土茯苓降尿酸活性成分研究

徐夢琪，徐德平

江南大學食品學院，無錫 214122

在人體代謝機制中，黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)能催化黃嘌呤和次黃嘌呤產生尿酸，是人體內尿酸生成關鍵的酶。XOD抑制劑可通過抑制XOD活性，從而減少尿酸的生成，被認為是治療高尿酸血癥的潛在因素。高尿酸血癥與腫瘤、心血管疾病、腎病以及三高等疾病密切相關[1-4]。臨床常用降尿酸藥物別嘌呤醇和秋水仙堿及其他合成藥常伴隨著耐受性差、肝腎功能損害和腸胃反應等[5]，限制了這些藥物在臨床上的應用。因此尋找天然來源的抗高尿酸血癥活性藥物一直是國內外研究的熱點。

土茯苓為百合科植物光葉菝葜(SmilaxglabraRoxb.)的干燥根莖，又名禹余糧、冷飯團、紅土苓等。土茯苓中主要化學成分有黃酮類、生物堿類、皂苷類、多糖類等。藥理研究顯示，其在體外抑菌、免疫抑制、抗炎鎮痛、治療腎病、保護心腦血管系統方面有明顯療效。臨床常用治療高尿酸血癥及痛風的藥物中均含有土茯苓[6,7]。Shi[8]、Zhang[9]等研究發現復方土茯苓顆粒能使高尿酸血癥患者的尿酸有效降低，且遠期療效和安全性好。目前對土茯苓的研究多集中在粗提物或復方的作用機制，對其降尿酸的具體功效成分尚不清楚。

本文通過建立高血尿酸小鼠模型，對土茯苓中降尿酸的活性成分進行系統分離和篩選，結合黃嘌呤氧化酶體外抑制實驗，尋找降尿酸的功效化合物，旨在明確土茯苓中降尿酸的物質基礎，為降尿酸藥物的開發提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 材料與試劑

土茯苓(安徽亳州中藥材市場)；硅膠板(GF254，山東煙臺芝罘化廠)；無水乙醇、正丁醇、冰醋酸、茴香醚、濃硫酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、二甲亞砜(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；甲醇(色譜純，國藥集團化學試劑有限公司)；大孔吸附樹脂(AB-8型，天津南開大學化學工廠)；ODS填料(Nacalai Tosoh Inc)；MCI GEL填料(Mitsubishi Chemical Corporation)；黃嘌呤、次黃嘌呤、氧嗪酸鉀(批號：B31M9D62661，純度﹥98%， 上海源葉生物有限公司)；黃嘌呤氧化酶(BR，50 U/mg protein，上海源葉生物有限公司)；別嘌醇片(合肥久聯制藥有限公司)；SPF級雄性ICR小鼠(上海斯萊克實驗動物有限公司)。

1.2 實驗儀器

提取罐(RAT-100型，無錫申科儀器有限公司)；旋轉蒸發器(R-1002型，上海申順生物科技有限公司)；恒流泵(SYB 106-100型，天津市科器高新技術公司)；暗箱式紫外透射儀(ZF-90型，上海顧氏光電儀器有限公司)；可見分光光度計(HY-727 S型，無錫市英之誠高速分析儀器有限責任公司)；pH計(PHS-3E型，上海儀電科學儀器股份有限公司)；核磁共振儀(Avance 500 MHz，美國Bruker公司)。

2 實驗方法

2.1 土茯苓提取物制備與粗分離

稱取土茯苓10，粉碎后過40目篩，置于100 L提取罐中，以1∶10(g∶mL)料液比加入體積分數75%的乙醇，60 ℃條件下攪拌提取4 h，過濾，取濾液，濾渣按上述方法再次醇提，取濾液。合并兩次濾液，減壓濃縮至合適體積，即為土茯苓醇提物。濾渣再以1∶10(g∶mL)料液比加入去離子水，65 ℃條件下攪拌提取4 h，過濾取濾液，減壓濃縮至合適體積，即為土茯苓水提物。將土茯苓醇提物與水提物合并，即得到土茯苓的混合提取物，于-25 ℃冷凍保存。

取適量土茯苓混合提取物上AB-8型大孔樹脂柱(10 cm×150 cm)[10]，依次用水，30%，70%，95%的乙醇進行梯度洗脫，薄層色譜法(TLC)跟蹤監測洗脫液中的成分，并根據TLC檢測結果將具有相同成分的洗脫液合并，得到A(水洗脫)、B(30%洗脫)、C(70%洗脫)、D(95%洗脫)4個組分。將各組分分別減壓濃縮后冷凍保存。

