唾液乳桿菌的抗氧脅迫能力及有氧發酵條件

周麗君，楊苗苗，魏春艷，潘長沛，黃時海

(廣西大學 生命科學與技術學院，廣西壯族自治區 南寧，530000)

益生菌是人和動物體腸道內的正常菌群，可用來開發功能性食品。功能性食品是新興領域，可促進健康，為消費者提供多種食品選擇[1]。乳酸桿菌作為動物體內重要的益生菌，可調節腸道菌群平衡，增強機體的免疫力和抵抗力[2]。在乳酸桿菌屬中，唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)和發酵乳桿菌是人類唾液中最常見的2種菌[3-4]。唾液乳桿菌具有極大的黏附咽黏膜的潛力[5]，且具有抗部分腸道或陰道乳酸桿菌和根除無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae，GBS)的效果,可用于新型乳基益生菌發酵食品[6-7]。其他唾液乳桿菌菌株都已被證明在動物模型[8]和人體臨床試驗[9]中均有良好的耐受性和安全性，包括孕婦在內[10-12]。唾液乳桿菌作為一種具有極大潛力的益生性乳桿菌已成為近年研究的熱點，正被廣泛用于制成適用于人和動物的益生菌制劑[13-16]。目前由唾液乳桿菌制備的相關益生菌制劑已在市場上銷售[17]。隨著對唾液乳桿菌的深入研究，將會有更多的適用于人和動物的微生態制劑問世。

高抗氧化型乳酸菌能提高植物抗氧化活性和植物化學濃度[18]，幫助清除人體內自由基，提高細胞抗氧化能力，增強免疫力[19]。乳酸菌被認為是兼性厭氧型細菌，抗氧脅迫機制尚不完善。在O2存在的情況下，菌株自身代謝過程中產生的活性氧族，嚴重危害菌株的生長和生存。因此降低活性氧族的傷害，是提高乳酸菌生物量和菌體存活的有效手段之一[20]。可從2個方面入手，一方面是向培養基中直接添加過氧化氫酶。由于乳酸菌生長是不斷酸化的過程，處于細胞外的過氧化氫酶可能由于pH值不斷降低導致其活性也不斷降低。另一方面，對部分菌株而言，在培養過程中加入特定物質以激活呼吸鏈，表達內源過氧化氫酶[21-22]，從而達到促進菌體生長，并減弱活性氧族的威脅，提高細胞的存活力等目的[23]。

一條有功能的呼吸鏈，至少具備獲取電子及H+的脫氫酶類，負責傳遞電子的醌類物質和將電子及H+交給分子氧的細胞色素氧化酶這3個部分[20]。在有氧培養過程中，隨著血紅素(heme)或血紅素與四烯甲萘醌(VK2)獲得及O2的參與，呼吸鏈將被激活，乳酸乳球菌、植物乳桿菌等具備有氧呼吸潛力的菌株可以由發酵作用進入有氧呼吸階段。通過研究基因信息對比證實唾液乳桿菌呼吸鏈組成，在外源添加血紅素的情況下，乳酸菌的細胞色素氧化酶能被激活，使菌株能夠進行有氧呼吸[21]。值得注意的是，雖然唾液乳桿菌具備了多數有氧呼吸所需要的基因，但是沒有報道、實驗中也沒有發現該菌具有有氧呼吸的潛力。另一方面在有氧培養過程中乳酸菌會產生大量的H2O2，高濃度的H2O2并不能通過有氧呼吸進行降解，唾液乳桿菌具有血紅素依賴的過氧化氫酶基因[20]，因此可以探究內源過氧化氫酶和外源過氧化氫酶對唾液乳桿菌的作用。

傳統的乳酸菌發酵多為無氧或靜置培養，菌株生長過程中較少接觸到分子氧，受到的氧脅迫作用較為有限；但現代化工廠進行發酵產品的生產、儲存及銷售過程，則往往難以避免O2的接觸，氧脅迫對菌株生存生長造成的不利影響更為明顯[20]。本實驗就唾液乳桿菌抗氧脅迫、有氧生長進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

唾液乳桿菌GDW1994(Lactobacillussalivarius)由廣西大學生命科學與技術學院自主分離、篩選和保藏。

MRS 肉湯: 蛋白胨 10 g/L，牛肉浸汁 10 g/L，酵母浸汁 10 g/L，葡萄糖 5 g/L，吐溫-80 1 mL/L， 番茄汁 200 g/L；pH 6.2， 115 ℃高壓蒸汽滅菌 30 min。

