基于果蠅模式生物差異基因表達的刺玫果抗衰老作用機理研究

翟春梅，懷 雪，孟祥瑛，付敬菊，秦 蓁，孟永海

黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040

刺玫果(RosadavuricaPall.)野生資源豐富，主要分布于我國東北、華北地區，且營養豐富，民間大量采食或用于泡茶、泡酒等。刺玫果具有提高免疫力、改善人體疲勞等保健功能，是一種多營養、多功能、多用途的藥食同源寶貴資源[1-4]，黑龍江省具有得天獨厚的資源優勢。課題組前期研究表明：刺玫果醇提物可顯著果蠅延長壽命。本研究進一步采用RNA-Seq技術從基因整體表達水平探求刺玫果醇提物是如何在果蠅體內引起一系列生物學變化從而達到延長果蠅壽命的作用機理，并從整體水平分析給予刺玫果醇提物后果蠅基因及蛋白表達與功能的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

Gene Expression Wash Pack(Agilent);RNeasy Mini Kit(Qiagen);RNA提取試劑盒(賽默飛Applied Biosystem);渦旋儀(上海達姆，型號：VORTEX4);磁力攪拌器(塞力斯，型號：TALBOYS);恒溫金屬浴(威泰克，型號：Block Heater HB-2);離心濃縮儀(德國Eppendorf，型號：5301);電熱恒溫培養箱(上海精宏，型號：DNP-9022);-80 ℃冰箱(美國Thermo，型號：902-ULTS);冷藏冰箱(美國Thermo，型號：THM#REL5004V);超純水系統(美國Millipore公司Milli-Q plus)。刺玫果原料采于黑龍江省加格達奇大興安嶺地區，刺玫果醇提物實驗室自制，制備方法見前期研究基礎。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及處理

將羽化12 h內的新生果蠅雌雄分開，雌性果蠅隨機保留30只，空白組與給藥組各15只，空白組用普通培養基飼養，給藥組在培養基中添加0.46%的刺玫果醇提物喂養，第三十天時，將雌果蠅饑餓2 h后移入液氮中2 h，放置-80 ℃冰箱保存，每組做三個樣品為平行試驗。

1.2.2 文庫質量檢測與測序

為了保證數據結果的可靠性，應當確保文庫的質量，經過檢測的樣本經Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量，當文庫的有效濃度可大于2 nM時，完成文庫質量檢測要求，才可通過IlluminaHiSeq軟件進行上機測序。

1.2.3 原始數據的處理方法

1.2.3.1 原始數據質量控制要求

在數據分析之前，要保證Reads的質量足夠高，這樣才能使后續分析結果更精準。首先將含有接頭的Reads去除干凈，其次去除質量值Q≤10的堿基數占整條Read的50%以上的Reads和N的比例大于10%的低質量的Reads。經上述過程，得到高質量的Clean Data。

1.2.3.2 將參考基因組序列與轉錄組數據對比

通過TopHat2軟件將參考基因組與Clean Reads進行序列對比，以獲取在基因上或者參考基因組的位置信息，再對比測序樣品中序列特有信息，使Reads盡可能全面的比對到參考基因上，這樣可使數據的利用率大大提高。

1.2.4 SNP/InDel位點統計及預測

變異位點主要在基因組的基因間區、基因區和CDS區，可通過變異位點在參考基因組上的位置或者參考基因組上的基因位置信息來確定變異位點以及變異產生的同義或非同義影響。使用TopHat2軟件統計與預測SNP位點，SAM- tools軟件查找SNP在基因區的潛在位點。結果對比分析，樣品的可變剪切類型和表達量通過ASprofile[6]軟件獲得。

