適合奶醋發酵的酵母菌發酵動力學

姚妞妞，常春暉，于宏偉，郭潤芳

(河北農業大學 食品科技學院，河北 保定，071000)

牛乳的主要營養成分為乳脂肪、乳蛋白、乳糖等，其中乳脂肪是主要的能量物質，乳蛋白包含人體必需的8種氨基酸，乳糖能維持牛奶甜度，促進營養物質吸收[1]。利用牛乳為原料的乳飲品種類較多，如酸乳飲料，它分為發酵型和配制型，前者營養成分高、風味好[2]。發酵型奶醋作為一種新型飲品，國內外對它的研究較少，據產品介紹恒順發酵型奶醋是利用了酵母菌、乳酸菌和醋酸菌經過二次發酵制備而成，它既包含乳酸菌飲料的營養又包含醋飲料的保健功能。我國對于奶醋飲料的研究報道較多的是配制型奶醋的制備及功能，如李敏等[3]利用脫脂奶粉和鎮江白醋等為主要原料制作配制型奶醋飲料；再如管嫻月等[4]探究富硒輪梗霉與奶醋對小鼠降血脂和抗氧化作用的影響。但對于發酵型奶醋，僅發現我國恒順發酵型奶醋走高端市場的報道[5]，尚未有關于菌株及工藝相關研究的報道。

奶醋發酵與果醋發酵機理相同，涉及2個階段的微生物代謝過程，一是酵母菌利用糖在厭氧條件下發酵生成酒精，二是醋酸桿菌在有氧條件下將酒精氧化成醋。因此，優良發酵菌株的選擇是制備發酵型奶醋的關鍵。據報道，乙醇是醋酸發酵的底物，并為醋酸菌的生長代謝提供能量，當乙醇體積分數超過4%時，醋酸菌的生長會受到抑制[6]。乙醇體積分數超過10%時，抑制醋酸菌生長，鈍化其氧化酒精的能力，引起乙醛積累[7]，故選擇酒精體積分數不超過10%的酵母菌株，有利于維持奶醋發酵工藝的穩定性。研究乙醇發酵動力學的目的在于通過發酵動力學的研究來進行最佳發酵工藝條件的控制[8]，因此酵母發酵動力學對奶醋的開發有重要的指導意義。

發酵動力學是將發酵過程中與菌體繁殖、基質消耗、產物生成等參數進行定量分析，研究他們之間的動態定量關系，更準確地對參數進行預測，這對發酵過程有重要的指導意義[9]。引入數學模型整理實際發酵過程中得到的大量數據，并以簡潔的形式進行表達，可以更好地控制發酵過程，并可利用小試驗獲得數據設計大規模的發酵工藝過程[10-11]。常用Logistic方程[12]表達菌體生長動力學；酵母菌體生長與酒精生成屬于部分偶聯關系，一般用Leudeking-Piret方程[13]表達酒精生成動力學；底物消耗用于菌體生長和代謝生成產物的消耗，一般用Leudeking-Piret方程表達底物消耗動力學。非線性擬合方法[14]是發酵動力學模型較為經典的算法之一，本研究將采用非線性擬合方法，建立發酵動力學方程，這將有利于準確的掌握以牛乳為原料的酵母發酵規律，了解發酵過程的各項指標[15]，對下一步發酵奶醋有重要指導意義。

1 材料與方法

1.1 菌株

Saccharomycescerevisiae4-2，S.cerevisiae4-3，S.cerevisiae6-1，S.cerevisiae6-2，河北農業大學酶工程實驗室保藏；安琪干酵母、安琪果酒酵母，安琪酵母股份有限公司。

1.2 試驗試劑

蔗糖，上海麥克林生化科技有限公司；三氯乙酸，上海阿拉丁生化科技有限公司；苯酚，上海麥潤爾化學技術有限公司；純牛奶，內蒙古伊利實業集團股份有限公司。

1.3 儀器與設備

Synergy HTX型酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；TDZ5-WS型高速冷凍離心機，長沙湘銳離心機有限公司；ZHWY-2102C型搖床，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.4 菌株發酵條件

