時鐘基因Period家族的晝夜節律在心血管疾病中的研究進展

張愛寧，張藝，季燁龍，熊永紅，冷燕，夏中元

(武漢大學人民醫院麻醉科，武漢 430060)

由于地球的自轉及公轉運動，生物環境在24 h的周期循環中不斷變化。地球上的生命基于環境演化出適合日常生存的分子鐘。生物體內的基因表達受24 h周期的調控，即生物體基因的表達具有節律性，大多數生物體普遍存在的一個晝夜節律行為即進食/禁食周期，它影響機體的新陳代謝[1]。在哺乳動物中，晝夜節律會影響各種生理行為(睡眠-覺醒周期、內分泌系統、體溫、運動活動等)，其本質受機體內生物鐘的驅動[2]。若晝夜節律被打亂，機體將會發生一系列病理生理的改變。有學者利用化學誘變的方法，在果蠅體內發現了一種可調節晝夜節律的基因，并將其命名為Period (Per)基因[3]。Per基因家族是調控晝夜節律生物鐘的核心組分之一，哺乳動物有3個Per同源基因，即Per1、Per2和Per3，在調節體內晝夜節律變化中發揮關鍵作用。Per基因家族的3個成員在心血管系統不同成分中的表達略有差異，發揮的生理作用也有所不同，三者通過各自的作用機制協調合作，共同實現心血管系統晝夜節律的穩定。已有研究證實，Per基因及其晝夜節律與許多心血管疾病的發病機制有關，包括心肌梗死、心肌梗死后的缺血再灌注損傷和心力衰竭等[4]。現就時鐘基因Per的晝夜節律與心血管疾病關系的研究進展予以綜述。

1 Per基因與生物晝夜節律的基礎研究

1.1Per基因的生物學特點與晝夜節律 晝夜節律最早被科學家們用來描述改變果蠅飛行行為節律的24 h內源振蕩，而Per基因是第一個被發現的控制晝夜節律的遺傳成分。1984年，有學者首次測出了Per基因附近的基因組DNA序列，這段DNA可轉錄出長度分別為0.9 kb和4.5 kb的兩種信使RNA，且長度為4.5 kb的信使RNA在胞內的濃度波動符合晝夜變化規律，其對應的DNA序列即為Per基因[5]。

Per基因作為調控晝夜節律的關鍵基因，與其他時鐘基因[Bmal1 (brain and muscle aryl-hydrocarbon receptor nuclear translocator-like 1)、Clock (circadian locomotor output cycles kaput)和Cry (cryptochrome)等]共同形成可精確控制生物節律的一系列與轉錄/翻譯相關的正負反饋環路，而Per基因是該振蕩環路關鍵的負性調控元件。在生物節律的主要反饋回路中，兩個轉錄因子Bmal1和Clock與Per基因啟動子區的E-box元件相互作用，激活Per基因在細胞核內轉錄信使RNA，進入細胞質后則受正反饋調節，不斷翻譯產生目的蛋白，即Per1、Per2和Per3蛋白[6]。當Per蛋白在胞質中逐漸聚集達到一定濃度后，會與另一時鐘基因Timeless的翻譯產物Tim蛋白發生相互作用，使Per蛋白可被胞質中的酪蛋白激酶1ε磷酸化，隨后穿梭至胞核，與含有E-box序列的轉錄啟動子結合，發揮其負性調控作用，抑制Per基因的轉錄，從而調節和控制機體的晝夜節律[7]。

在通路的負反饋循環中，一個關鍵的特征為抑制復合物Per-Tim蛋白在夜間的緩慢積累，該抑制復合物在細胞質內的濃度逐漸升高，達到峰值后又開始降低，且升高與降低兩個階段在時間上同步于24 h周期中細胞核內轉錄的活躍和不活躍階段[8]。這就要求細胞質中Per-Tim信使RNA根據時間節律維持和調節自身的穩定性。POP2(pyrin-only protein 2)是一種腺苷酸酶，是腺苷酸化復合體CCR4-NOT(carbon catabolite repression 4-negative on TATA-less)的一個亞基，可縮短信使RNA的多聚腺苷酸(A)尾的長度，當胞質中的POP2濃度降低時，Tim信使RNA的多聚腺苷酸化增強，使得多聚腺苷酸(A)尾長度增加，維持Tim信使RNA的穩定性；POP2并不控制Per信使RNA的穩定性，反之，Per基因通過某種間接機制抑制POP2依賴性的Tim信使RNA腺苷酸化[9]。

