活性炭法制備高F值櫛孔扇貝酶解液的工藝條件

劉海梅，王蕓，裴繼偉，欒鈞熙，趙芹，牛麗紅，張彩麗

1(魯東大學 食品工程學院，山東 煙臺，264000)2(煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺，264000)

高F值寡肽是將食物蛋白經蛋白酶降解獲得的由2～9個氨基酸殘基組成的F值[即支鏈氨基酸(branched-chain amino acid，BCAA：Val、Ile、Leu)和芳香族氨基酸(aromatic amino acid，AAA：Trp、Tyr、Phe)的摩爾數比值]>20的寡肽混合物[1-2]。此肽能滿足肝病患者對蛋白質組分的特殊營養需求，輔助治療肝性腦病，改善患者的肝功能，具有潛在的保肝、護肝作用[3-4]，以其為基料制備針對肝病患者的醫用全營養配方食品已經得到了國內外研究者的廣泛關注，尤其是美國、日本等發達國家已經形成相關產品，而我國尚處于研究階段。目前，制備高F值寡肽選用的原料主要以植物性蛋白和乳源性蛋白為主[5]，基于海洋動物中蛋白質含量高的特點，以水產原料制備高F值寡肽已經成為近幾年來研究的熱點[6-8]，受到食品和醫藥界日益高度的關注。中國是世界上最大的貝類生產國，年產量1 500萬t以上，占世界貝類生產總量的76%，其中櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)是我國貝類養殖的主要品種之一。如能以櫛孔扇貝開發純度高且穩定的高F值寡肽將極大地推動我國肝病患者全營養配方食品的研發與工業化進程。

制備高F值寡肽的關鍵技術是最大限度地脫除酶解液中的芳香族氨基酸。目前脫除芳香族氨基酸的方法主要有活性炭吸附法、膜分離法、離子交換法、凝膠過濾法等[9]，與其他方法相比，活性炭具有很高的吸附效率，對疏水性化合物的親和力極高，BCAA和 AAA 均是疏水性氨基酸，非極性苯環側鏈還與活性炭表面上的非極性吸附位相互作用。因此，當BCAA 和 AAA 同時存在時，活性炭會優先吸附AAA。而且活性炭吸附法操作簡單、價格低、被廣泛應用于高F值化[10]，是脫除芳香族氨基酸提高F值的有效方法[8,11-14]。活性炭對氨基酸的吸附效果受存在體系和氨基酸自身性質的影響，不同種類活性炭的吸附特性不同。不同研究對象選擇的活性炭種類也不同，在從近江牡蠣、南極磷蝦、帶魚等海洋資源中提取制備高F值寡肽時選用的活性炭種類不同，優化出的吸附條件也存在差異[8,12-13]。本課題組前期研究發現，櫛孔扇貝中蛋白質含量占干基的52.17%，且支鏈氨基酸含量達193.90 mg/g，顯著高于牡蠣、海灣扇貝、紫貽貝、菲律賓蛤仔，是開發高F值寡肽的優良海洋資源，但以櫛孔扇貝為原料來開發高F值寡肽的研究鮮見報道。綜上所述，本課題擬以去殼櫛孔扇貝為原料，通過酶解工藝制備酶解液，篩選適宜脫除櫛孔扇貝酶解液中芳香族氨基酸的活性炭種類，并優化活性炭脫除芳香族氨基酸制備高F值寡肽液的工藝條件，該研究將會大大提高櫛孔扇貝加工的附加值，能為肝病患者全營養配方食品的開發提供優質基料，也為櫛孔扇貝高F值寡肽的開發及海洋動物資源開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

櫛孔扇貝，煙臺漁紅利水產市場；胃蛋白酶(酶活力1.5萬U/g)，生工生物工程(上海)股份有限公司;風味蛋白酶(酶活力1.5萬U/g)，北京索萊寶科技有限公司；活性炭A(200目)，廣東舒野活性炭有限公司；活性炭B、活性炭C(200目)，河南海韻環保科技有限公司；活性炭D(200目)，天津市廣成化學試劑有限公司；活性炭E(200目)，平頂山市炭諾環保材料有限公司；0.45 μm、φ10 mm微孔濾膜，上海興亞凈化材料廠。其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1300紫外可見分光光度計，上海美析儀器有限公司；TDL-5-A離心機，上海安亭科學儀器廠；pB-10普及型pH計，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；L-8900高速氨基酸分析儀，日立(中國)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 高F值寡肽溶液制備工藝流程

