自噬體及凋亡小體對新生小鼠支氣管肺發育不良調控作用

鄭 瑜，厲 蘭，胡繪平，李正濤，劉文春，彭貽界

(湖北省恩施州土家族苗族自治州中心醫院兒一科，湖北 恩施 445000)

支氣管肺發育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是引起持續性呼吸窘迫的慢性肺部疾病，也是極低出生體重兒和超低出生體重兒呼吸系統常見的并發癥之一，近年來其發生率呈上升趨勢[1]。BPD具有較高的致死率和致殘率，嚴重影響患兒健康與生活質量[2]。目前BPD尚無安全有效的治療方法，因此需要尋找預防與治療BPD的新的突破點。BPD病因尚未完全明確，是多種因素共同參與的結果。凋亡及自噬是參與維持機體正常生理平衡的重要機制，有研究發現[3]，自噬及凋亡與BPD發生、發展關系密切，肺泡Ⅱ型上皮細胞(type Ⅱ alveolar epithelial cells，ATⅡ)過度凋亡是BPD大鼠肺發育障礙的主要原因之一。但自噬體及凋亡小體對新生小鼠BPD調控作用尚不清楚。因此本研究就自噬體及凋亡小體對新生小鼠BPD調控作用進行了相關探討，以期為臨床治療BPD提供新的方向，現報告如下。

1 材 料 與 方 法

1.1實驗動物 新生1日齡雌性SPF級Sprague Dawley小鼠36只，購于廣州春盛生物研究院有限公司，許可證號SYXK(粵)2017-0176。

1.2方法 將36只小鼠分為對照組、模型組、干預組，每組12只。BPD造模方法如下：將小鼠置于自制的密閉式飼養箱中，持續輸入氧氣(2 L/min)，應用氧濃度監測儀(北京杰瑞恒達科技有限公司，型號：HD-828)對氧濃度進行持續監測，使氧濃度維持在60%，連續21 d，BPD模型制備成功標準參照文獻[1]。對照組小鼠置于通氣的鼠籠中。干預組小鼠從造模開始給予自噬抑制劑(氯喹，新鄉市華幸生物科技有限公司)20 mg/kg腹腔注射，1次/d，連續21 d。新生鼠由母鼠喂養，每24 h交換模型組和對照組母鼠，以避免喂養能力差異。

1.3觀察指標

1.3.1各組小鼠一般情況 22 d時觀察并記錄小鼠精神狀態、毛發生長、飲食、呼吸、體重、死亡等情況。

1.3.2采用HE染色觀察各組小鼠肺組織病理變化 22 d時取各組小鼠肺組織，10%甲醛溶液(上海哈靈生物科技有限公司)固定，梯度酒精(北京智云達科技股份有限公司)脫水，二甲苯(上海安譜實驗科技股份有限公司)透明，石蠟包埋成塊，采用組織切片機(上海艾測電子科技有限公司，型號：KD3368AM)切成5 μm連續切片，脫蠟水化，采用HE染色試劑盒(海威奧生物科技有限公司)染色，沖洗，烘片，脫水，透明，中性樹膠固封劑(北京中生瑞泰科技有限公司)封片，采用光學顯微鏡(上海富萊光學科技公司，型號：SOPTOPEX31)觀察各組小鼠肺組織病理變化。

1.3.3透射電鏡下觀察各組小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞超微結構 22 d時取各組小鼠肺組織，10%甲醛溶液固定，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)(上海研拓生物科技有限公司)漂洗，1%鋨酸(上海雅吉生物科技有限公司)固定，梯度酒精脫水，丙酮包埋液(上海博通化學科技有限公司)包埋，使用組織切片機切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，采用透射電鏡(日本JEOL公司，型號：JEM-1200EX)觀察各組小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞超微結構。

