促炎因子在低齡化膿性腦膜炎患兒病情嚴(yán)重程度及預(yù)后中的應(yīng)用價(jià)值

李 靜，楊贊章，閆曉靜，張 娜，張艷玲

(1.河北省邢臺(tái)市人民醫(yī)院兒三科，河北 邢臺(tái) 054001；2.河北省眼科醫(yī)院藥劑科，河北 邢臺(tái) 054001)

化膿性腦膜炎(purulent meningitis,PM)是一種嚴(yán)重的顱內(nèi)感染性疾病。盡管目前在PM的診斷和治療方面已取得較大的進(jìn)展，但仍有較高的病死率及致殘率。因此，早期診斷、早期準(zhǔn)確評(píng)估病情輕重對(duì)預(yù)后顯得尤為重要。目前臨床對(duì)PM患兒病情嚴(yán)重程度的判斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查和格拉斯哥昏迷評(píng)分等，尚缺乏客觀可量化的評(píng)價(jià)指標(biāo)。尤其對(duì)于低齡患兒，其癥狀不典型、病情變化快、精神意識(shí)狀態(tài)難判斷，給臨床醫(yī)師評(píng)估病情嚴(yán)重性帶來極大困難。CNS感染致病菌后，致病菌可刺激腦組織產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子在患兒的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。目前已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)中某些細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(interleukin,IL)6、腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)等，對(duì)PM的早期診斷[1-4]及病情嚴(yán)重程度的評(píng)估[5-7]具有重要價(jià)值，但這些研究主要針對(duì)成年患者或大齡患兒，目前尚缺乏專門針對(duì)低齡患兒的研究。本研究通過測(cè)定2歲以下低齡PM患兒CSF及血清中TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β的濃度，探討其在PM患兒早期診斷、病情判斷和遠(yuǎn)期預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選擇2016年1月—2017年12月在邢臺(tái)市人民醫(yī)院兒三科住院的2歲以下PM患兒25例為試驗(yàn)組，其中男性16例，女性9例，月齡中位數(shù)2.4個(gè)月，四分位數(shù)間距5.2個(gè)月，發(fā)病季節(jié)集中在6～8月的有17例(68.0%)，腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果陽(yáng)性3例(肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌和糞腸球菌各1例)。所有PM患兒均有不同程度的發(fā)熱、精神差，其中2例伴有頭痛，7例伴有嘔吐，3例前囟隆起，8例驚厥，6例昏迷，8例伴有硬膜下積液。另選取疑診為PM、腦脊液常規(guī)檢查無異常，最終排除顱內(nèi)感染疾病的患兒18例為對(duì)照組，其中男性12例，女性6例，月齡中位數(shù)3.8個(gè)月，四分位數(shù)間距5.9個(gè)月，熱性驚厥9例、肺炎3例、支氣管炎4例、心包炎2例。2組一般資料差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。參照Kepa等[5]劃分重癥腦炎的方法，依據(jù)患兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)功能障礙的程度將試驗(yàn)組分為重癥組(有意識(shí)障礙、昏迷、驚厥者)8例和普通組(無驚厥和昏迷)17例。

參照《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》中診斷PM的標(biāo)準(zhǔn)納入患兒，排除合并顱內(nèi)腫瘤、顱內(nèi)出血、血液病、先天性腦發(fā)育異常、免疫系統(tǒng)疾病、除PM以外的感染性腦膜炎及腰穿前應(yīng)用抗菌藥物超過2 d的患兒。所有患兒家長(zhǎng)均知情同意且簽署知情同意書，此研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2標(biāo)本收集與細(xì)胞因子檢測(cè) 患兒在入院12 h內(nèi)采集靜脈血2 mL，通過腰椎穿刺采集腦脊液2 mL。標(biāo)本在300 g下離心10 min，存放于-80 ℃冰箱中備用。采用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法測(cè)定血清和CSF中TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β的濃度(ELISA試劑盒均購(gòu)自北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司)。

