糖相似，只是煉煮的顏色差異。因此總甾醇含量差異可能與3種糖品的生產工藝或產地有關，但還需進一步分析研究。

從糖品的等級上看，無論紅糖的優級、一級和二級還是赤砂糖的一、二級，在總甾醇含量上并沒有多大區分。

表3 實際樣品的測定結果 單位：mg/kg

2.3.2 聚類分析

綜合不同產地和級別的糖品中麥角甾醇、膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇的含量和甾醇總含量這6個指標，借助SPSS軟件并采用系統聚類法中的Ward 聯結和平方Euclidean距離系數對紅糖，黑糖，赤砂糖樣品進行聚類分析，結果如圖4～圖6所示。

圖4 紅糖聚類分析樹狀圖Fig.4 Brown sugar cluster analysis dendrogram

圖5 黑糖聚類分析樹狀圖Fig.5 Dark brown sugarcluster analysis dendrogram

圖6 赤砂糖聚類分析樹狀圖Fig.6 Brown granulated suga rcluster analysis dendrogram

由圖4可知，41個紅糖樣品可分為四大類。第一類為2、18～25、27、31、33、35～37號樣品，第二類為1、4、6、7、14、16、26、28、29、30、32、34號樣品，第三類為3、5、8、9、11～13、15、17、38～41號樣品；10號樣品與其他樣品間距較大，分一類。

由圖5可知，11個黑糖樣品可分為三大類。第一類為44～47、50～52號樣品，第二類為42、49號樣品，第三類為43、48號樣品；

由圖6可知，44個赤砂糖樣品可分為五大類。第一類為53～56、59～60、62、64、67、70、72～79、82、84～86、88、91、94、96號樣品，第二類為71、83、92～93號樣品，第三類為61、63、65、69、80、81、87、89、90、95號樣品；第四類為58、66、68號樣品；57號樣品與其他樣品間距較大，分為一類。

3 結論

本文通過對3種糖品的前處理和色譜條件的優化，建立了超高效液相色譜法同時測定紅糖中麥角甾醇、膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇這5種植物甾醇的方法。對3種糖品96個樣本中5種植物甾醇的含量進行檢測，結果發現其中5種植物甾醇以豆甾醇和β-谷甾醇含量較高，麥角甾醇含量最低，不同糖品中總甾醇成分含量差異較大，分布為紅糖>黑糖>赤砂糖。植物甾醇作為具有一定藥用價值的成分，研究其在紅糖產品中的含量可為其產品質量標準的提高提供參考，為其合理開發利用奠定基礎。