1.2.5 基因結構優化分析與新基因注釋

兩個生物學條件之間的差異表達基因集是通過DEseq分析樣本組間的差異表達得到的。其差異基因篩選標準同時滿足fold change≥2且FDR<0.05。使用Cufflinks軟件對新基因進行注釋發掘。將發掘的新基因與Swiss-Prot、NR、COG、GO、KEGG、Pfam 數據庫比對基因序列，用HMMER 軟件對比預測的氨基酸序列，得到新基因的注釋信息。

1.2.6 差異表達基因功能注釋和富集分析(Gene Ontology，GO)

將刺玫果給藥組與空白組果蠅差異基因導入DAVID在線分析平臺進行基因功能注釋和富集分析。應用基因注釋功能數據庫，鑒別差異表達基因發生的生物學過程，對差異基因分別從細胞成分(CC)、分子功能(MF)、生物學過程(BP)三方面進行基因注釋和GO功能聚類分析，采用Fisher檢驗的計算方法，計算每個GO顯著性水平，并找出篩選的差異基因顯著性GO與哪些生物學功能顯著相關。

1.2.7 基于KEGG的信號通路富集分析(Pathway Analysis)

KEGG是一個整合了系統功能信息、基因組和生物化學的數據庫。它具有強大的功能，可把檢測到的差異基因與更高級別的生物系統的功能水平關聯起來。KEGG數據庫對差異基因進行篩選，并對差異基因進行Pathway注釋，得到其全部參與的Pathway，在鑒別差異基因參與的生化代謝途徑和信號轉導途徑來解釋說明差異基因對機體的影響。采用Fisher檢驗的計算方法，計算每個Pathway顯著性水平，并找出篩選的差異基因顯著性與哪些富集的Pathway顯著相關。對差異表達基因KEGG的注釋結果按照KEGG中通路類型進行分析，對代謝相關上調基因進行KEGG通路注釋并篩選其所涉及的代謝過程及信號轉導過程。

1.2.8 數據處理

采用TopHat2、Cufflinks、ASprofile等軟件對RNA-Seq的剪切[5]，BLAST軟件是基本局部匹配查詢工具，用來快速比較序列的生物學信息，DESeq對RNA差異表達進行分析、EBSeq對基于貝葉斯方法的RNA差異表達分析，topGO軟件對基因進行基因本體富集分析，采用NR、Swiss-Prot等數據庫對非冗余蛋白質序列進行分析，采用GO、COG、KOG、Pfam等數據庫對基因本體、同源蛋白質簇、蛋白質同源性聚類分析，采用KEGG、STRING、Ensembl對差異基因的功能及相互作用進行分析。

2 結果與分析

2.1 質量檢測結果

空白和給藥樣品的Clean Reads中分別有24 872 937和24 875 689個，各樣本Q30均大于95.51%，GC大于54.17%。在測序數據統計中顯示各樣品Q30堿基百分比均大于95.15%，符合樣本要求。

2.2 SNP/InDel位點統計及預測

表1統計各類型SNP位點所占的比例，SNP注釋結果統計圖與InDel的注釋結果統計圖見圖1與圖2。

表1 各類型SNP位點統計Table 1 Statistics of various types of SNPs

圖1 SNP注釋結果統計圖Fig.1 Statistical chart of SNP annotation results

本實驗研究對6個果蠅樣品轉錄測序分析共得到可靠的SNP位點總數798 931個，其中776 338個SNP位點位于基因區。占總數的97.17%。6個樣品中顛換型的SNP位點數約占總SNP位點數的37%，轉換型的SNP位點數量約占62%，SNP位點中雜合型SNP占60%以上。

2.3 基因結構優化分析與新基因注釋結果

使用Cufflinks軟件共注釋發掘614個新基因。將發掘的新基因與Swiss-Prot、NR、COG、GO、KEGG、Pfam 數據庫比對基因序列，用HMMER 軟件對比預測的氨基酸序列，得到新基因的注釋信息。統計如表2。

圖2 InDel的注釋結果統計圖Fig.2 InDel annotated result statistical map

表2 果蠅的新基因功能注釋結果統計Table 2 Statistics of annotated results ofnew gene functions in Drosophila