2.2 土茯苓粗組分降尿酸活性的檢測

四周齡 SPF 級雄性小鼠購回后適應性喂養7天，飼養溫度為25 ℃，相對濕度為50%，動物照度為15 LX。將小鼠隨機分為7組，每組10只。各實驗組按1.0 g/(kg·d)劑量灌胃相應的洗脫組分，別嘌呤醇作為陽性對照組按30 mg/(kg·d)劑量給藥，空白組和模型組則給正常飲用水，連續灌胃7天。

除空白組外，其余各組在末次給藥1 h前腹腔注射氧嗪酸鉀和次黃嘌呤，劑量均為300 mg/kg，造成小鼠高血尿酸模型，空白組腹腔注射0.5%的CMC-Na。

各組小鼠在末次給藥1 h后，摘眼球取血，離心機分離血清后采用全自動生化分析儀測定其血清尿酸(UA)、肌酐(CRE)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)。采用雙縮脲法測定TP含量，溴甲酚綠法測定ALB含量，肌氨酸氧化酶法測定CRE含量，計算A∶G=ALB∶(TP-ALB)。

2.3 大孔樹脂洗脫活性組分的分離

將具有降尿酸活性的C組分上樣到MCI柱(5 cm×100 cm)，依次用30%、50%和95%的乙醇進行梯度洗脫，流速15 mL/min，自動收集器每管20 mL收集洗脫液，用TLC法跟蹤監測洗脫液中的成分，并根據Rf值和顯色反應的結果合并相同組分，得到C-1(30%洗脫)、C-2(50%洗脫)、C-3(95%洗脫)三個組分。

2.4 MCI柱洗脫組分降尿酸活性的檢測

按2.2方法對MCI柱分離得到的C-1、C-2、C-3三個組分進行動物實驗，測定各組分的降尿酸活性。

2.5 降尿酸的單一成分分離與結構鑒定

將具有降尿酸活性的C-1組分反復上樣到ODS柱(3 cm×100 cm)，直至得到5個單體化合物1～5。以氘代二甲亞砜為溶劑，進行1H NMR和13C NMR等光譜數據分析，確定其結構。

2.6 單體化合物對XOD活性的抑制作用

由于分離到的單體化合物的量不足以做動物實驗，則采用XOD體外抑制實驗，測定其對XOD活性的抑制作用。

2.6.1 XOD活力的測定

XOD的活力測定是基于黃嘌呤在XOD的催化作用下生成尿酸，尿酸在294 nm處有特征吸收峰[11]。

實驗方法參考文獻[12]并加以改進，在石英比色皿中加入2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.5)、1 mL 0.1 mmol/L的黃嘌呤氧化酶(終濃度為0.025 mmol/L)和0.5 mL 2 U/mL的黃嘌呤氧化酶溶液(終濃度為0.25 U/mL)，充分混合。在 294 nm 條件下運用動力學軟件，從酶加入時開始監測，每1 s測定反應的吸光度值，連續測定3 min。以吸光度對時間作圖，進行線性回歸，計算斜率Rate酶(dA/s)，平行操作三次，取斜率平均值。測定前將1 mL的黃嘌呤溶液和3 mL的PB在比色皿充分混合后進行調零校準。

2.6.2 樣品與別嘌呤抑制率的測定

在石英比色皿中加入2 mL的緩沖鹽溶液、1 mL的黃嘌呤氧化酶、0.5 mL 160 μg/mL的各樣品溶液及別嘌呤溶液(終濃度為20 μg/mL)和0.5 mL的黃嘌呤氧化酶溶液，充分混合。測定方法同“2.6.1”。各組分對黃嘌呤氧化酶的抑制率為：I=[(Rate酶-Rate樣品)/Rate酶]×100%。

2.7 數據處理

3 實驗結果

3.1 大孔樹脂粗組分降尿酸活性分析

經大孔樹脂分離的各組分對小鼠血清UA、CRE、TP、ALB、A∶G的影響如表1所示。由表1可知，與空白組相比，模型組小鼠的血尿酸值顯著升高(P<0.01)，則說明高血尿酸小鼠模型建立成功。相較于空白組，模型組的血肌酐值顯著升高(P<0.01)，白球比顯著降低(P<0.01)，則說明在高尿酸狀態下，小鼠的腎臟和肝臟都有明顯損傷。作為陽性對照組的別嘌呤能夠使小鼠的血尿酸值顯著降低(P<0.01)，但其肌酐值與白球比相比于模型組并無明顯變化，說明別嘌呤并不能改善小鼠由于高尿酸造成的肝腎損傷。

由表可知，樣品C能夠顯著降低(P<0.01)高尿酸癥小鼠的血尿酸值，且相比于模型組其肌酐值有顯著降低(P<0.01)，白球比有顯著升高(P<0.01)，則說明C組分是土茯苓中降尿酸的活性成分，且其對高尿酸導致的小鼠肝腎損傷有一定的改善。對土茯苓大孔樹脂70%乙醇洗脫物(C)進行進一步的分離純化。