分別挑取斜面保存的2株酵母菌，接種于YPD液體培養基中，30 ℃培養12 h進行活化，然后按照不同的接菌量接種于YPD液體培養基中，并分別于不同溫度條件下培養，用平板計數法計算活菌數，以活菌數為衡量指標，確定了最適接菌量為2%，最適發酵溫度為30 ℃。

分別挑取S.cerevisiae4-2和安琪干酵母斜面保存的菌種，接種于YPD液體培養基中，30 ℃培養12 h活化后，分別吸取發酵液體積2%的活化后的2株酵母菌，接種于添加蔗糖質量濃度分別為0、50、100、150 g/L的純牛奶中，密閉培養，搖床轉速200 r/min，每間隔8 h取1次發酵樣品進行測定。

1.5 測定方法

1.5.1 感官評價

參考文獻[3]中對配制型奶醋的感官要求，制定出感官評分標準。選定8名相關專業人員作為評定員(從事于食品工程、食品營養與分析、食品質量與安全專業)。發酵24 h后，分別取一定量的各組樣品進行感官評定。所評定的感官指標為色澤、口感、組織狀態和風味，如表1所示。

表1 酵母菌感官評分標準Tab.1 Yeast sensory scoring criteria

1.5.2 總糖標準曲線的測定

硫酸苯酚法[16]測可溶性總糖含量。取0.5 mL發酵液，加入1 mL 20%(體積分數)的三氯乙酸對發酵液中的各類蛋白進行沉淀，再離心取上清液對其進行稀釋。取1 mL的稀釋液，加入500 μL 9%(體積分數)的苯酚溶液，搖勻，再加入2.5 mL的濃H2SO4。比色液總體積為4 mL，在室溫下放置30 min，顯色。在485 nm處測得吸光值。

硫酸苯酚法測定不同濃度梯度的糖含量的變化與OD值之間的關系，得出標準曲線方程為y=0.013 2x+0.032 7，相關系數R2=0.999 6，線性相關性良好，可以直接從標準曲線上求得樣品糖的濃度。

1.5.3 酵母發酵時菌落數的測定

純牛奶經發酵后測其活菌數，發酵至相應的時間時，將發酵液進行10倍梯度稀釋選取適宜的濃度后吸取1 mL，采用傾注法使其于溫度適宜的固體YPD培養基混勻，于30 ℃恒溫培養箱培養24 h后進行菌落計數[17]。

1.5.4 底物殘糖的測定

方法同總糖標準曲線的測定方法，采用硫酸苯酚法。

1.5.5 酒精度的測定

參考GB/T 23546—2009中對酒精測定的方法[18]，并稍加改進。取10 mL試樣與10 mL蒸餾水于蒸餾瓶中，加熱蒸餾，餾出液體積約9.5 mL時停止蒸餾，于水浴冷卻至20 ℃時，測定溫度和酒精度，并換算單位20 ℃時的酒精度。

1.6 數據分析

2 結果與分析

2.1 發酵菌株的篩選

各菌株發酵牛乳后的感官評價結果如表2所示。

表2 感官分析分值與產乙醇量Table 2 Sensory analysis scores and ethanol production

由表2可知，S.cerevisiae4-2和安琪干酵母的感官評分最高，分別為93.5分和95.5分，故選取S.cerevisiae4-2和安琪干酵母作為本試驗研究的菌株。

2.2 酵母菌發酵過程中的物質變化

使用不同初始蔗糖質量濃度(0、50、100、150 g/L)的純牛奶發酵，在對應的時間點測定酵母菌發酵過程中的物質變化。

2.2.1 發酵過程中菌體生長變化

菌體生長變化結果如圖1所示。在發酵過程中，2株酵母菌的菌體生長整體趨勢均先增高后趨于平穩，且在發酵24 h達到最大值。質量濃度為50 g/L以上的蔗糖在穩定期菌量差異不顯著，均穩定在108CFU/mL。

a-S. cerevisiae 4-2;b-安琪干酵母圖1 不同蔗糖添加量的牛奶中菌體生長變化Fig.1 Changes of bacterial growth in milk with different sucrose additions

2.2.2 底物蔗糖的消耗

底物糖的變化結果如圖2所示。在發酵過程中，2株酵母菌的底物糖的消耗均整體逐漸降低。

a-S. cerevisiae 4-2;b-安琪干酵母圖2 不同蔗糖添加量的牛奶中底物蔗糖含量的變化Fig.2 Changes of sucrose content in the substrate of milk with different sucrose additions