1.3臨床隨訪和預(yù)后評(píng)估 隨訪6個(gè)月，觀察患兒預(yù)后情況。按照兒童格拉斯哥結(jié)局評(píng)分(Children Glasgow Outcome Scale，CGOS)評(píng)定患兒預(yù)后[8]。將患兒根據(jù)評(píng)定結(jié)果分為：預(yù)后良好組(CGOS評(píng)級(jí)5級(jí)，恢復(fù)良好)，預(yù)后輕度不良組(CGOS評(píng)級(jí)4級(jí)，輕度殘疾)和預(yù)后不良組(CGOS評(píng)級(jí)1～3級(jí)，包括日常生活無法自理、重癥殘疾和死亡)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 6.0和SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料非正態(tài)分布時(shí)比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。采用受試者工作特征(receiveroperating characteristic,ROC)曲線評(píng)估各促炎因子對(duì)PM的診斷價(jià)值，以及判斷患兒病情嚴(yán)重程度的效能。P<0.05為有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.13組促炎因子的檢出情況 檢測(cè)標(biāo)本中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的定量限分別為6.0、0.8、5.0和10.0 ng/L。3組腦脊液TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和血清TNF-α、IL-1β、IL-6差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 3組促炎因子的檢出情況比較

2.2促炎因子對(duì)PM的診斷價(jià)值 CSF和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8對(duì)PM的診斷效能各不相同。在各促炎因子ROC曲線中，以CSF IL-6和CSF IL-8的AUC最大。當(dāng)CSF IL-6截?cái)嘀等?6.70 ng/L時(shí)，約登指數(shù)最大，為0.689，此時(shí)敏感度和特異度分別為80.0%和88.9%；當(dāng)CSF IL-8截?cái)嘀等?19.05 ng/L時(shí)，約登指數(shù)最大，為0.713，此時(shí)敏感度和特異度分別為88.0%和83.3%，提示CSF IL-6和CSF IL-8對(duì)小兒PM具有較高的診斷價(jià)值。見表2。

表2 各促炎因子不同水平閾值診斷PM的ROC曲線參數(shù)

2.3促炎因子水平與PM患兒病情輕重程度的關(guān)系 普通PM組和重癥PM組CSF中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平均較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。重癥PM組CSF中的4種促炎因子水平均顯著高于普通PM組(P<0.01)，普通PM組促炎因子水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，提示PM病情嚴(yán)重程度與CSF中促炎因子水平有一定相關(guān)性。見表3。

表3 3組腦脊液促炎因子水平比較

表4 3組血清促炎因子水平比較

2.4促炎因子對(duì)PM病情輕重區(qū)分的效能 在所有區(qū)分重癥PM與普通PM的ROC曲線中，CSF中TNF-α的AUC最大。當(dāng)CSF TNF-α截?cái)嘀禐?0.4 ng/L時(shí)，約登指數(shù)最大，為0.941，此時(shí)區(qū)分普通PM與重癥PM的敏感度為100%、特異度為94.1%。見圖1，表5。

2.5CSF和血清中4種促炎因子對(duì)PM預(yù)后的評(píng)估價(jià)值 患兒出院6個(gè)月后，共有23例PM患兒完成隨訪，預(yù)后良好組15例，預(yù)后輕度不良組5例，預(yù)后不良組3例。因患兒血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度低于定量限的標(biāo)本數(shù)量較多，故未對(duì)這3個(gè)檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)另外5個(gè)檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，預(yù)后輕度不良組腦脊液IL-6水平明顯高于預(yù)后良好組，預(yù)后不良組腦脊液IL-6水平高于預(yù)后良好組和預(yù)后輕度不良組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

圖1 CSF和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8區(qū)分PM病情輕重的ROC曲線

表5 各促炎因子評(píng)估PM病情輕重的ROC曲線參數(shù)