MRS瓊脂培養基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸汁10 g/L，酵母浸汁10 g/L，葡萄糖5 g/L，吐溫-80 1 mL/L，番茄汁200 g/L，瓊脂15 g/L；pH 6.2，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

30%(體積分數)H2O2、四烯甲萘醌(VK2)、血紅素(heme)、過氧化氫酶(catalase)、Marker DNA，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

MQD-S3R恒溫振蕩培養箱,上海旻泉儀器有限公司；NanoDrop one微量紫外-可見光分光光度計,Thermo Fisher；LRH-250A生化培養箱,韶關市泰宏醫療器械有限公司；biometra tone基因擴增儀,德國耶拿分析儀器股份公司；SW-CJ-1F潔凈工作臺,蘇州凈化設備有限公司；Czone 8菌落計數儀,杭州訊數科技有限公司；Toledo 320 pH計,METTLER TOLEDO。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化與保藏

MRS肉湯為篩選培養基，37 ℃、200 r/min 搖床培養。稀釋涂布，培養至出現明顯單菌落，挑選形態飽滿單菌落至MRS液體培養基中，進行多次劃線傳代培養后，挑選形態特征與《伯杰氏細菌鑒定手冊》[22]對乳酸菌描述(圓形、表面光滑、乳白色等)相一致的菌落進行革蘭氏染色，生理生化鑒定及16S rDNA 測序鑒定。將篩選的菌株接種于MRS肉湯中，37 ℃ 恒溫培養12 h，并傳至3代備用。將純化后的菌種富集培養，再與30%(體積分數)甘油以體積比1∶1混合至-80 ℃冰箱中保藏[22]。

1.3.2 菌種鑒定

采用《乳酸細菌現代研究實驗技術》[23]中所述方法對菌株進行生理生化鑒定。將篩選出抗氧化性強的乳酸菌進行16S rDNA 序列分析。采用《乳酸細菌現代研究實驗技術》[23]中所述方法提取基因組DNA。設計細菌的16S rDNA 序列引物。正向引物：TGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG；反向引物：TACGGCTACCTTGTTA-CGAC。聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)反應體系和反應程序如表1和表2所示[24]。

表1 PCR反應體系 單位：μL

表2 PCR反應程序Table 2 PCR response procedure

將PCR產物測序結果與GenBank中已知16S rDNA序列進行同源性比較，用MEGA 5.0 軟件構建系統發育樹。

1.3.3 乳酸菌活菌數的測定

發酵液中的活菌數按GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 乳酸菌檢驗》[25]中的方法測定，并轉化為對數值進行統計分析。

1.3.4 生長曲線的測定

將分離純化后的唾液乳桿菌接種至MRS液體培養基中過夜培養，取活化后的菌液以接種量為1%接種至50 mL的MRS培養基中，置于37 ℃恒溫培養箱中，每隔3 h取1次樣，使用紫外分光光度計測生物量[3]。然后以培養時間為橫坐標，生物量為縱坐標，繪制唾液乳桿菌生長曲線。

1.3.5 有氧培養對生物活性的影響

將菌株按1%接種量在MRS培養基中分別進行有氧條件、無氧條件培養，每隔7 h后取1 mL菌液稀釋相應的3個梯度，涂布平板，每個梯度3個平行，將平板放入37 ℃恒溫培養箱中培養2 d，使用細胞計數儀記錄細胞數。

1.3.6 菌株GDW1994對酸的耐受性測定

將菌株在MRS培養基中有氧培養15 h，取1 mL菌液使用高速冷凍離心機8 000 r/min 4 ℃離心10 min收集菌體，使用蒸餾水洗滌3次，分別用 pH值為2、3、4、5、6的新鮮MRS培養基重懸菌體，37 ℃靜止保溫1 h后，稀釋平板涂布，同時統計1 mL未經酸處理的菌液中活菌數,處理后的活菌數與未處理的活菌數之比為細胞存活率。

1.3.7 菌株GDW1994對H2O2的耐受性測定

將菌株按1%接種量接種于 MRS 液體培養基中，有氧培養15 h，取1 mL菌液使用高速冷凍離心機8 000 r/min，4 ℃離心10 min收集菌體，使用蒸餾水洗滌3次，分別用濃度為2、3、4、5、6 mmol/L H2O2的新鮮MRS培養基重懸菌體，37 ℃靜止保溫1 h后，稀釋平板涂布，同時統計1 mL未經H2O2處理的菌液中活菌數。處理后的活菌數與未處理的活菌數之比為細胞存活率。