1.3.4采用Western Blot檢測肺組織中LC3B、P62、Bax、caspase-3蛋白表達水平 取各組小鼠肺組織，剪碎，加入RIPA組織裂解液(北京艾德萊生物科技有限公司)裂解，4 ℃條件下采用超速低溫離心機(上海豐恒生物科技有限公司，型號：HERMLE-Z383K)以12 000 g離心15 min，取上清，使用BCA試劑盒(上海陽光生物科技有限公司)對蛋白定量，取總蛋白上樣，電泳，切膠，轉膜，封閉，加入1∶200稀釋的兔抗人 LC3B單克隆抗體(美國abcam公司)、1∶200稀釋的兔抗人P62單克隆抗體(上海麥倉生物科技有限公司)、1∶200稀釋的兔抗人Bax單克隆抗體(武漢艾美捷科技有限公司)、1∶200稀釋的兔抗人caspase-3單克隆抗體(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)、1∶500稀釋的兔抗人β-actin單克隆抗體(青島捷世康生物科技有限公司)，4 ℃孵育過夜，PBST緩沖液(上海雙螺旋生物科技有限公司)洗膜，加入1∶2 000稀釋的HRP標記山羊抗兔IgG二抗(北京百奧萊博科技有限公司)，4 ℃孵育過夜，PBST緩沖液洗膜，采用ECL發光試劑盒(上海通蔚生物科技有限公司)對PVDF膜進行曝光顯影，應用Image-pro Plus軟件檢測各條帶灰度值。

1.4統計學方法 應用SPSS 22.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組小鼠一般生長情況 對照組小鼠生長情況正常，精神狀態、毛發生長、飲食情況、呼吸情況、體重等均良好，未出現死亡小鼠；模型組呈現病態特征，精神狀態、毛發生長、飲食情況、呼吸情況、體重等明顯異常，出現1只死亡小鼠；干預組精神狀態、毛發生長、飲食情況、呼吸情況、體重等明顯好轉，未出現死亡小鼠，見表1。

表1 各組小鼠一般生長情況

2.2各組小鼠肺組織HE染色結果 對照組小鼠肺泡結構規整，大小均一，分布均勻，間隔適中，無炎性水腫。模型組小鼠肺泡嵴樣結構減少，肺泡數量減少，肺泡間隔增厚，可見肺大皰、炎性不張及明顯間質水腫。干預組病理改變較模型組明顯減輕，肺泡嵴樣結構逐漸增多，肺泡數量逐漸增多，肺泡間隔逐漸變薄，炎性水腫明顯改善，見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色結果(×100)

2.3各組小鼠肺組織透射電鏡觀察結果 對照組小鼠ATⅡ細胞呈立方形，體積較小，細胞核大而圓，細胞質染色較淺淡，胞質中可見線粒體，胞漿中可見自噬體及凋亡小體，胞漿內可見清晰的板層小體結構。模型組小鼠ATⅡ細胞形態欠規整，細胞器模模糊不清，細胞核固縮且染色質凝集，凋亡細胞增多，胞漿中存在大量自噬體及凋亡小體，自噬體及凋亡小體數量較對照組明顯增多。干預組小鼠ATⅡ細胞形態逐漸恢復正常，可見雙層膜結構以及包裹的細胞器，自噬體及凋亡小體數量較模型組明顯減少，見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織透射電鏡觀察結果(×1 000)

2.4各組小鼠肺組織中自噬相關蛋白 LC3B、P62表達水平 模型組小鼠肺組織中LC3B、P62水平顯著高于對照組(P<0.05)，干預組小鼠肺組織中LC3B、P62水平顯著低于模型組(P<0.05)，干預組小鼠肺組織中LC3B、P62水平顯著高于對照組(P<0.05)，見表2、圖3。

表2 各組小鼠肺組織中自噬相關蛋白 LC3B、P62表達水平

2.5各組小鼠肺組織中凋亡相關蛋白Bax、caspase-3表達水平 模型組小鼠肺組織中Bax、caspase-3水平顯著高于對照組(P<0.05)，干預組小鼠肺組織中Bax、caspase-3水平顯著低于模型組(P<0.05)，干預組小鼠肺組織中Bax、caspase-3水平顯著高于對照組(P<0.05)，見表3，圖4。

