天然酵母中烘焙酵母的分離鑒定與性能優化

相雯研，張娟*，堵國成，李少壘，顧芷瑋

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 3(福建安麥高新生物技術有限公司，福建 泉州，362200)

烘焙食品是一種方便快捷的食物，成為滿足快節奏生活的食物選擇之一[1]，含有豐富的營養物質[2-3]，依據烘焙市場規模預測，2020年我國烘焙食品行業銷售額可達5 500億元，發展空間巨大[4]。烘焙食品在制作過程中需要使用發酵劑，是為面團提供醒發力的起酵物[5]，決定了烘焙產品的品質[6-8]。目前市場上主要的發酵劑為即發活性干酵母，天然酵母占比較少。為延長使用即發活性干酵母制作的烘焙產品的保質期、改善其口感、外觀，大量食品添加劑加入其中，隨之帶來潛在的食品安全問題[9]。與即發活性干酵母相比，天然酵母來源天然，改善烘焙食品的感官與接受度，可提升烘焙產品品質[10-11]。

天然酵母中主要微生物為酵母菌和乳酸菌[3, 8]，乳酸菌在不同天然酵母中微生物組成存在很大差異[12-14]，其中常見的菌株有植物乳桿菌[6]、干酪乳桿菌[15]等，這些乳酸菌除了能夠為烘焙食品帶來優良風味外[5, 15]，還可以有效延長儲存期[5, 11]、增強質構特性[6]、營養吸收能力[7]；酵母菌以能夠產生大量CO2而成為主要提供發酵力的菌種[16]，此外酵母菌對流變特性和風味組成也有重要作用[11]。然而現階段天然酵母在使用時需以天然發酵物作為發酵劑如酸面團、水果發酵液等[17-19]，存在平均醒發時間長的問題[20-21]，為天然酵母的應用帶來了阻礙。

本研究針對目前天然酵母成本高、發酵活力低、醒發時間長的問題，以發酵食品作為菌株來源，經篩選、烘焙性能測定，篩選獲得了1株醒發、風味、組織結構、貯藏性能較好的酵母菌，將獲得的酵母菌進行烘焙性能強化，獲得了1株快速醒發的烘焙酵母，經發酵條件優化及過程放大培養條件優化最終獲得了一種高活菌數烘焙酵母的生產方式，為高性能天然酵母在烘焙行業的應用奠定了較好的基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，YPD)培養基(g/L)：蛋白胨20, 葡萄糖20，酵母浸粉10；

YPD固體培養基：在YPD培養基礎上添加20 g/L瓊脂粉；

菌體篩選培養基(g/L)：蛋白胨5，葡萄糖10 KH2PO41，MgSO4·7H2O0.5，孟加拉紅0.03，氯霉素0.1；

高葡萄糖培養基(g/L)：葡萄糖，蛋白胨20, 酵母浸粉10；

高鹽培養基(g/L)：NaCl，葡萄糖，蛋白胨20, 酵母浸粉10。

1.1.2 儀器與設備

電子天平，Mettler-Toledo公司；恒溫培養箱，上海醫療器械研究所；Qpix420微生物篩選系統，美谷分子公司；多孔板搖床，Heidolph公司；酶標儀，Biotek 公司； PTC-200型聚合酶鏈式反應(polymerrase chain reaction，PCR)儀，Bio-Rad公司；攪拌機、醒發箱、電烤箱，無錫新麥機械有限公司；顯微鏡，Nikon公司；pH 計，梅特勒公司；CF16RX冷凍立式離心機，Hitachi公司；15 L發酵罐，迪必爾公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集

收集樣本，隨機取樣采集樣本，裝入50 mL無菌管中，儲存于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 菌種的分離篩選

取樣品適量加入YPD培養基中，在30 ℃、220 r/min 條件下培養24 h后稀釋100倍于 YPD 固體培養基涂布，30 ℃培養48 h，使用微生物篩選系統Qpix420將YPD固體培養基上單菌落轉接于裝有YPD培養基的96深孔板中，培養24 h，同等條件轉接培養1次，選取OD600>0.5的菌液進行劃線純化培養。經3～5次劃線培養獲得單一菌株，觀察菌落、菌體形態[22]。將菌株以10% 接種量接種至裝有杜氏管的YPD培養基中，30 ℃培養4 h觀察產氣情況[23-24]。

1.2.3 菌種烘焙性能分析

從YPD固體培養基上挑取菌落接種至1 mL YPD培養基中，以10% 接種量、 30 ℃下培養12 h進行逐級放大培養，最終獲得菌液500 mL，6 000 r/min離心7 min收集菌體。按照表1方式進行甜面包及軟歐包制作。