3.2 MCI洗脫各組分降尿酸活性分析

經大孔樹脂分離的各組分對小鼠血清UA、CRE、TP、ALB、A∶G的影響如表2所示。由表2可知，各組分中只有C-1組顯著降低(P<0.01)了高尿酸小鼠的血尿酸值，說明其是降低尿酸的有效成分。相比于模型組，C-1組的肌酐值顯著降低，白球比顯著升高，說明C-1組在降低小鼠尿酸的同時也能明顯改善其由于高尿酸導致的肝腎損傷。對MCI柱30%乙醇洗脫物(C-1)進行下一步的分離純化。

3.3 單體化合物的鑒定

化合物1白色粉末，不溶于水，易溶于乙醇、甲醇;1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：6.89(1H，s)，6.74(2H，s)，5.91(1H，d，J=2.5 Hz)，5.88(1H，d，J=2.5 Hz)，5.24(1H，d，J=10 Hz)，4.65(1H，d，J=10 Hz)，4.02(1H，s)，3.15～3.90(4H，m)，1.06(3H，d，J=6.5 Hz)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：194.7(C-4)，167.0(C-7)，163.5(C-5)，162.2(C-9)，145.9(C-3′)，145.2(C-4′)，127.0(C-1′)，119.0(C-6′)，115.4(C-5′)，114.8(C-2′)，101.1(C-10)，100.1(C-1′′)，96.1(C-6)，95.1(C-8)，81.6(C-2)，75.7(C-3)，71.7(C-4′′)，70.5(C-3′′)，70.2(C-2′′)，69.0(C-5′′)，17.8(C-6′′)。以上數據與文獻[13]報道一致，因此鑒定該化合物為落新婦苷。

表1 大孔樹脂洗脫各組分對高血尿酸癥小鼠血清UA、CRE、TP、ALB、A∶G的影響Table 1 Effects of macroporous resin elution on serum UA,CRE,TP,ALB,A∶G in hyperuricemia mice

表2 MCI洗脫各組分對高血尿酸癥小鼠血清UA、CRE、TP、ALB、A∶G的影響Table 2 Effects of MCI elution of components on serum UA,CRE,TP,ALB,A∶G in hyperuricemia

化合物2淡黃色粉末，不溶于水，易溶于乙醇、甲醇;1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：6.88(1H，s)，6.75(2H，s)，5.85(1H，d，J=2 Hz)，5.82(1H，d，J=2 Hz)，5.20(1H，d，J=9.5 Hz)，4.70(1H，d，J=11 Hz)，4.02(1H，s)，3.15～3.90(8H，m)，1.06(3H，d，J=6.5 Hz)，1.02(3H，d，J=6 Hz)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：195.4(C-4)，169.3(C-7)，164.0(C-5)，162.5(C-9)，146.0(C-3′)，145.2(C-4′)，127.7(C-1′)，119.4(C-6′)，115.4(C-5′)，114.8(C-2′)，101.3(C-10)，100.6(C-1′′)，100.4(C-1′′′)，96.8(C-6)，95.6(C-8)，81.4(C-2)，75.6(C-3，C-2′′)，71.7(C-4′′)，71.3(C-4′′′)，70.5(C-3′′)，70.4(C-3′′′)，70.2(C-2′′′)，69.9(C-5′′)，69.0(C-5′′′)，17.8(C-6′′)，17.7(C-6′′′)。從1H NMR和13C NMR可知，該化合物與化合物1結構類似，不同的是化合物2的糖上有12個碳信號，從糖的信號來看為兩個鼠李糖殘基。從δ75.6碳信號來分析，鼠李糖的2號位被取代。鑒定該化合物為花旗松素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-α-L-吡喃鼠李糖苷。

化合物3淡黃色粉末，不溶于水，易溶于乙醇、甲醇;1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：11.83(1H，s)，7.34(2H，d，J=8.5 Hz)，6.80(2H，d，J=8.5 Hz)，5.96(1H，d，J=2.0 Hz)，5.88(1H，d，J=2.0 Hz)，5.29(1H，d，J=10.4 Hz)，4.76(1H，d，J=10.4 Hz)，3.95(1H，br s)，3.10～3.92(4H，m)，1.06(3H，d，J=6.3 Hz)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：194.9(C-4)，167.1(C-7)，163.5(C-5)，162.3(C-9)，157.9(C-4′)，129.2(C-6′，C-2′)，126.6(C-1′)，115.3(C-3′，C-5′)，101.1(C-10)，100.4(C-1′′)，96.2(C-6)，95.2(C-8)，81.6(C-2)，76.1(C-3)，71.7(C-4′′)，70.5(C-3′′)，70.2(C-2′′)，69.1(C-5′′)，17.8(C-6′′)。化合物3與化合物1相似，僅在B環不同，通過與文獻[14,15]比對，鑒定該化合物為黃杞苷。