1.2Per基因在心血管系統中的表達 哺乳動物的晝夜節律系統由分層的多振蕩器結構組成，主要包括中樞起搏器(中央時鐘)和外周振蕩器(外圍時鐘)，兩者通過神經-體液網絡相互連接。中央時鐘位于下丘腦的視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)，同步化整個人體的外圍時鐘，而外圍時鐘在受到中央時鐘調控的同時，也可獨立調節機體組織器官的節律活動[10]。已有學者通過實驗發現，SCN損傷的小鼠外周器官中仍具有恒定水平的時鐘基因表達[11]。Per基因家族在中央、心臟及血管外圍時鐘中均有表達，且Per1的表達具有高度的心肌特異性，它與心肌細胞內鈣循環關鍵因子——鈣轉運ATP酶的晝夜節律等密切相關[1]。Per2可在心肌和血管內皮等細胞中表達，參與調節內皮依賴性血管舒張等，同時參與內源性心肌缺血的保護機制[2]。Per3在靈長類，包括在人類中的表達均具有串聯重復序列(variable number tandem repeat，VNTR)多態性，這種多態性會影響包括心臟在內的不同組織中各種基因的晝夜節律表達，有助于心臟功能的調節[12]。Per基因家族與其他時鐘基因共同作用于心臟和血管，以維持血壓、心率、心肌細胞電活動以及機械活動的晝夜節律性波動。

2 Per基因調節心血管系統的作用機制

與其他外周組織相比，心血管系統中核心時鐘基因的表達更為豐富。由于Per1、Per2和Per3在心臟和血管中的表達水平不同，三者既通過各自不同的機制參與心血管系統的生理活動，同時又相互協調，與其他時鐘基因共同維持心血管系統的晝夜節律。

時鐘基因 Per1參與細胞鈣循環的調節，但具體機制目前尚未明確。鈣循環是指細胞內鈣離子(Ca2+)不斷地釋放和再攝取，這一過程驅動心肌收縮和舒張。肌質網Ca2+-ATP酶(sarcoendoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)是維持細胞內鈣循環的關鍵因子，主要在興奮-收縮偶聯過程中負責Ca2+的再攝取[13]，SERCA2a是SERCA在心臟中表達的亞型。當細胞內Per1濃度達到晝夜高峰時，SERCA2a的活性達到晝夜最低值，心肌的收縮和舒張活動減弱；同時，Per1對腎臟鈉的重吸收具有調節作用，間接調節機體血壓的晝夜變化[14]。Richards等[15]的實驗數據表明，Per1參與腎小管上皮細胞鈉離子通道(epithelial sodium channel，ENaC)α亞基的基礎調節以及醛固酮誘導的調節。ENaC是腎集合管鈉重吸收的重要調節因子，負責鈉重吸收的微調，進而有助于控制血容量，起到調節血壓的作用，當Per1基因被敲除或表達受到抑制時，ENaC的活性顯著降低，鈉的重吸收減少，血壓降低[16]。除ENaC外，Per1還協同調節了其他參與鈉重吸收的多個基因的表達[17]。

時鐘基因Per2是調節血壓和心率晝夜節律變化的關鍵組成部分，參與維持血管正常的舒縮功能。Per2基因突變的小鼠表現出血壓降低、心率加快的趨勢[18]。研究證實，小鼠Per2基因突變可導致主動脈內皮功能障礙，包括一氧化氮生成減少、血管舒張性前列腺素減少以及由環加氧酶1衍生的血管收縮劑釋放增加[19]，表明Per2可能在調節血管功能中發揮作用。此外，Per2基因還通過直接且特異性地抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ來調節白色脂肪組織中的正常脂質代謝，Per2基因突變會導致脂質分解顯著減弱，動脈內脂質加速沉積[20]。同時，另一項研究證實，Per2基因具有調節缺氧誘導因子1α的作用，可促進心肌細胞進行高效糖酵解，作為腺苷受體亞型A2b的靶基因，Per2在A2b的調控下控制依賴于缺氧誘導因子1α的心臟代謝和局部缺血耐受[21]。因此，Per2似乎在心臟缺血適應的調節中起著不可或缺的作用，也可能參與血管功能和代謝的調節。