1.3.8 菌株GDW1994內源有氧呼吸

菌株GDW1994接入優化的MRS液體培養基中，培養基中分別加入VK2、heme、VK2+ heme，進行有氧培養12 h，測活菌數。

1.3.9 外源及內源過氧化氫酶對菌株的影響

將菌株GDW1994接入MRS液體培養基中，分別加入VK2和血紅素，為實驗組，加入30 g/L過氧化氫酶，在相同培養條件下培養為對照組。進行有氧培養12 h，每隔3 h取樣，測生物量。實驗組和對照組均在 160 r/min、 37 ℃ 搖床中培養12 h，放入4 ℃冰箱中保存，每隔2 d測1次活菌數。

1.3.10 培養基的優化

以MRS為基礎培養基，37 ℃靜置培養12 h后，以生物活性為考察目標[26]。葡萄糖為碳源，蛋白胨、酵母粉和牛肉膏為混合碳源，利用L9(43)正交試驗設計9種增殖培養基，將唾液乳桿菌過夜培養后，以1%接種量分別接種于上述增殖培養基中，37 ℃恒溫培養12 h 后，將所有三角瓶放入冰箱中終止培養，進行活菌數檢測[27]。L9(43)正交試驗設計如表3所示。

表3 MRS基礎培養基碳氮源正交優化 單位：g/L

無機鹽為CH3COONa、MgSO4·7H2O和MnSO4·H2O，在確認最適宜碳源、氮源質量濃度后，正交試驗設計9種增殖培養基，如表4所示。唾液乳桿菌經MRS培養基過夜活化后，以1%接種量分別接種于上述增殖培養基，37 ℃恒溫培養12 h，放入冰箱終止培養，進行活菌數檢測。

表4 MRS無機鹽正交優化 單位：g/L

1.3.11 培養條件優化

在培養基配方優化完成的基礎上，以接種量1%(體積分數)，過氧化氫酶20 g/L，起始pH 6.0，轉速180 r/min，溫度分別為30、34、47、40、44 ℃下培養12 h。全部放置冰箱中終止培養，進行稀釋涂布活菌計數。

在培養基配方優化完成的基礎上，將培養基調至初始pH值分別為5.5、6.0、6.2、6.4、6.9，接種量1%，過氧化氫酶20 g/L，轉速180 r/min，溫度37 ℃的搖床中培養12 h后，全部移至冰箱終止培養，進行活菌數檢測。

在培養配方優化完成的基礎上，起始pH值為6.4，過氧化氫酶20 g/L，接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%，放置轉速180 r/min，溫度37 ℃的搖床中培養12 h后，全部移至冰箱中終止培養，進行活菌數檢測。

在培養基配方優化完成的基礎上，接種量為4%，起始pH值為6.4，過氧化氫酶20 g/L轉速分別為 140、 160、 180、 200、 220 r/min，溫度37 ℃搖床中培養12 h后，全部移至冰箱終止培養，進行活菌數檢測。

在培養基配方優化完成的基礎上，接種量為4%，起始pH值為6.4，過氧化氫酶分別為0、10、20、30、40 g/L，放置轉速160 r/min，溫度37 ℃的搖床中培養12 h后，全部移至冰箱終止培養，進行活菌數檢測[26]。

1.4 數據分析

所得數據均為平行測定3次以上取平均值，并計算出正負標準偏差，用誤差線表示。使用Stat-graphics Centurion XVI程序通過簡單和多變量的方差分析以及95%的置信水平評估，在所獲得的結果上考慮不同變量的統計顯著性程度。

2 結果與分析

2.1 菌種鑒定

GDW1994菌株在MRS培養基上稀釋涂布培養后，生長良好，MRS瓊脂上菌落大小為0.6～1.5 mm，圓形、呈乳白色、邊緣整齊、表面光滑并凸起。革蘭氏染色結果為陽性，生理生化鑒定如表5所示，根據《伯杰氏菌種鑒定手冊》[22]對比，可以初步鑒定所分離的菌株為乳桿菌屬。

表5 菌株GDW1994的生理生化鑒定表Table 5 Physiological and biochemical identification form of GDW 1994

菌株GDW1994擴增后得到1 500 bp左右的DNA序列如圖1所示。將結果在NCBI 數據庫中比對并構建系統發育樹如圖2所示。由系統發育樹可確定為唾液乳桿菌。菌株GBE17 與Lactobacillussalivariusstrain(JQ837457.1)，GBE29與L.salivariusstrain (CP029616.1)有最接近的親緣關系，相似度達到96%。

1-Marker；2-菌株GDW1994圖1 菌株GDW1994 PCR電泳圖Fig.1 GDW1994 PCR electrophoresis of strain