工藝流程：

櫛孔扇貝全肉勻漿(料液質量比1∶5)→胃蛋白酶水解(酶活力1 200 U/g，溫度42 ℃，pH 3.0，反應時間9 h)→沸水浴滅酶15 min→風味蛋白酶水解(酶活力1 200 U/g，溫度50 ℃，pH值為7.0，反應時間10 h)→沸水浴滅酶15 min→6 000 r/min 離心10 min→上清液→活性炭脫芳處理→0.45 μm微孔濾膜抽濾→濾液→高F值寡肽溶液

1.3.2 不同因素對活性炭脫芳效果的影響

改變某一個因素參數，固定其余因素參數，研究固液比、溫度、時間和pH 4個因素對活性炭脫芳效果的影響。具體設計如下：調整固液比為1∶20(g∶g)，在pH值為7下吸附2 h，研究溫度為25、30、35、40、45、50 ℃時的效果；調整溫度為40 ℃，在pH值為7下吸附2 h，研究固液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35(g∶g)時的效果；調整固液比為1∶20(g∶g)、溫度為30 ℃，在pH值為7下，研究吸附時間為5、4、3、2、1、0.5 h時的效果；調整固液比1∶20(g∶g)，溫度30 ℃，吸附2 h，研究pH值為4、5、6、7、8、9時的效果。

1.3.3 芳香族氨基酸脫除效果的評價

基于支鏈氨基酸與芳香族氨基酸分別在220、280 nm處有最大特征吸收峰的特性，測定活性炭吸附前后酶解液在220、280 nm處的吸光值，計算兩者的比值OD220/OD280、支鏈氨基酸保留率、芳香族氨基酸去除率[11]來判斷芳香族氨基酸的脫除效果。其中支鏈氨基酸保留率及芳香族氨基酸去除率計算方法見公式(1)、公式(2):

支鏈氨基酸保留率/%

(1)

芳香族氨基酸去除率/%

(2)

1.3.4 氨基酸組成分析及F值的計算

樣液用6 mol/L HCl水解24 h，調配至上機濃度，流速0.4 mL/min，進樣量20 μL，檢測波長570、440 nm，用氨基酸自動分析儀檢測除色氨酸外的16種氨基酸的含量。色氨酸測定時，采用NaOH堿解處理樣液24 h，其余操作同其他16種氨基酸的測定方法。

按公式(3)計算寡肽液的F值：

(3)

式中：MVal、MIle、MTyr、MPhe、MLeu、MTrp分別代表1 mL中含有的氨基酸微摩爾數，μmol/mL。

1.3.5 數據處理

采用Excel、SAS 8.1軟件繪制曲線和方差分析，以Duncan檢驗法進行顯著性水平分析，P<0.05為顯著，P<0.01為極顯著。

2 結果與分析

2.1 活性炭種類的選擇

活性炭制作原料的不同、顆粒大小、比表面積、孔徑數目等都會引起吸附效果的不同[13,15]，顆粒狀的活性炭由于比表面積小，吸附容量小，吸附效果次于粉末狀的[13,16]活性炭。因此，本研究選用木質粉末狀200目活性炭作為吸附材料，對比不同活性炭的吸附效果。不同種類活性炭的吸附效果如圖1，經活性炭A和活性炭C吸附脫芳后寡肽液OD220/OD280值顯著高于其他3種活性炭(P<0.05)。經活性炭A與C處理后，寡肽液的芳香族氨基酸去除率基本一致，而活性炭A的支鏈氨基酸保留率顯著高于活性炭C(P<0.05)。高F值寡肽的制備需要在去除芳香族氨基酸的同時，盡量保留支鏈氨基酸。因此，選用活性炭A作為吸附劑。

a-OD220/OD280;b-支鏈氨基酸保留率和芳香氨基酸去除率(下同)圖1 不同活性炭的吸附效果Fig.1 Adsorption effect of different activated carbon注：不同小寫字母代表數據之間有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.2 不同因素對活性炭吸附效果的影響