化合物4淡黃色粉末，不溶于水，易溶于乙醇、甲醇;1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.26(2H，d，J=8.6 Hz)，6.76(2H，d，J=8.6 Hz)，5.95(1H，d，J=2.0 Hz)，5.92(1H，d，J=2.0 Hz)，5.60(1H，d，J=2.4 Hz)，4.73(1H，br s，H-1′′)，4.16(1H，d，J=2.4 Hz)，2.3～3.45(4H，m)，0.80(3H，d，J=6.2 Hz)；13C NMR(125 MHz，，DMSO-d6)δ：194.8(C-4)，167.6(C-7)，163.5(C-5)，162.6(C-9)，157.9(C-4′)，129.1(C-6′，C-2′)，127.8(C-1′)，115.2(C-3′，C-5′)，100.9(C-10)，100.1(C-1′′)，96.4(C-6)，95.3(C-8)，81.5(C-2)，76.0(C-3)，71.6(C-4′′)，70.4(C-3′′)，70.2(C-2′′)，69.0(C-5′′)，17.8(C-6′′)。對比文獻[14,15]，鑒定該化合物為異黃杞苷。

化合物5紅褐色粉末，不溶于水，易溶于乙醇、甲醇;1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.40(2H，d，J=8.5 Hz)，6.95(1H，d，J=16 Hz)，6.84(1H，d，J=16.5 Hz)，6.77(2H，d，J=8 Hz)，6.41(1H，s)，6.15(1H，s)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：158.6(C-4，C-4′)，157.4(C-9)，139.4(C-8)，128.1(C-1′)，128.0(C-2′，C-6′)，125.7(C-6)，115.7(C-3′，C-5′)，104.4(C-2)，101.9(C-7)。由13C NMR可知該化合物有11個碳信號，其中有6個為苯環上的碳信號，由化學位移可知該苯環為對位取代。余下的5個碳信號，結合1H NMR譜，推測為吡咯并嘧啶結構，結合HMBC譜，該化合物中吡咯并嘧啶的結構為吡咯并[3,2-d]嘧啶。從δ158.6、157.4碳信號來分析，吡咯并嘧啶的4號位被取代。鑒定該化合物為4-(吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-基)苯酚，該化合物在土茯苓中首次發現。

通過以上分析得出化合物1～5的結構如圖1所示。

圖1 化合物1～5的化學結構Fig.1 The chemical structures of compounds 1-5

3.4 單體化合物對XOD活性抑制作用分析

5個單體化合物對XOD的抑制效果如表3所示。從表中可知，化合物2～5均能顯著(P<0.01)降低黃嘌呤氧化過程的速率，明顯抑制XOD活性，由此可知化合物2～5均是有效的XOD抑制劑。其中化合物5的抑制率達到了80.47%±3.83%，其抑制效果與陽性對照組別嘌呤無顯著差異(P<0.01)。

表3 化合物1～5對XOD活性的影響Table 3 Effect of compound 1-5 on XOD activity

黃杞苷(3)與異黃杞苷(4)為一對異構體，構型分別為(2R，3R)和(2R，3S)。由表可知，其抑制率基本一致，則說明這一空間構型的變化對XOD活性的抑制效果沒有影響。

4 結論

土茯苓醇提物大孔樹脂70%乙醇洗脫組分具有降尿酸的活性，該組分經MCI分離后，降尿酸的組分集中在MCI 30%乙醇洗脫物中，對其進一步分離得到5個單體化合物，分別為落新婦苷、花旗松素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-α-L-吡喃鼠李糖苷、黃杞苷、異黃杞苷、4-(吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-基)苯酚，其中花旗松素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-α-L-吡喃鼠李糖苷和4-(吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-基)苯酚為首次在土茯苓中發現。經過黃嘌呤氧化酶的體外抑制實驗，初步判斷土茯苓中具有降尿酸活性的是花旗松素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-α-L-吡喃鼠李糖苷、黃杞苷、異黃杞苷和4-(吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-基)苯酚，落新婦苷體外對黃嘌呤氧化酶無抑制作用。

有關土茯苓降尿酸的活性成分，目前研究都認為是土茯苓中的黃酮類化合物在起作用[16,17]。本文分離得到4-(吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-基)苯酚對黃嘌呤氧化酶抑制率雖然很高，但其在土茯苓中含量低，而花旗松素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-α-L-吡喃鼠李糖苷、黃杞苷和異黃杞苷在土茯苓中含量高，故推測黃杞苷和異黃杞苷為土茯苓粗組分中主要起降尿酸活性的物質。本文試驗分離得到的4個有效的黃嘌呤氧化酶抑制劑體內降尿酸作用有待進一步實驗驗證。