表1 面包制作配方表 單位：g

選取醒發時間、組織形態、氣味、口感、貯藏性能5方面作為評定指標，按照表2的指標進行評定，每個試驗重復3次，平行測定2次取平均值，評定最終得分以均值來記[25]。

1.2.4 菌種鑒定

取甘油保藏的酵母菌LBBE-1 10 μL于PCR管中，微波爐高火加熱5 min制成PCR擴增反應模板進行擴增，其中使用的酵母菌ITS擴增通用引物如表3所示。測序后使用BLAST將測定的ITS序列與GeneBank中酵母菌系列進行比對，構建系統發育進化樹。

表2 面包的感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria for bread

表3 酵母菌 ITS通用引物序列Table 3 Yeast ITS common primer sequence

1.2.5 菌種烘焙性能強化

首先對菌株LBBE-1進行耐糖馴化，將種子液接種于100 g/L葡萄糖的高糖培養基24深孔板中，在30 ℃、220 r/min培養24 h，測定OD600值，選取菌濃較大的3株菌取平均值記為馴化1 d菌濃，并接種至24孔板中；重復上述操作，待測定菌濃達到與YPD培養基中培養具有同等水平時提升葡萄糖濃度至更高水平(以100 g/L為步階)，直至在300 g/L葡萄糖的高糖培養基中能夠正常生長。再將獲得在300 g/L葡萄糖中正常生長的3株菌接種至含有10 g/L NaCl的高鹽培養基24深孔板中，在30 ℃、220 r/min培養 24 h，測定OD600值，選取菌濃較大的3株菌取平均值記為馴化1 d 菌濃，并接種至24孔板中；重復上述操作，待測定菌濃達到與YPD培養基中培養具有同等水平時提升NaCl濃度至更高水平(以5 g/L為步階)，直至在含有20 g/L NaCl的高鹽培養基中能夠正常生長。按照烘焙性能測定同等方式進行馴化菌株烘焙效果。

1.2.6 菌種培養條件優化及放大培養

為滿足工業生產應用，將菌株進行發酵優化及放大培養。將甘油管中的菌液接種至YPD培養基中，30 ℃培養24 h以獲得種子液。搖瓶水平分別進行最適生長接種量、pH、溫度、葡萄糖濃度、氮源測定，并測定菌株的生長曲線[26]。以優化配方作為種子培養基和發酵罐培養基在15 L發酵罐上進行控制條件優化。

2 結果與分析

2.1 菌種的分離與篩選

以天然葡萄發酵液、開菲爾粒、紅茶菌(北京、廣州、哈爾濱)為樣本進行菌體富集培養，經微生物篩選系統Qpix420篩選獲得1 651株菌，以0.1 g/L氯霉素作為去除細菌干擾、獲得酵母菌的篩選條件，最終獲得12株酵母菌，其菌落形態如表4、圖1所示，產氣速率以杜氏管產生氣體體積差異作為評分標準，進行觀察測定。

圖1 篩選和馴化菌株的形態特征圖Fig.1 Comparison of morphological characteristics of screened and domesticated strains

2.2 菌種烘焙性能分析

由表4可知，LBBE-1和LBBE-2酵母菌具有較高的產氣能力，為進一步比較菌種對面包烘焙性能的影響，將2菌株進行了烘焙性能分析，以某商業酵母作為對照樣本進行感官品評。如圖2所示，與商業酵母相比，LBBE-1在組織形態、氣味、口感和貯藏性能分別較商業酵母提升1.8%、7.7%、7.4%和7.9%，LBBE-2在組織形態、氣味和口感分別較商業酵母提升1.8%、13.5%和9.3%，但醒發時間酵母菌LBBE-1長于商業酵母30.7%，酵母菌LBBE-2的醒發時間過長，長于商業酵母的49.3%，貯藏性能也較低，為商業酵母的10.5%，因此選擇LBBE-1進行后續試驗。

a-甜面包感官評價;b-軟歐包感官評價圖2 面包的感官評價Fig.2 Bread sensory evaluation

表4 篩選和馴化菌株的形態特征及產氣量的比較Table 4 Comparison of morphological characteristics and gas production of screened and domesticated strains

2.3 菌種鑒定

對酵母菌LBBE-1基因組DNA通過ITS通用引物進行PCR擴增，并對產物進行測序，測序結果與Genbank中酵母菌的18S rDNA序列進行比對，結果顯示LBBE-1為釀酒酵母。通過NCBI中的BLAST將菌株LBBE-1測定結果進行同源性比對，與S.cerevisiaeYJM1478具有最高的同源性，為98.32%，系統發育樹如圖3所示。