表6 不同預(yù)后PM患兒的各項(xiàng)指標(biāo)比較

3 討 論

低齡PM患兒的臨床表現(xiàn)趨于不典型，本研究中，PM患兒年齡小(中位年齡2.4個(gè)月)，頭痛、腦膜刺激征、前囟隆起等臨床表現(xiàn)發(fā)生率僅為8%～12%。腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)作為診斷PM的金標(biāo)準(zhǔn)[9]，其培養(yǎng)陽(yáng)性率太低(本研究?jī)H12%)。早期診斷和判斷病情是合理治療、改善預(yù)后的關(guān)鍵，因此有必要尋找能早期診斷PM和評(píng)估病情的可靠標(biāo)志物。多項(xiàng)研究表明，CSF中TNF-α、IL-6、IL-8等促炎因子對(duì)PM具有較高的診斷價(jià)值[1-4,10-13]。Srinivasan等[1]分析了608名嬰兒CSF中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10和IL-12診斷PM的效能，認(rèn)為IL-6和IL-10在診斷PM方面具更高的準(zhǔn)確性。Dano等[2]觀測(cè)65例15歲以下PM患兒CSF中IL-6的水平，發(fā)現(xiàn)PM組水平顯著高于對(duì)照組，其診斷腦膜炎的ROC曲線AUC達(dá)0.94，對(duì)診斷PM具有良好的效能。本研究結(jié)果顯示，PM組CSF中TNF-α、IL-8、IL-1β、IL-6的水平均顯著高于對(duì)照組的水平；CSF中IL-6和IL-8獨(dú)立診斷PM的ROC曲線下面積均大于0.90，兩者在最佳截?cái)嘀禃r(shí)的敏感度和特異度均在80%以上，說明CSF IL-6和CSF IL-8對(duì)PM均具有較高的診斷效能，這與一項(xiàng)Meta分析研究報(bào)道結(jié)果基本相符[3]。

病原菌入侵CNS后，刺激免疫細(xì)胞向感染灶浸潤(rùn)聚集，活化的巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1、IL-6等細(xì)胞因子。TNF-α是重要的早期促炎細(xì)胞因子，在CNS感染中發(fā)揮先導(dǎo)作用，可進(jìn)一步誘導(dǎo)IL-6、IL-8、IL-1β等促炎因子的合成和釋放[14]，增強(qiáng)炎癥細(xì)胞的黏附作用，提高血腦屏障通透性[15]。IL-6是一種促炎細(xì)胞因子，能激活基質(zhì)蛋白金屬酶，破壞血腦屏障[16]，還可刺激細(xì)胞產(chǎn)生活性氧等毒性物質(zhì)。IL-8對(duì)中性粒細(xì)胞具有趨化性，能促進(jìn)局部炎癥。一般來說，促炎因子水平越高，表明炎癥反應(yīng)程度越重，炎癥對(duì)組織的損傷越大。有研究表明PM患者CSF TNF-α水平與血腦屏障損傷程度和病情嚴(yán)重程度具有顯著相關(guān)性[6-7]。Kepa等[5]比較了輕度、中度及重度成年P(guān)M患者的CSF IL-6水平，結(jié)果顯示CSF IL-6水平與成年P(guān)M患者病情嚴(yán)重程度具有相關(guān)性，可用于評(píng)估患者病情的嚴(yán)重程度。與上述文獻(xiàn)結(jié)果基本一致，本研究結(jié)果顯示，PM組患兒CSF中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平均較對(duì)照組明顯升高，且重癥PM組促炎因子水平顯著高于普通PM組，普通PM組顯著高于對(duì)照組水平，提示CSF中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等促炎因子水平與PM病情嚴(yán)重程度密切關(guān)系。區(qū)分PM病情輕重的ROC分析顯示，CSF中TNF-α的AUC最大(0.956)，IL-6次之(0.904)，IL-8(0.897)和IL-1β(0.890)再次之，而血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的AUC均不足0.70，說明血清樣品中的促炎因子判斷PM病情輕重的效能均不及腦脊液樣品，CSF TNF-α和CSF IL-6可作為判斷低齡PM患兒病情嚴(yán)重性的敏感指標(biāo)。

