IRS-1/TAZ信號通路對骨髓脂肪化的影響及機制

王 娜，劉 暢，薛 鵬，WANG Xiao，李玉坤，劉斯靜

(1.河北醫科大學第三醫院內分泌科，河北省骨科生物力學重點實驗室，河北 石家莊 050051；2.約翰·霍普金斯醫學院肌肉與骨骼研究中心，美國 馬里蘭 21212；3.河北醫科大學期刊社，河北 石家莊 050017)

成骨細胞和脂肪細胞共同來源于骨髓間充質干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)，因此其分化過程存在競爭關系。脂肪細胞占骨髓細胞的15%～70%，疾病狀態下(如骨質疏松癥)或者隨著年齡增長，脂肪細胞數目增多，替代正常的其他類型細胞分化，如成骨細胞分化[1]。胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1，IRS-1)是胰島素信號通路的樞紐因子，可以通過激活下游通路的一系列信號轉導，完成對細胞增殖、凋亡、分化等功能的調節[2]。目前，關于IRS-1對成脂分化的作用尚存爭議。一項動物實驗表明，敲除IRS-1基因可使成脂分化呈進行性降低[3]。Kim等[4]研究發現，過表達IRS-1改善脂肪細胞脂質儲存，即IRS-1促進脂質合成。具有盤狀同源區域結合序列的轉錄共活化因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ)是一種調節干細胞增殖、分化等功能的重要轉錄調控因子[5]。Byun等[6]研究表明，TAZ一方面通過共活化Runt相關轉錄因子2(Runt related transcription factor 2，RUNX2)促進BMSCs向成骨細胞方向分化，另一方面通過結合過氧化物酶體增生物激活受體γ(Peroxisome proliferator activated receptorγ，PPARγ)抑制成脂分化相關基因轉錄，抑制BMSCs向脂肪細胞分化。TAZ是否還有其他機制并不明確，且其所受調控的上游信號通路并未完全闡明[7]。本研究旨在探索IRS-1/TAZ信號通路調控BMSCs向成脂細胞分化的潛在機制，為糖尿病發病候選基因IRS-1參與調控骨代謝和脂肪代謝提供新依據。

1 材 料 與 方 法

1.1實驗動物 3月齡SPF級雌性未受孕SD(Sprague Dawley)大鼠15只用于動物實驗；另4周齡SD大鼠9只用于BMSCs的原代培養。實驗動物購于河北省實驗動物中心，動物合格證書號 1708080。

1.2方法

1.2.1動物分組及骨質疏松模型的構建 將15只3月齡SD大鼠隨機分為對照組、假手術組和去卵巢手術(ovariectomy，OVX)組，每組5只。去卵巢手術操作步驟：大鼠禁食禁水12 h后進行麻醉，俯臥位定位大鼠卵巢，消毒手術部位，依次剪開皮膚、肌肉、筋膜，分離脂肪團，手術結扎輸卵管，完整切除雙側卵巢，止血并逐層縫合。假手術組僅切除卵巢等體積脂肪組織，保留卵巢。術后3 d連續應用抗生素預防感染。術后12周用于后續實驗。

1.2.2大鼠BMSCs的原代培養及成脂分化 將4周齡SD大鼠CO2麻醉后處死，用75%乙醇浸泡5 min。在無菌條件下取雙側股骨，剪除股骨近端骨骺，用5 mL注射器吸取DMEM培養基反復沖洗骨髓腔。細胞取出后，以5×106/cm2的密度接種于含12%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養基中，放入細胞培養箱中培養。原代細胞達到80%融合后傳代，P3代細胞用于后續實驗。應用成脂誘導培養基(DMEM含12%胎牛血清，1%青鏈霉素，10 g/L胰島素,500 mmol/L甲基異丁基黃酸鈉和1 μmol/L地塞米松)誘導BMSCs向脂肪細胞分化。

1.2.3組織化學染色 取SD大鼠股骨，用4%多聚甲醛固定，4 ℃，24 h；0.5 mol/L乙二胺四乙酸脫鈣3周，4 ℃，搖床；酒精梯度脫水后石蠟包埋，制作4 μm石蠟，切片。將石蠟切片65 ℃烘干，二甲苯脫蠟，酒精梯度復水。采用蘇木精和伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色的標準步驟進行染色。顯微鏡下對脂肪細胞進行計數并拍照。

1.2.4免疫熒光分析 取SD大鼠股骨，用4%多聚甲醛固定，4 ℃，24 h；0.5 mol/L乙二胺四乙酸脫鈣3周，4 ℃，搖床；應用8%明膠包埋，制作20 μm冰凍切片。將冰凍切片37 ℃烘干，浸泡于PBS液15 min，5% BSA封閉1 h，一抗孵育(抗圍脂滴蛋白，Sigma)，4 ℃，過夜；TBST清洗，熒光二抗孵育1 h，TBST清洗，封片。顯微鏡下對熒光標記細胞進行計數并拍照。