2.2.1 溫度

不同溫度下活性炭A的吸附效果見圖2。隨著溫度的升高，OD220/OD280值先上升后下降；當30 ℃時OD220/OD280值最高為11.616，顯著高于其他溫度(P<0.05)，溫度繼續升高OD220/OD280值持續下降。30 ℃下芳香族氨基酸的去除率顯著高于其他溫度(P<0.05)，而40、45 ℃下支鏈氨基酸的保留率顯著高于30 ℃(P<0.05)，綜合OD220/OD280值、芳香族氨基酸去除率、支鏈氨基酸保留率3個指標，選擇30 ℃作為活性炭A的吸附溫度。

不同報道中活性炭的適宜脫芳溫度不同，蛋清蛋白、魷魚高F值寡肽制備中使用的溫度均為50 ℃[7,17]，牡蠣肉、南極磷蝦高F值寡肽制備中的溫度為25 ℃[8,12]，而金槍魚中使用35 ℃[14]。溫度的差異可能是由選用活性炭種類不同造成的，由于在相關報道中活性炭型號及規格信息不齊全無法進行比較。

圖2 溫度對吸附效果的影響Fig.2 The effect of temperature on adsorption effect

2.2.2 固液比

活性炭使用量關系到其在單位體積酶解液中的吸附量，因此固液比直接影響芳香族氨基酸的脫除效果。固液比對活性炭吸附效果的影響如圖3。固液比對脫除效果影響顯著，隨著固液比的減小，即活性炭用量的減少，OD220/OD280值和芳香族氨基酸去除率先顯著上升后顯著下降(P<0.05)，支鏈氨基酸保留率一直呈顯著下降趨勢(P<0.05)。這種變化趨勢與活性炭用量直接相關，活性炭用量越多，其吸附量越多，從而導致吸附的芳香族氨基酸量增加，但是當活性炭用量增加到一定程度后，吸附芳香族氨基酸的量達到飽和后，就會吸附更多的支鏈氨基酸，從而影響吸附效果。當固液比為1∶10時，OD220/OD280、芳香族氨基酸去除率和支鏈氨基酸保留率顯著高于其他固液比(P<0.05)，分別達到24.893%、98.257%和77.287%。固液比為1∶15時的吸附效果與固液比為1∶10的吸附效果有顯著性差異(P<0.05)，且比1∶10的吸附效果差。但在實際的操作中，1∶10的固液比導致活性炭使用量過多，造成抽濾困難，成本較高，所以選取固液比為1∶15。

圖3 固液比對吸附效果的影響Fig.3 Effect of solid to liquid ratio on adsorption effect

2.2.3 吸附時間

不同吸附時間對活性炭吸附效果的影響如圖4。吸附時間對活性炭吸附效果有顯著影響(P<0.05)，吸附時間過短或過長都不利于芳香族氨基酸的去除。此變化趨勢與報道一致[6,7,11-15]。吸附時間短，活性炭吸附芳香族氨基酸的結合位點未達到飽和，芳香族氨基酸吸附不完全，造成吸附效果不佳；而吸附時間過長時，活性炭吸附芳香族氨基酸達到飽和后會進一步吸附支鏈氨基酸，從而會造成吸附效果的下降。隨著吸附時間的延長，OD220/OD280值呈先增大后減小的變化趨勢，在吸附時間為2 h時 OD220/OD280值達到最大(10.603)，顯著高于其他吸附時間(P<0.05)。對于支鏈氨基酸保留率而言，吸附時間為2、4 h時保留率顯著高于其他時間(P<0.05)，且吸附2 h后，芳香族氨基酸去除率最高，顯著高于其他吸附時間(P<0.05)。由此可見，活性炭吸附2 h時，芳香族氨基酸與活性炭結合位點的結合達到飽和，使活性炭吸附芳香族氨基酸的反應達到平衡[11]，再延長活性炭吸附時間會增加活性炭對支鏈氨基酸吸附量，導致支鏈氨基酸的保留率降低。所以，最優的活性炭吸附時間為2 h。