值得說明的是，對(duì)照組和PM組患兒CSF和血清中TNF-α的檢出率均較低，對(duì)照組CSF和血清中檢出率分別僅有11.1%和5.6%，PM組分別為68%和24%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，肺炎鏈球菌性腦膜炎大鼠感染細(xì)菌6 h時(shí)CSF中TNF-α水平開始升高，但在24 h后多數(shù)CSF標(biāo)本已檢測(cè)不到TNF-α[17]。PM患者接受抗菌藥物治療24 h后就不易檢測(cè)出CSF中TNF-α[6]。而IL-1β、IL-6、IL-8等促炎因子的半衰期較長(zhǎng)[18]，動(dòng)物感染96 h后這些炎癥因子仍有較高濃度[17,19]。可見CSF細(xì)胞因子的水平與發(fā)病時(shí)間有密切關(guān)系。由于本研究不可能準(zhǔn)確獲知每例患兒患病的確切時(shí)間，但納入本研究的均是出現(xiàn)癥狀之后48 h以內(nèi)的患兒。部分患兒采集標(biāo)本時(shí)已經(jīng)錯(cuò)過了TNF-α的高峰期，這可能是入組患兒TNF-α檢出率低的原因。雖然TNF-α的檢出率不高，但TNF-α的檢出結(jié)果顯示，重癥PM組患兒CSF中TNF-α的水平顯著高于普通PM組(P<0.001)，說明CSF中高水平的TNF-α往往預(yù)示著患兒PM病情嚴(yán)重。

Takahashi等[4]和Vzquez等[19]觀察PM成年患者CSF中IL-6水平與預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果顯示CSF中IL-6水平越高，近期預(yù)后越差。Kepa等[5]研究證實(shí)，在輕、中、重癥PM成年患者CSF中，IL-6水平與蛛網(wǎng)膜下腔的炎癥反應(yīng)強(qiáng)度及腦損傷預(yù)后密切相關(guān)，CSF中高水平的IL-6意味著腦損傷嚴(yán)重、臨床結(jié)局惡化。與上述研究結(jié)果一致，本研究顯示，預(yù)后輕度不良組腦脊液IL-6水平明顯高于預(yù)后良好組，預(yù)后不良組腦脊液IL-6水平顯著高于預(yù)后輕度不良組，表明PM患兒腦脊液中IL-6水平越高，患兒的遠(yuǎn)期預(yù)后就越差。IL-6是中性粒細(xì)胞向CNS遷移的強(qiáng)效誘導(dǎo)劑，一方面可激活中性粒細(xì)胞胞內(nèi)酶，增強(qiáng)對(duì)病原體的殺傷力，另一方面也可對(duì)組織造成炎性損傷。但本研究與上述文獻(xiàn)研究的樣本量均較小，且未對(duì)危險(xiǎn)因素進(jìn)行分層，得出的結(jié)論可能存在偏倚。因此尚需開展大樣本的研究，以確認(rèn)IL-6等炎性因子預(yù)測(cè)PM預(yù)后的準(zhǔn)確性。

綜上所述，低齡PM患兒CNS內(nèi)產(chǎn)生大量促炎因子，腦脊液中IL-6和IL-8可作為早期診斷PM的輔助指標(biāo)。腦脊液中促炎因子水平越高，預(yù)示著病情越嚴(yán)重，其中，TNF-α和IL-6對(duì)判斷PM患兒病情輕重具有更高的敏感度和特異度，本研究所得的TNF-α和IL-6判斷病情輕重的最佳截?cái)嘀悼蔀獒t(yī)師判斷病情輕重提供參考。另外，CSF中IL-6水平可能有助于評(píng)估PM遠(yuǎn)期預(yù)后，但其確切價(jià)值尚需進(jìn)一步開展大樣本的臨床研究以證實(shí)。