2.2.3 產物酒精的生成

由圖6可見，建立的雷公藤一致性模型可準確地驗證被測藥材是否為雷公藤，包括雷公藤的地方習用品昆明山海棠（驗證集D）也能夠以較高的最大CI值（大部分最大CI值＞30.0）與雷公藤作出區分。

產物酒精含量的變化結果如圖3所示。在發酵過程中，2株酵母菌產物酒精的含量總體均呈上升趨勢，先緩慢增長再快速增長，最后趨于平穩。

a-S. cerevisiae 4-2;b-安琪干酵母圖3 不同蔗糖添加量的牛奶中產物酒精含量的變化Fig.3 Changes of alcohol content in milk with different sucrose additions

2.3 發酵動力學模型的建立

2.3.1 菌體生長動力學模型

描述菌體生長最常用的是Monod模型，它是基于3個假設建立的。一是菌體生長為均衡型，即菌體生長的唯一變量是菌體濃度；二是培養基中只有一種底物是限制性因素，其他營養成分不影響菌體生長；三是菌體的生長視為單一反應，細胞得率是常數。但Monod方程只適合細胞生長較慢、細胞密度較低且無抑制作用的環境下。這不適合應用于酵母乙醇發酵過程，較為普遍采用Logistic方程。在純牛奶酒精發酵過程中，采用平板計數的方法測定的酵母菌生長趨勢變化規律遵循典型的“S”型曲線[20]，因此可用Logistic方程描述菌體生長的變化規律，該方程能較好的反映發酵過程中由于菌體濃度的增加對其自身生長繁殖所產生的抑制效應[21-23]。該方程如公式(1)、公式(2)所示：

(1)

對公式(1)積分得：

(2)

式中：X0,初始菌體量；Xm,最大菌體量；μm,最大比生長速率。

用非線性曲線擬合的Logistic方程對2株酵母菌體生長的試驗數據進行擬合，圖4為酵母菌生長動力學曲線。酵母菌體動力學擬合的相關參數如表3所示。

a-S.cerevisiae 4-2;b-安琪干酵母圖4 不同初始蔗糖濃度的菌體生長實測值與擬合曲線Fig.4 Measured values and fitted curves of bacterial growth at different initial sucrose concentrations

如圖4所示，0～24 h時2株酵母菌菌體均快速增長，至進入穩定期酵母菌量都基本維持不變。由表3可知，擬合的R2>0.950，說明擬合度較好。

表3 S. cerevisiae 4-2和安琪干酵母酒精發酵酵母菌生長動力學參數Table 3 Growth kinetic parameters of S. cerevisiae 4-2 and Angel dry yeast alcohol fermentation yeast

2.3.2 底物蔗糖消耗動力學模型

底物蔗糖的消耗包括了用于菌體生長及產物代謝方面的消耗，包括了3個方面：一是用于菌體生長的消耗，以合成新酵母；二是酵母維持基本生命活動的消耗；三是用于產物生成的消耗。根據底物消耗物料衡算，可以得到底物消耗的動力學模型，一般用Leudeking-Piret模型表示[24]，如公式(3)、公式(4)所示：

(3)

對公式(3)積分得：

(4)

式中：Yx/s，菌體對底物的得率系數；ms酵母代謝的維持系數。

將菌體生長的Logistic方程公式(2)以及菌體生長的動力學相關參數分別代入公式(4)，即可求得底物消耗動力學模型擬合曲線。底物蔗糖消耗的擬合曲線如圖5所示。底物蔗糖消耗動力學擬合的相關參數如表4所示。

表4 S. cerevisiae 4-2和安琪干酵母發酵時底物蔗糖消耗的動力學參數Table 4 Kinetic parameters of substrate sucrose consumption during fermentation of S. cerevisiae 4-2 and Angel dry yeast

a-S. cerevisiae 4-2;b-安琪干酵母圖5 不同初始蔗糖濃度的底物蔗糖消耗的實測值與擬合曲線Fig.5 Measured values and fitting curves of substrate sucrose consumption at different initial sucrose concentrations