時鐘基因Per3在心臟中的表達與心臟活動的晝夜節律同步，其基因表達水平與心臟的日常適應相關，若心肌細胞為適應持續的壓力超負荷而發生肥大，Per3基因的表達也將受到影響[22]。另外，在血管平滑肌內也可找到Per3基因。研究人員已發現，體外培養的人頸動脈血管平滑肌細胞和在體人頸動脈血管平滑肌細胞均具有時鐘基因Per3、Bmal1等的節律性振蕩，它們對血管壁的結構和功能起重要作用，參與動脈粥樣硬化和斑塊破裂的發病機制[23]。另外，Per3基因可調節血管壁固有成分的含量，從而改變血管壁剛度，維持血管順應性[24]。Per3 VNTR可影響睡眠穩態和個體間的睡眠偏好，而睡眠周期影響心臟的自主調節，特別是交感迷走神經的平衡，其機制之一為Per3基因通過對白細胞介素-6、B型腦鈉肽和維生素A等物質的濃度調節，調整血壓和心率的變化，參與心血管代謝活動[25]。

3 Per基因與心血管系統疾病

心血管系統的許多生理活動會在一天內隨時間發生規律的波動，表現出驚人的晝夜時間依賴性震蕩，以維持正常的生理功能。事實上，在心臟和血管中，約10%的基因轉錄和約10%的蛋白質翻譯受到晝夜節律的調控[26]。晝夜節律紊亂可導致心臟病風險增加和不良心血管事件的發生，不利于疾病的轉歸。機體可由于血壓、心率、心排血量、外周血管阻力、血管舒張激素活性或血小板反應性等方面的晝夜變化而引發不良心血管事件，其中心肌缺血、心肌梗死、心源性猝死或室性心律失常等常發生于清晨[27]。心肌梗死期間的疼痛發作具有晝夜變化規律，發病率在清晨增加，在晚上出現第二個小高峰[28]。Per基因作為晝夜節律振蕩回路中的核心環節，以多種機制在心血管疾病的發生、發展過程中發揮作用。

3.1Per基因與高血壓 原發性高血壓是多種心血管疾病的獨立危險因素。一天中，正常機體的血壓會在一定范圍內發生波動，通常在清晨6～8點達到高峰，而在夜間1～2點熟睡狀態下降至全天最低值。晝夜節律的中斷或紊亂會影響血壓的正常調節，永久性夜班的工人在血壓和心率升高的同時，心率變異性會有所降低，其收縮壓和舒張壓升高后，血壓恢復的時間較正常情況有延遲[29]。Per基因在控制血壓方面起著重要作用，但其作用機制目前尚未完全清楚，而原發性高血壓又可影響Per基因的表達，改變其轉錄與翻譯的節律。一項研究顯示，與正常血壓對照者相比，高血壓患者腎臟髓質中Per1信使RNA的濃度顯著增加[30]。Tanaka等[31]通過收集原發性高血壓大鼠在12 h明暗周期下每隔4小時的腎上腺及血清樣品，并從中提取信使RNA分析時鐘基因的表達發現，Per2、Per3、Bmal1等時鐘基因在腎上腺中的表達相位較對照大鼠均有所提前。與野生型小鼠相比，給予高鹽飲食和長效醛固酮類似物去氧皮質酮戊酯Per1基因敲除的雄性小鼠在發生原發性高血壓風險降低的同時，會出現顯著的血壓節律紊亂[32]，而雌性小鼠可免受血壓調控失常，部分原因可能由于卵巢雌激素對心血管產生的保護作用[33]。以上研究均表明，Per基因具有調節血壓、維持血壓正常節律的作用，且Per基因的突變與原發性高血壓有密切關系。