圖2 菌株GDW1994的系統發育樹Fig.2 Systemic tree of strain GDW1994

2.2 唾液乳桿菌生長曲線

由圖3可知，菌株GDW1994在經過3 h的延滯期后，即開始快速生長，6 h后進入對數生長期，在此期間菌體生長繁殖速度較快，pH值隨代謝產物乳酸及其他有機酸的累積而下降較快。在培養了約15 h以后，菌體進入平穩期，菌體密度基本維持不變。

圖3 菌株GDW1994的生長曲線Fig.3 Growth curve of GDW1994

2.3 有氧培養對菌株GDW1994的影響

2.3.1 有氧培養對生物活性的影響

如圖4所示，在無氧培養條件下，唾液乳桿菌培養14 h后，活菌數達到最高為1.45×109CFU/mL，此后隨著時間的增加，活菌數開始迅速下降，當培養49 h后，活菌數開始呈數量級下降，說明無氧培養會使唾液乳桿菌到達穩定并死亡；而有氧培養的發酵乳桿菌細胞活力比較穩定，在49 h內活菌數一直穩定在8×108CFU/mL左右。說明有氧培養對唾液乳桿菌的生物活性和保存時間具有積極作用。另一方面，有氧培養的最高菌密度比無氧培養低，從提高唾液乳桿菌的抗氧脅迫能力和優化有氧培養條件對達到高密度且不易死亡來說具有一定意義。

圖4 有氧培養對菌株GDW1994的影響Fig.4 Effect of strain GDW1994 on aerobic culture

2.3.2 有氧條件下對酸的耐受性測定

唾液乳桿菌應用于實際生產中，必須要有耐酸能力。由圖5可知，有氧條件下，菌株在pH值為3時，存活率可達80%左右，當pH值為2時菌株存活率降至17%左右。說明pH對唾液乳桿菌活性有一定影響，可以推斷唾液乳桿菌在發酵過程中產生的有機酸使培養基中pH值降低，從而造成菌株迅速死亡。在有氧條件下，菌株培養24 h后培養基終pH值為4.5左右；無氧條件下，菌株培養24 h后培養基終pH值為3.7左右，由此也可說明有氧培養更有利于菌株培養與保藏。

圖5 pH對菌株GDW1994的影響Fig.5 Effect of pH on strain GDW1994

2.3.3 H2O2的耐受性測定

有氧培養過程中，菌株沒有產過氧化氫酶的能力，導致培養基中H2O2的積累，從而對菌株產生毒性作用。由圖6可知，當H2O2的濃度為2 mmol/L時，菌株GDW1994的存活率約為81%；隨著H2O2濃度的增加，菌株存活率開始下降；當H2O2濃度為6 mmol/L時，菌株存活率僅為32%，說明H2O2對菌株活性影響較大。

圖6 H2O2對菌株GDW1994的影響Fig.6 Effect of H2O2 on strain GDW1994

2.4 菌株GDW1994內源有氧呼吸結果

菌株若要進行有氧呼吸，必須具備執行該功能的所有組分，既必須要有一條可以發揮功能的呼吸鏈。由圖7可知，菌株GDW1994不具備完整的醌類物質合成能力，其呼吸鏈的激活需要同時外加heme和VK2，從而內源產生過氧化氫酶。最高活菌數可達 3×109CFU/mL。

圖7 內源過氧化氫酶對菌株GDW1994的作用Fig.7 Effect of endogenous catalase on GDW1994

2.5 外源及內源過氧化氫酶對菌株GDW1994的影響

由圖8可知，有氧呼吸對菌株GDW1994帶來顯著變化是發生在指數后期、穩定期。加入過氧化氫酶或VK2和heme，生物量明顯增高，細胞生長周期延長。由于細胞外環境復雜多變，外源過氧化氫酶的酶活性不斷降低，菌株GDW1994的活性必然會受到影響。菌株GDW1994具有內源性的過氧化氫酶，由圖9可知，隨著heme與VK2的獲得及O2的參與，菌株GDW1994在4 ℃冰箱中保存可長達30 d，活菌數為108CFU/mL。存活率是沒有加heme和VK2和O2參與的100倍，是外源過氧化氫酶的20倍。由于胞內環境相對溫和發揮作用更加長久且直接，相對于外源過氧化氫酶，能使菌株更為強壯且存活時間更加持久。在工業生產中，需要高密度發酵菌株，菌株的生物量和生物活性為指標，選擇內源過氧化氫酶更有價值。

圖8 外源及內源過氧化氫酶對菌株生物量的影響Fig.8 Effect of exogenous and endogenous catalase on the biomass of strain