2.4 菌種高糖、高鹽耐受性分析

由于在甜面包制作過程中，LBBE-1醒發時間略長，而在軟歐包制作過程中醒發快，將2個配方進行對比發現，甜面包制作過程中使用的大量糖、鹽可能導致菌體生長受限，因此首先對LBBE-1的耐糖、耐鹽性能進行測定。由圖4-a得出，在300 g/L葡萄糖的高糖培養基中，LBBE-1適應期延長；由圖4-b可知，在含有10 g/L NaCl的高鹽培養基中菌濃為不含 NaCl的0.4倍，在20 g/L NaCl中菌濃為不含NaCl的0.25倍，在300 g/L葡萄糖、20 g/L NaCl的高糖、高鹽培養基中生長趨勢不明顯。可推斷篩選菌株LBBE-1由于在高糖、高鹽環境中無法正常生長而導致產氣能力弱，因此可對菌株LBBE-1進行馴化以獲得滿足甜面包制作的菌株。

a-耐糖性能測定;b-耐鹽性能測定圖4 酵母菌LBBE-1耐受性能測定Fig.4 Tolerance of yeast LBBE-1

2.5 菌種耐受性馴化分析及效果測定

首先對LBBE-1進行了耐糖馴化，經6 d馴化獲得在含有100 g/L葡萄糖高糖培養基中OD600=6.2的3株菌，接種至含有200 g/L葡萄糖高糖培養基中7 d后獲得OD600=6.3的3株菌，接種至含有300 g/L葡萄糖高糖培養基中7 d后獲得OD600=6.3的3株菌，獲得耐高糖酵母，由圖5-a可知 OD600提升至原始菌株2.2倍。將耐高糖菌株進行高鹽耐受性馴化，由圖5-b可知耐高糖酵母11 d后可在含有10 g/L NaCl高鹽培養基中正常生長、 23 d后可在含有15 g/L NaCl高鹽培養基中正常生長、 34 d后可在含有20 g/L NaCl高糖、高鹽培養基中正常生長，最終獲得在含有300 g/L葡萄糖、20 g/L NaCl高鹽培養基中可以穩定生長的酵母，OD600=6.1，提升至原菌株的8.5倍。對馴化菌株進行保藏，命名為S.cerevisiaeLEEB-1，保藏編號為GDMCC No.60 989。

a-耐糖馴化;b-耐鹽馴化圖5 酵母菌LBBE-1耐受性馴化Fig.5 Tolerant domestication of LBBE-1

為進一步驗證耐受性效果，以某商業酵母為對照進行感官評定，由圖2可知，馴化株已具有與商業酵母同等發酵力，此外甜面包制作組織形態、氣味、口感和貯藏性能較商業酵母高出3.5%、7.7%、7.4%和5.3%，與馴化前相比醒發時長提升44.2%、組織形態提升1.7%，但貯藏性能下降了2.4%，表現為面包芯失水；與商業酵母相比軟歐包制作中馴化株在醒發時間、組織形態、氣味、口感和貯藏性能分別高出8.7%、5.6%、9.6%、5.4%和5.1%，較馴化前醒發時間提升1.4%、組織形態提升3.6%、口感及貯藏性能無差異，但氣味降低了3.4%，表現為老面風味部分減弱。

2.6 菌種培養條件優化

培養條件優化包括最適生長接種量、pH、溫度、碳源和氮源的優化，其中，碳源的選擇受到菌株馴化條件的影響，最終選擇葡萄糖作為碳源進行濃度優化，而氮源則依據食品生產成本及對菌株風味等的影響，選擇玉米漿和酵母浸粉作為復合氮源。

2.6.1 最適生長溫度

將種子液以10% 接種量接種至YPD培養基中，分別在28、30、32、34、36 ℃下培養24 h，由圖6-a可知當溫度為30 ℃時，酵母菌菌濃最大，OD600=16.4。

2.6.2 最適生長pH

將種子液以10% 接種量分別接種至pH值為6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4的YPD培養基中，30 ℃培養24 h，結果如圖6-b所示,當pH為6.8時酵母菌生長有最大菌濃，OD600=17.0，較未優化提升至1.04 倍。