3.3Per基因與心力衰竭 由缺血性心臟病繼發的心力衰竭是全球人口發病率和病死率的主要原因，而缺血性心臟病的發作具有顯著的晝夜節律性。Montaigne等[43]的隨機研究結果顯示，在行主動脈瓣置換術的患者中，手術時間為下午組的圍手術期主要不良心臟事件發生率低于清晨組，而午后患者的相對危險性降低是由圍手術期心肌梗死和急性心力衰竭發生率降低所致。這意味著心力衰竭的發生具有時間節律依賴性。此外，已有實驗證明，晝夜節律變化有助于缺血性心臟病和心力衰竭的心肌重構[33]。如正常24 h生理周期的C57BL/6小鼠，若改變其光暗輪換周期，所產生的壓力超負荷誘導的心肌肥大較在正常24 h光暗周期下的小鼠更嚴重，證明中央時鐘與外圍時鐘調控節律的不同步會加劇心臟重構，并可迅速進展為心力衰竭[44]。急性心肌梗死發生時，缺血區域時鐘基因的振蕩幅度衰減，且缺血與非缺血區域生物鐘節律的不同步性，加劇心肌梗死的惡化和心力衰竭的發生[45]。這些研究提示，時鐘基因表達異常可能是調控心肌缺血再灌注損傷的重要病理生理機制。心力衰竭的特征之一是SERCA2a表達水平和活性降低引起的肌質網Ca2+攝取受損，SERCA2a功能障礙所致的鈣循環紊亂是心肌缺血再灌注損傷加重的關鍵[46]。研究發現，p38促分裂原活化的蛋白激酶磷酸化是經受磷蛋白途徑活化SERCA2a的關鍵，而p38促分裂原活化的蛋白激酶具有晝夜節律性，且由 Per1直接調控[47]。這些證據表明，Per1基因參與了缺血再灌注損傷和心力衰竭的發生、發展。鹽皮質激素受體拮抗劑對全因性心力衰竭有顯著的治療作用，而鹽皮質激素受體可介導心臟炎癥和纖維化，心肌細胞鹽皮質激素受體選擇性缺失可導致心臟中的Per2基因失調；缺乏外周組織正常晝夜節律時鐘振蕩的小鼠對脫氧鹽皮質激素的特征性心臟炎癥/纖維化反應顯著減弱；同時，H9c2心肌細胞時鐘基因表達的增加增強了鹽皮質激素受體介導的Per1基因的反式激活，提示轉錄因子在心臟炎癥/纖維化和心力衰竭的發展過程起協同作用[48]。

3.4Per基因與動脈粥樣硬化 動脈粥樣硬化的好發人群主要為老年人，幾乎每個老年人均有不同程度的動脈硬化。近年來，隨著人們生活質量的不斷改善，動脈粥樣硬化發病逐漸呈年輕化趨勢，其病變的基礎為脂質代謝障礙。研究人員將敲除Per1、Per2基因小鼠的主動脈移植到野生型小鼠體內，野生型小鼠發展為頑固性動脈硬化疾病，證明了時鐘基因在動脈硬化性疾病實驗模型中作為自主影響的重要性[49]。Per2基因突變的小鼠，由于一氧化氮生成減少及環加氧酶1衍生的血管收縮劑釋放增加表現出主動脈內皮功能障礙，增加了促炎因子的表達，推動了動脈粥樣硬化的發展[50-51]。另有研究顯示，從動脈粥樣硬化病變中分離出的血管平滑肌細胞中的Per2基因表達維持在相對恒定的水平，晝夜振蕩受到破壞[52]。脈搏波速度的增加是動脈僵硬的一個指標，Asmar等[53]通過評估血流速度波形沿動脈段的傳輸時間，發現Per基因敲除的小鼠主動脈的脈搏波速度增加；進一步通過計算測得Per基因敲除小鼠的血管壁厚度及剛度增加，血管順應性降低，說明Per基因在維持血管順應性、阻遏動脈硬化方面具有正向作用。高膽固醇血癥是發生動脈粥樣硬化的危險因素之一，高膽固醇血癥和晝夜節律異常的結合可能影響心血管疾病的進展。Akashi等[54]通過向Per2基因引入突變，產生了晝夜節律受損的低密度脂蛋白受體缺陷小鼠，而在小鼠發生高膽固醇血癥的同時，其動脈斑塊面積也顯著增大，這意味著Per晝夜節律紊亂加速了動脈粥樣硬化的進展。

4 小 結

晝夜節律紊亂可破壞心血管系統的正常生理功能。Per基因通過各種復雜的分子機制調節心血管系統的活動，參與多種心血管疾病的病理生理過程。對Per基因及其調節因子進行靶向治療，為心血管疾病的治療提供了新思路和研究方向。已有研究者發現，可通過強光治療誘導Per2依賴性miR-21的表達上調，調節心肌細胞缺氧和代謝途徑，從而發揮心臟保護作用，減小心肌梗死面積[55]。L-茶氨酸也被證實可增加Per2、Bmal1、Cry1等時鐘基因表達的晝夜振蕩幅度，在調節血管晝夜節律系統中起重要作用，從而預防代謝綜合征和心血管疾病[56]。隨著Per基因對心血管系統的影響機制不斷被闡明，Per基因有望成為治療心血管疾病的新靶點。