1.2.5酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 取SD大鼠股骨，將周圍組織剔除干凈，于液氮條件下研磨，加入RIPA裂解液，超聲破碎后離心，取上清液。根據IRS-1 ELISA試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司)操作步驟測定IRS-1濃度。

1.2.6質粒轉染 課題組在前期實驗中已經自行構建IRS-1高表達質粒(pCMV-IRS-1)[8]。本研究構建了分別用于敲除IRS-1和TAZ表達的質粒，即嵌入可敲除IRS-1表達的小干擾RNA(SiIRS-1)的質粒，以及嵌入可敲除TAZ表達的小干擾RNA(SiTAZ)的質粒(上海吉凱基因化學有限公司)。應用脂質體3 000(Thermo)對BMSCs進行轉染。細胞轉染24 h后，更換為成脂誘導培養基進行培養。同時設立對照組，未進行質粒轉染組設置為“空白對照組”，轉染空白質粒組作為“陰性對照組”。

1.2.7油紅O染色 將細胞接種至35 mm塑料培養皿中成脂誘導14 d后，PBS清洗2次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，蒸餾水清洗3次。將油紅O儲存液(0.5 g油紅O溶于100 mL異丙醇)與蒸餾水以3∶2的比例配置工作液，室溫放置10 min后過濾。應用油紅O工作液室溫染色15 min。蒸餾水清洗3次后，顯微鏡下拍照。然后，應用異丙醇對油紅O進行脫色，加入等體積PBS液后放入通風櫥，室溫，30 min。應用酶標儀(520 nm)讀取其OD值。

1.2.8蛋白免疫印跡(Western blot) 將細胞接種至60 mm塑料培養皿中成脂誘導3 d后，利用RIPA裂解液提取蛋白。應用12% SDS-PAGE膠對蛋白進行電泳分離后，采用半干法將其轉移至PVDF膜。5%牛奶封閉，37 ℃，室溫。一抗孵育(抗TAZ，Cell Signaling；抗CCAAT/增強子結合蛋白β(CCAAT/enhancer binding protein β,C/EBPβ)，Boster；抗PPARγ，Boster；抗GAPDH，Bioworld)，4 ℃，過夜。二抗37 ℃孵育1 h。分析蛋白條帶灰度值，并計算目的蛋白與內參蛋白條帶灰度值的比值。

1.3統計學方法 應用SPSS 20.0統計軟件分析數據。所有實驗至少重復3次。計量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1不同組別大鼠股骨內脂肪細胞計數、熒光標記細胞計數、IRS-1濃度比較 對大鼠股骨進行HE染色，計數脂肪細胞，結果發現，3組間脂肪細胞計數差異有統計學意義(P<0.05),OVX組脂肪細胞計數多于對照組和假手術組，差異有統計學意義(P<0.05),對照組和假手術組脂肪細胞計數差異無統計學意義(P>0.05)。利用免疫熒光染色對脂肪細胞標記物圍脂滴蛋白進行標記并計數，分析結果與HE染色結果趨勢一致。ELISA法測定大鼠股骨內IRS-1濃度，結果發現，3組間IRS-1濃度差異有統計學意義(P<0.05),OVX組IRS-1濃度低于對照組和假手術組，差異有統計學意義(P<0.05),對照組和假手術組IRS-1濃度差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1，表1。

表1 不同組別大鼠股骨內脂肪細胞、熒光標記細胞計數和IRS-1濃度比較

2.2IRS-1基因高表達對油紅O染色結果和成脂分化相關蛋白表達的影響 BMSCs成脂誘導14 d后，對其進行油紅O染色，結果發現，應用pCMV-IRS-1轉染后，IRS-1組BMSCs的脂滴明顯少于空白對照組和陰性對照組(圖2A)。進一步對油紅O吸光度進行定量分析后發現，3組油紅O吸光度差異有統計學意義(P<0.05),IRS-1高表達組吸光度值低于空白對照組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，空白對照組和陰性對照組吸光度值差異無統計學意義(P>0.05)。BMSCs成骨誘導3 d后，采用Western blot方法對成脂分化相關蛋白TAZ、C/EBPβ、PPARγ的表達水平進行分析，結果發現，IRS-1組TAZ的表達量明顯高于空白對照組和陰性對照組，C/EBPβ、PPARγ的表達量明顯低于空白對照組和陰性對照組(圖2B)。進一步對蛋白條帶灰度值進行定量分析后發現，3組TAZ、C/EBPβ、PPARγ的表達量差異有統計學意義(P<0.05), IRS-1組TAZ的表達量高于空白對照組和陰性對照組，C/EBPβ、PPARγ的表達量低于空白對照組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05),空白對照組和陰性對照組TAZ、C/EBPβ、PPARγ的表達量差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 IRS-1基因高表達對油紅O染色和TAZ、CEBPβ、PPARγ表達影響的定量分析

