細葉小檗葉中總黃酮含量測定①

吳莉莉，白術杰，王書紅，張羽男

(佳木斯大學藥學院， 黑龍江 佳木斯 154007)

細葉小檗(Berberis poiretii Schneid)是小檗科小檗屬的植物。別名三顆針、針雀，分布于俄羅斯、朝鮮、蒙古以及中國大陸的黑龍江、吉林、山西等地，生長于海拔600～2,300米的地區，目前尚未由人工引種栽培。根、根皮中含有多種生物堿，主要為小檗堿，功效是清熱燥濕、瀉火解毒、健胃。用治療吐瀉、痢疾、咳嗽、膽囊炎、目赤、口瘡、無名腫毒、濕疹、燒、燙傷、高血壓癥。但細葉小檗葉的總黃酮含量測定未見報道。現對東北地區的細葉小檗葉的總黃酮進行提取及含量測定，為細葉小檗葉資源的合理開發和利用提供試驗依據。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料

樣品采自黑龍江省伊春市嘉蔭縣山區，由佳木斯大學藥學院宗希明老師鑒定為細葉小檗葉。

1.2 儀器與試劑

UV-757CRT型紫外可見分光光度計[1](上海精科學儀器有限公司)，RE-52A型旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)，SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)，UV-1型三用紫外分析儀(上海市安亭電子儀器廠)，KQ 5200型超聲波清洗器(江蘇昆山儀器廠)，101-Ⅲ型電熱鼓風恒溫干燥箱(江蘇大地自動化儀器廠)，98-1-B 型電子調溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)。

蘆丁標準品為中國藥品生物制品鑒定所購買，所用硅膠G為青島海洋化工集團公司生產，氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、三氯化鋁、鎂粉、甲醇、95%乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、冰醋酸、正丁醇、鹽酸、濃硫酸等試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 黃酮檢識試驗

在進行含量測定之前，對細葉小檗葉采用試管試驗、紙色譜、薄層色譜進行了鹽酸鎂粉反應、三氯化鋁反應、乙酸鎂反應等黃酮檢識試驗，見表1。

表1 樣品的黃酮檢識反應結果

細葉小檗葉提取液的黃酮檢測結果均為正反應，實驗結果顯示該植物中含有黃酮類化合物。

2.2 最大吸收波長的選擇

精密稱取 120 ℃干燥至恒重的蘆丁[2]對照品19.03mg，置于50mL容量瓶中，用甲醇完全溶解并定容，蘆丁對照品濃度為，分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于25mL(標號為標1～7)的容量瓶中，以甲醇為溶劑，亞硝酸鈉、硝酸鋁[3]和氫氧化鈉為顯示劑，分別以吸光度(A)為縱坐標，波長(λ)為橫坐標作圖，得到吸收曲線，細葉小檗葉和蘆丁標準品的吸收曲線 ，均在510nm處有一強吸收最大吸收波，因此選擇510nm為測定波長。

2.3 蘆丁標準曲線的制備

將已制備好的7個蘆丁對照品溶液置于紫外分光光度計中，在200～800nm(間隔1nm)下全波長掃描[4]，樣品檢測波長在510nm處分別測定吸光度；以吸光度值A為縱坐標，對照品溶液質量濃度 C 為橫坐標，得到回歸方程和相關系數繪制標準曲線。結果顯示蘆丁濃度在0.0156～0.0468mg/mL間具有良好的線性關系，回歸方程為C=0.0471A-0.0128，r=0.9988，得到蘆丁的標準曲線見圖1。

圖1 蘆丁的標準曲線

2.4 提取工藝研究

取干燥細葉小檗葉粗粉60g平均分成2份，分別用10倍量的65%的乙醇[5]和95%的乙醇[6]浸泡1h超聲(功率 250 W ，頻率40kHz)提取法[7]提取2次，時間30min，溫度60℃合并提取液，過濾，濾液回收乙醇并濃縮為2份墨綠色浸膏。分別將浸膏加水體積比1：1.5分散后分別用石油醚、氯仿、乙酸乙脂、正丁醇進行梯度萃取。棄去石油醚萃取液，其它萃取液分別回收溶劑后合并后得2份提取物分別加甲醇 50mL溶解過濾過濾至 100mL容量瓶中，殘渣和容器用少量甲醇多次洗滌，洗液加入容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度[8]，搖勻。65%的乙醇提取物為檢液Ⅰ、95%的乙醇提取物為檢液Ⅱ。取干燥細葉小檗葉粗粉約10g分成2份分別包入濾紙中置2個索氏提取器中水浴回流提取，各加石油醚180mL,回流 2h，棄去石油醚液，分別加65%乙醇，95%乙醇150mL,水浴回流提取2h，回收溶劑后加甲醇定容于100mL容量瓶中65%乙醇提取物為檢液III、95%乙醇為檢液IV。

精密量取檢液Ⅰ、檢液Ⅱ、檢液III、檢液IV各2mL，分別置25mL容量瓶中，按標準曲線制備項下先加5%亞硝酸鈉1.0mL，6min后加10%硝酸鋁1.0mL，6min后加4%氫氧化鈉10mL，加甲醇至刻度搖勻后室溫放置15min后，依次測定吸光度，計算出細葉小檗葉總黃酮含量，結果見表2。

式中x：總黃酮含量，%；

C1：檢測液中總黃酮濃度，mg/mL；

V1：檢測液處理后的體積，mL；

V： 配制的檢測液總體積，mL；

V2：樣品中檢測液的體積，mL；

W：小檗葉樣品干重，mg。

表2 細葉小檗葉的總黃酮含量檢測

2.5 結果

根據表2分析數據得出以下結論：檢液Ⅰ總黃酮含量 0.513%、檢液Ⅱ為 0.291%、檢液III為0.498%、檢液IV為0.288%。細葉小檗葉在提取溶劑為 65% 乙醇，超聲功率為 462W，超聲時間為30min，超聲溫度為60℃的超聲條件下總黃酮提取率最高。

3 討論

取干燥細葉小檗葉粗粉進行活性成分的提取、并做了黃酮檢識試驗，結果均為正反應，證明細葉小檗葉中含有黃酮成分。分別取不同濃度乙醇為溶劑采用超聲波及連續回流提取法分別對細葉小檗葉中總黃酮成分進行提取，采用比色法對檢液Ⅰ、Ⅱ、III、IV依次進行總黃酮含量測定。結果顯示不同溶劑和不同提取方法得到總黃酮含量也有差別。檢測結果分別為0.513%、0.291%、0.498%、0.288%。因此以65% 乙醇為溶劑，超聲波提取方法，適用細葉小檗葉中總黃酮含量測定。為合理開發細葉小檗葉提供試驗依據，細葉小檗葉可以成為黃酮新藥資源。