圖9 外源及內源過氧化氫酶對菌株保存時間的作用Fig.9 Effect of exogenous and endogenous catalase on the preservation time of strain

2.6 培養基配方及條件優化

2.6.1 培養基配方優化

設計正交試驗表，對培養基中碳、氮源和無機鹽成分進行優化，以活菌數為判斷指標，結果如表6和表7所示。碳氮源4號配方和無機鹽3號配方為最佳配方。優化后的基礎培養基配方為蛋白胨10 g/L、酵母膏2.5 g/L、葡萄糖20 g/L、牛肉膏15 g/L、CH3COONa 2 g/L、MgSO40.6 g/L、MnSO4·H2O 0.2 g/L。優化前最高活菌數為3.13×108CFU/mL，優化后最高活菌數為1.37×109CFU/mL，活菌數提高約 4.4倍。

表6 唾液乳桿菌GDW1994培養基碳氮源L9(43)正交試驗結果Table 6 Orthogonal test results of GDW1994 culture medium carbon nitrogen source L9(43)

表7 唾液乳桿菌GDW1994培養基無機鹽L9(43)正交試驗結果Table 7 Orthogonal results of GDW1994 culture medium inorganic salt L9(43)

2.6.2 培養基條件優化

由圖10可知，隨著發酵溫度的上升，活菌數呈先增加后下降的趨勢，菌株GDW1994最適溫度為37 ℃，最高活菌數為1.142×109CFU/mL。起始最適pH值為6.4，最高活菌數為1.175×109CFU/mL。隨接種量的增高菌株活菌數增高，接種量為5%時，活菌數增加幅度最大，最高活菌數為2.0×109CFU/mL，考慮到過高的接種量對發酵體系物質消耗的因素以及菌體自溶帶來的影響，選擇接種量為4%為最適接種量。通過搖瓶培養，增加通氧量，隨著轉速的增加，氧對細胞的毒性增加，轉速為160 r/min時，細胞活菌數最高。隨著過氧化氫酶濃度的增高，菌株GDW1994活菌數依次增加，當過氧化氫酶質量濃度為30 g/L時，活菌數最高，可達2.07×109CFU/mL,選擇過氧化氫酶質量濃度30 g/L。通過單因素試驗得到最適培養溫度30 ℃、接種量4%、起始pH 6.4、最佳轉速160 r/min及最適過氧化氫酶質量濃度30 g/L。培養條件優化后活菌數提高約1.5倍。

a-發酵溫度；b-發酵起始pH值；c-接種量；d-發酵轉速；e-過氧化氫酶圖10 培養基條件對活菌數的影響Fig.10 Effect of medium conditions on the number of viable bacteria注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

自然條件下，乳酸菌大多生長在無氧或微氧環境中，但現代化發酵工業生產中，乳酸菌常常需要進行有氧增殖。影響乳酸菌生長的主要兩大決定因素分別是低酸度環境和活性氧族的毒性。本研究分離的菌株對酸和抗氧脅迫有較好的耐受性。菌株GDW1994在無氧培養過程中產生的有機酸不利于菌株活力的長期保持；在有氧培養過程中，菌株積累大量H2O2雖然降低了菌株活菌數，但提高了菌株存活時間。改變其傳統發酵培養方式，通入氧氣和外加酶解的辦法清除、分解已生成的活性氧族，探究呼吸鏈的完整性，提高抗氧脅迫能力，從而降低對細胞的傷害。通過對菌株GDW1994內源有氧呼吸的研究，菌株GDW1994不具備完整的對醌類物質合成能力，其呼吸鏈的激活需要同時外加heme和VK2，最高活菌數可達3×109CFU/mL。對普通的MRS培養基進行優化，使唾液乳桿菌菌株GDW1994活菌數提高4.4倍。優化出唾液乳桿菌GDW1994最佳工藝參數為發酵時間15 h、發酵溫度37 ℃、發酵起始pH值6.4、接種量4%、轉速160 r/min、過氧化氫酶質量濃度30 g/L，在此條件下發酵液中唾液乳桿菌活菌數可達2.07×109CFU/mL，在培養基優化后的基礎上唾液乳桿菌菌株活菌數再提高約1.5倍。通過改變發酵方式，菌株GDW1994細胞生長周期延長，菌體存活性延長。對酸脅迫和氧脅迫等不良環境的抗性能力大幅度提升。活菌數明顯提高，最終收獲的菌體總量顯著增多。從生產角度考慮，為使發酵劑菌株更為強壯，獲得存活性長、菌體數目高的發酵工藝為最終目的。特殊風味產量更大往往是人們所追求的目標，乳酸菌的有氧呼吸有著十分廣闊的應用前景。