2.6.3 最適生長接種量

將種子液分別以1%、4%、7%、10% 、13% 接種量接種至pH值為6.8的YPD培養基中，30 ℃培養24 h，如圖6-c所示，4%接種量下酵母菌生長最好，OD600=18.6，較未優化提升至1.09倍。

2.6.4 最適生長葡萄糖濃度

將種子液以4%接種量分別接種至pH值為6.8，葡萄糖質量濃度分別為10、 25、 40、 55、 70 g/L的YPD培養基中，30 ℃培養24 h，如圖6-d所示，葡萄糖質量濃度為55、70 g/L的OD600值無明顯變化，為節約工業生產成本選擇55 g/L為最佳培養條件，OD600=22.5，較未優化提升至1.21倍。

2.6.5 最適氮源

氮源為質量濃度分別為15、 25、 35、 45、 55 g/L的玉米漿、質量比5∶1和10∶1的玉米漿∶酵母浸粉，將種子液以4% 接種量接種至pH值為6.8、葡萄糖55 g/L 的培養基中，30 ℃培養24 h測定菌濃，如圖6-e所示，玉米漿和酵母浸粉作為混合氮源使用且比例為5∶1時，酵母菌生長較好，當質量濃度為25 g/L時獲得最大菌濃，OD600=30.5，較未優化提升至1.4倍。

2.6.6 生長曲線測定

在最佳培養條件下，每2 h測定1次菌濃。生長曲線圖6-f，S.cerevisiaeLBBE-1生長20 h達到穩定，OD600=30.2，較未優化提升至1.8倍。

a-溫度對酵母菌生長的影響;b-pH對酵母菌生長的影響;c-接種比例對酵母菌生長的影響;d-葡萄糖對酵母菌生長的影響;e-氮源對酵母菌生長的影響;f-酵母菌生長曲線圖6 不同培養條件對酵母菌S.cerevisiae LBBE-1生長的影響Fig.6 Effects of different culture conditions on the growth of S.cerevisiae LBBE-1

2.7 菌種放大培養條件優化

15 L發酵罐以60%裝液量、以1∶1通氣比、220 r/min 轉速進行恒溫培養，將優化后的發酵培養基初始葡萄糖質量濃度提升至 221.6 g/L，測定發酵過程中葡萄糖變化情況，如圖7-a所示，耗糖速率0～2 h、2～4 h、4～7 h、8～12 h、12～16 h、16～20 h分別為1.6、 4、 5.3、 13.9、 17.2、 10.8 g/(L·h)，于20 h獲得最大菌濃，OD600=58。

由圖7-b可知，當對發酵體系的溫度及pH進行控制時，菌濃OD600=68.7，在此基礎上進行溶氧關聯調控時，菌濃達74.5，以4.5 g/(L·h)進行恒速流加時，菌濃為83.4，以圖7-a中糖耗進行擬合流加，由于前期試驗中發現，在對數生長期之后補料會導致葡萄糖被利用于呼吸代謝而非生長，因此選擇葡萄糖補加策略為0～2 h-5 g/(L·h)、2～4 h-10 g/(L·h)、4～8 h-15 g/(L·h)，酵母菌生長獲得最大菌濃，OD600=92.9，將發酵液進行稀釋，取10 μL點加至YPD固體培養基上，取3次測定的平均值，最終測定活菌數為6.3×109CFU/mL。

a-耗糖曲線;b-不同控制策略圖7 不同調控方式對酵母菌S.cerevisiae LBBE-1生長的影響Fig.7 Different control on S.cerevisiae LBBE-1 fermentation

3 結論

為了解決天然酵母在使用過程中存在的醒發時間長及生產應用的問題，本研究以天然葡萄發酵液為樣本篩選獲得了一種能夠提升烘焙品質的天然酵母中的烘焙酵母LBBE-1，經耐受性馴化，菌種在300 g/L葡萄糖條件下菌濃提升至原始菌種的2.2倍， 300 g/L葡萄糖、20 g/L NaCl條件下菌濃提升至8.5倍。經烘焙效果驗證發現其已具有與商業酵母同等的醒發能力，且在組織結構、氣味、口感、貯存性能評分更高。為了進一步達到工業生產條件，對其進行了發酵優化，發現以4%的接種量接種至55 g/L葡萄糖、21 g/L玉米漿、4 g/L酵母浸粉、pH 6.8的培養基中，30 ℃、溶氧轉速偶聯(220～600 r/min)、葡萄糖擬合流加培養22 h可獲得最大菌濃OD600值為92.9，活菌數為6.3×109CFU/mL。上述研究為天然酵母的高效篩選、性能強化及在烘焙行業的應用奠定了一定基礎。