如圖5所示，2株酵母菌在發酵的56 h內，隨著時間的變化，底物蔗糖的濃度逐漸減小，56 h時達到最小值。由表4可知，擬合的R2>0.950，說明擬合度較好。

2.3.3 酒精生成動力學模型

在酒精發酵過程中，根據菌體生長與產物形成是否偶聯，分為3類：偶聯型、部分偶聯型和混合型。由于酵母的生長伴隨著酒精的生成，酒精的生成過程與酵母的生長關系被看作是生長偶聯型，最常用的模型Leudeking-Piret方程來描述酒精生成與酵母菌體數量的關系。方程如公式(5)、公式(6)所示：

(5)

式中：α為生長相關系數；β為非生長相關系數。

當公式(5)α≠0且β=0時為偶聯型；當公式(5)α=0且β≠0時為部分偶聯型；當公式(5)α≠0且β≠0時為混合型。

對公式(5)積分得：

(6)

將菌體生長的Logistic方程公式(2)以及菌體生長的動力學相關參數分別代入公式(6)，即可求得產物酒精生成動力學模型擬合曲線。圖6為產物酒精生成的擬合曲線。產物酒精生成動力學擬合的相關參數如表5所示。

a-S. cerevisiae 4-2;b-安琪干酵母圖6 S. cerevisiae 4-2和安琪干酵母酒精發酵產酒精動力學參數Fig.6 Kinetic parameters of alcohol production by S. cerevisiae 4-2 and Angel dry yeast

如圖6所示，0～24 h時，2株酵母菌的發酵產物酒精的含量總體均呈上升趨勢，先緩慢增長再快速增長，最后趨于平穩。由表5可知，擬合的R2>0.950，說明擬合度較好。

表5 S. cerevisiae 4-2和安琪干酵母發酵產物酒精生成的動力學參數Table 5 Kinetic parameters of alcohol production from fermentation products of S. cerevisiae 4-2 and Angel dry yeast

綜上，考慮到菌體生長、底物糖的消耗、酒精的生成情況，不同初始蔗糖質量的牛乳中，達到最大菌體量穩定期的時間基本相同，底物蔗糖的消耗基本一致；考慮生成的奶醋發酵的酒精量時，S.cerevisiae4-2的100 g/L初始蔗糖質量濃度和安琪干酵母的150 g/L初始蔗糖質量濃度較為合適。現數據經軟件處理，選用自定義參數擬合，經過非線性擬合后獲得各個發酵動力學參數，將其模型參數代入動力學模型中，得動力學模型方程，匯總如表6。

表6 發酵過程擬合方程及其相關系數Table 6 Fitting equation of fermentation process and its correlation coefficient

2.4 模型驗證

由表7可知，S.cerevisiae4-2和安琪干酵母3個模型的理論值和試驗值的誤差大部分<10%，S.cerevisiae4-2的3個模型理論值和試驗值的誤差的平均值分別為6.61%、8.12%、6.51%，安琪干酵母的3個模型理論值和試驗值的誤差的平均值分別為6.05%、7.37%、5.95%，說明模型擬合較好。

3 結論

本研究通過感官評價篩選出適合奶醋發酵的釀酒酵母(S.cerevisiae)4-2和安琪高活性干酵母，其發酵動力學表明S.cerevisiae4-2的100 g/L初始蔗糖質量濃度和安琪干酵母的150 g/L初始蔗糖質量濃度在不同的發酵時間內，產生乙醇的體積分數都在10%以下，符合奶醋發酵的要求。

表7 模型理論值和試驗值的比較Table 7 Comparison of theoretical values of the model and the laboratory

以蔗糖為底物的動力學模型，無論是菌體生長模型、底物消耗模型還是酒精生成模型，擬合度均較好，且2株酵母菌的3個模型的理論值和試驗值的誤差大部分<10%。因此，建立的理論模型可以較好的預測奶醋的發酵過程，從而進一步掌握酵母發酵牛乳過程中物質的動態變化規律，為最佳發酵工藝條件的控制提供理論基礎，對奶醋的制備有重要的指導意義。

另外，本研究也有需要改進的地方，例如，發酵初期并未完全做到無氧發酵，也并未考慮底物蔗糖的濃度對菌體生長的抑制作用等。所以，未來的動力學研究應盡可能完善無氧發酵條件，底物和產物的抑制作用等，這將對進一步掌握發酵過程發揮很大的作用。