圖4 吸附時間對吸附效果的影響Fig.4 Effect of adsorption time on adsorption effect

2.2.4 pH

pH的變化能顯著影響吸附效果，不同pH對活性炭吸附效果的影響如圖5。隨著pH的增加，OD220/OD280值顯著增加(P<0.05)，當pH值為7時，寡肽液的OD220/OD280達到了19.221，再增大pH值，OD220/OD280出現顯著下降(P<0.05)。pH值為7時，OD220/OD280、芳香族氨基酸去除率顯著高于其他pH值(P<0.05)，支鏈氨基酸的保留率在pH值為6時顯著高于其他pH值(P<0.05)。綜上分析，活性炭吸附pH值為7。

圖5 pH對吸附效果的影響Fig.5 Effect of pH on adsorption

不同類型的活性炭在吸附芳香族氨基酸時適宜的pH相差較大，有在酸性pH范圍的，如TX-325型粉末狀活性炭的最佳pH值為2.5[12]，XHJ-800型(50目)顆粒活性炭的pH值為3[7]， 也有在中性pH范圍的，如XHJ-200型(200目)粉末狀活性炭pH值為6[13]，與本研究結果較接近。若活性炭脫芳所需pH過低，調節酶解液的pH需要消耗大量的酸，在產品的后期生產中還要用大量的堿進行中和保證產品質量，避免對設備造成腐蝕，產生大量的食鹽，食鹽的產生對產品的脫鹽造成一定難度，因此，從節約成本和操作方便角度考慮，應選擇適宜pH接近中性的活性炭種類。

2.3 脫芳條件的正交優化及驗證

正交設計及優化結果如表1所示。根據極差分析，對OD220/OD280影響最大的因素為pH，其次為吸附時間與溫度，而固液比對其影響最小；對芳香族氨基酸去除率影響從大到小排序為pH>溫度>吸附時間>固液比。對OD220/OD280、支鏈氨基酸保留率、芳香族氨基酸去除率3個指標而言，其最優吸附條件均為吸附時間2 h、pH值6、溫度35 ℃、固液比為1∶15，且在該條件下的吸附效果顯著高于其他條件(P<0.05)。由此可見，上述條件即為活性炭A吸附脫芳的最優條件。

在上述優化條件下進行活性炭脫芳驗證試驗，脫芳后櫛孔扇貝酶解液的OD220/OD280值為23.928，芳香族氨基酸去除率為93.120%，支鏈氨基酸保留率為73.869%，均優于正交實驗中的因素組合，且F值>20，符合高F值寡肽的要求。

表1 正交優化結果Table 1 Orthogonal optimization result

2.4 高F值寡肽溶液的氨基酸組成分析

脫芳前后酶解液的氨基酸組成分析見表2。脫芳前酶解液的F值為3.91，脫芳后酶解液F值達到34.73，遠高于高F值寡肽F值>20的要求。經過活性炭吸附脫芳，成功制備了高F值寡肽，且F值提高了近9倍。

表2 氨基酸組成分析 單位：μmol/mL

3 結論

以櫛孔扇貝酶解液為原料，采用OD220/OD280值、支鏈氨基酸保留率和芳香族氨基酸去除率作為芳香族氨基酸脫除效果的3個指標，從4個廠家5種不同活性炭中篩選出適宜用于芳香族氨基酸脫除的活性炭種類為活性炭A，并探討了溫度、pH、吸附時間、固液比對該活性炭吸附芳香族氨基酸效果的影響，通過正交試驗優化了吸附條件。結果表明，廣東舒野活性炭有限公司生產的200目粉末活性炭吸附效果最好，最佳吸附條件為溫度35 ℃、pH值6、吸附時間2 h、固液比1∶15，吸附后酶解液F值達到34.73，支鏈氨基酸的保留率達到73.869%，芳香族氨基酸去除率達到93.120%。經過活性炭脫芳處理的寡肽液F值符合高F值寡肽中(F值>20)的要求。本研究采用活性炭法成功制備出了櫛孔扇貝高F值寡肽液，開拓了櫛孔扇貝開發利用的途徑，為高F值寡肽的制備提供了理論依據。