表3 各組小鼠肺組織中凋亡相關蛋白Bax、caspase-3表達水平

圖4 各組小鼠肺組織中Bax、caspase-3水平

3 討 論

BPD患兒肺部發育障礙，常伴一系列呼吸系統、心血管系統及神經系統并發癥，導致認知障礙、行為學習障礙等，影響患兒生命健康與生活水平[4]。目前BPD治療以藥物為主，而藥物治療以減輕癥狀為主且僅限于適度活性物質[5]。因此從發病機制角度探尋新治療方案對提升患兒預后有重要意義。

BPD病因尚不完全明確，有研究報道，出生體重<1 500 g的早產兒BPD發病率達40%[6]。此外高濃度氧、輸液量過多、機械正壓通氣損傷等均可引發BPD[7]。此外有研究發現，自噬及凋亡在BPD發生、發展過程中扮演重要角色[8]。自噬是一種適應性的細胞反應，廣泛存在于哺乳動物呼吸、神經、心血管等系統中，能夠清除老化細胞器，更新細胞器，降解長周期蛋白和異常積聚蛋白，維持細胞內環境穩定，并在組織增殖分化、蛋白質代謝等生理過程中發揮重要作用[9-10]。自噬過度活化會對細胞產生損害，導致細胞凋亡[11]。有研究顯示，自噬相關凋亡水平異常與脊髓損傷、血液系統惡性腫瘤、顱內出血等疾病有關[12]。AT-Ⅱ細胞是BPD肺上皮損傷的關鍵靶細胞，AT-Ⅱ細胞凋亡被認為是BPD肺泡發育不良的關鍵環節[13]。因此維持自噬及凋亡在一定生理范圍內對于保障機體健康尤為重要。本研究結果顯示，干預組小鼠肺組織病理改變較模型組明顯改善，ATⅡ細胞胞漿中自噬體及凋亡小體數量較模型組明顯減少，提示自噬可能參與了BPD發生發展過程。其因可能是自噬過度活化引起毒性異常蛋白聚集，誘發炎癥反應，損傷線粒體，從而導致細胞大量凋亡，引發BPD。LC3B、P62為自噬相關蛋白[14]，LC3B是自噬體膜上的標志蛋白，被廣泛應用于檢測哺乳動物中自噬活性和自噬體形成。P62是自噬降解的底物，也是連接LC3B與待降解泛素化底物的橋梁，p62表達增加往往提示自噬體與溶酶體結合或被溶酶體降解存在障礙。Bax、caspase-3為凋亡相關蛋白[15]，Bax是極重要的促細胞凋亡基因之一，其編碼產物可與凋亡抑制基因B淋巴細胞瘤2(B lymphocytoma-2，Bcl-2)表達產物結合而替換Bcl-2/Bax二聚體中的Bax，而達到促進細胞凋亡的目的。Caspase-3是細胞凋亡過程中的關鍵執行子，在細胞裂解及凋亡小體形成過程中發揮重要作用。本研究通過Western Blot分析發現，模型組小鼠肺組織中LC3B、P62、Bax、caspase-3水平顯著低于對照組，干預組小鼠肺組織中LC3B、P62、Bax、caspase-3水平顯著高于模型組，提示自噬體及凋亡小體增多可導致新生小鼠BPD，自噬抑制可減少ATⅡ細胞凋亡，這可為BPD新治療手段奠定實驗基礎。

綜上所述，新生小鼠ATⅡ細胞自噬過度活化后自噬體增多，促進ATⅡ細胞大量凋亡，凋亡小體增加，從而導致BPD不良發生，這可為BPD預防和治療提供理論支持。但仍需大樣本體內體外實驗進一步證實。