2.3IRS-1或TAZ基因敲除對油紅O染色結果和成脂分化相關蛋白表達的影響 油紅O染色結果提示，SiIRS-1組和SiTAZ組脂滴明顯多于空白對照組和陰性對照組(圖3A)。進一步對油紅O吸光度進行定量分析后發現，4組間油紅O吸光度差異有統計學意義(P<0.05),SiIRS-1組和SiTAZ組吸光度值高于空白對照組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05), SiIRS-1組和SiTAZ組、空白對照組和陰性對照組吸光度值差異無統計學意義(P>0.05)。Western blot結果顯示，SiIRS-1組和SiTAZ組TAZ的表達量明顯低于空白對照組和陰性對照組，C/EBPβ、PPARγ的表達量明顯高于空白對照組和陰性對照組(圖3B)。進一步對蛋白條帶灰度值進行定量分析后發現，4間組TAZ、C/EBPβ、PPARγ的表達量差異有統計學意義(P<0.05),SiIRS-1組和SiTAZ組TAZ的表達量低于空白對照組和陰性對照組；C/EBPβ、PPARγ的表達量高于空白對照組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。SiIRS-1組和SiTAZ組、空白對照組和陰性對照組TAZ、C/EBPβ、PPARγ的表達量差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 IRS-1或TAZ基因敲除對油紅O染色和TAZ、CEBPβ、PPARγ表達影響的定量分析

3 討 論

在骨髓微環境中，干細胞除了向成骨細胞分化，還可以向其他類型細胞分化。在干細胞定向分化系統中，成骨細胞和成脂細胞來源于共同的祖細胞，成骨分化和成脂分化之間的信號轉導聯系最為密切[9]。若BMSCs向成脂細胞分化，則成骨分化信號轉導受到抑制，它們之間相互競爭以保持骨髓中不同細胞類型的穩定增長[10]。因此，骨質疏松癥患者，尤其是在老年人群，常常伴隨骨髓脂肪細胞蓄積。

IRS-1是激素受體后錨定蛋白，能結合下游特定靶分子，進而參與調控多種細胞代謝過程，脂代謝便是其中之一[11]。本研究采用大鼠BMSCs作為研究對象，油紅O染色及半定量分析結果表明，過表達IRS-1則BMSCs向成脂細胞分化被抑制，敲低IRS-1則BMSCs向成脂細胞分化增多。既往研究發現，轉錄共活化因子TAZ可與成脂分化關鍵轉錄因子PPARγ結合，減少其下游靶基因轉錄，從而抑制成脂分化進程[12-13]。作為YAP類似物，TAZ第89位絲氨酸位點被磷酸化后，與14-3-3蛋白結合，將復合體阻滯于細胞質，使復合體進一步蓄積，從而發揮相應信號轉導或信號組織作用。目前研究表明，TAZ可能受上游多條信號通路的調控，包括TGFβ、BMP、Wnt等信號通路[14]。可見，胰島素信號通路的樞紐分子IRS-1也是TAZ的上游信號，可通過靶向調控TAZ表達影響BMSCs向成脂細胞分化的進程。

本研究結果顯示，過表達IRS-1則成脂分化標志物C/EBPβ、PPARγ表達下調，敲低IRS-1和TAZ則成脂分化標志物C/EBPβ、PPARγ表達上調。C/EBPs蛋白家族表達于多種細胞類型，廣泛參與調控細胞增殖、凋亡、分化等生命過程[15]。目前已發現6個C/EBPs蛋白家族成員：C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPγ、C/EBPδ、C/EBPε和C/EBPζ(又稱為CHOP-10)。其中，C/EBPβ和C/EBPδ是脂肪細胞分化早期標志物，在成脂分化誘導劑處理后，脂肪細胞前體中C/EBPβ、C/EBPδ表達即可達峰。更重要的是，即使不添加成脂誘導劑，C/EBPβ也可促使脂肪細胞前體進入脂肪細胞分化程序。另一方面，PPARs是一類配體激活核轉錄因子超家族，包括3種亞型：PPARα、PPARβ和PPARγ[16]。在成脂分化早期，活化的C/EBPβ和C/EBPδ將進一步激活C/EBPα和PPARγ。C/EBPα和PPARγ不僅促進自身表達，同時還能促進相互表達，并且對大部分脂肪細胞分化的特異性基因(如aP2、GLUT4等)的表達是必不可少的[17]。本研究結果顯示，過表達IRS-1引起C/EBPβ、PPARγ表達下調，說明成脂分化信號轉導部分阻斷。反之，敲低IRS-1和TAZ引起C/EBPβ、PPARγ表達上調，說明成脂分化信號轉導增強。可見，IRS-1/TAZ信號通路可通過C/EBPβ、PPARγ調控BMSCs成脂分化進程。

綜上所述，IRS-1通過上調TAZ表達，抑制BMSCs向脂肪細胞分化。因此，IRS-1/TAZ信號可作為控制骨質疏松癥骨髓脂肪化的重要靶點。(本文圖見封三)