2.4 差異基因統計結果

經DEseq及Gene Ontology分析結果發現刺玫果給藥組與空白組相比差異基因為128個，顯著下調的基因有75個，其基因分別為：CG8736(FBgn0033308)、CG5172(FBgn0030830)、RH61745(FBgn0030829)、Acp1(FBgn0014454)、Cpr97 Ea(FBgn0039480)、Fbp2(FBgn0000640)、stnA(FBgn0016976)、Fbp1 P1(FBgn0000639)、Cpr92F(FBgn0038819)等。顯著上調基因有53個，其中新基因有4個，其余基因有Hsp(FBgn0001230)、PH4alphaNE3(FBgn0051017)、CG32199(FBgn0052199)、anon-EST(FBgn0035257)、CG12783(FBgn0038448)、CG14240(FBgn0039435)、gsb-RA(FBgn0001148)、Sfp70A4(FBgn0259970)、Acp54A1(FBgn0083936)、CG6628(FBgn0036072)、Acp BEST(FBgn0043825)等。

2.5 差異表達基因功能注釋和富集分析結果

差異基因的GO富集分析見圖3。差異基因的GO富集共有60條注釋信息。差異表達基因GO注釋分類結果表明：在生物學過程中，細胞過程、生物學過程、生物學規律、進化過程、應激反應、細胞成分組織或生物合成、生物粘附、節律過程有明顯差異；在細胞組分中，細胞代謝、組織、膜高分子組成、細胞間隙、膜封閉有明顯差異；在分子功能中，結合活性、催化活性、受體活性、蛋白結合轉錄因子活性、結構分子活性、蛋白結合轉錄因子活性有明顯差別。

2.6 差異基因KEGG注釋和富集通路分析結果

結果表明，由29個基因注冊到19條通路包括花生四烯酸代謝(ko00590)、光傳導-飛行通路(ko04745)、磷酸鹽與磷酸酯代謝(ko00440)、精氨酸與脯氨酸代謝(ko00330)、長壽調節途徑-多物種(ko04213)、甘油磷脂代謝(ko00564)、剪接體(ko03040)、蛋白表達通路(ko03060)、醚脂代謝(ko00565)、內吞作用(ko04144)、內質網中的蛋白質加工(ko04141)、氨基糖與核苷酸糖代謝(ko00520)、谷胱甘肽代謝(ko00480)、藥物代謝-細胞色素P450(ko00982)、細胞色素P450(ko00980)、氧化磷酸化代謝通路(ko00190)等(見表3)。

圖3 差異基因的GO富集分析Fig.3 Gene Ontology enrichment analysis of differentially expressed genes

表3 差異表達基因的KEGG富集分析

2.7 刺玫果對果蠅差異基因及通路網絡生物學意義分析

根據“2.6”項下結果，選取了幾條對于機體抗氧化、新陳代謝、長壽調節方面的通路進行詳細說明，如圖1所示。

圖1 刺玫果影響果蠅主要通路及生物學意義總結圖Fig.1 Summary of main pathways and biological significance of Drosophila affected by Rosa davurica Pall.

2.7.1 刺玫果對氧化磷酸化信號通路的影響

氧化磷酸化在機體各組織能量代謝中的地位十分重要。氧化磷酸化是生物化學過程[7]，發生在原核生物的細胞質中，或發生在真核細胞的線粒體內膜上的偶聯反應[8]，其作用是氧化糖、氨基酸、脂等有機物在分解釋放能量，供給ADP與無機磷酸合成ATP的過程。磷酸化(phosphorylation)是指在生物氧化中生成ATP的作用。機體生成ATP有兩種方式，一種是氧化磷酸化，通過呼吸鏈電子傳遞，偶聯生成ATP。生物體ATP絕大多數來源這種形式。另一種是底物水平磷酸化，代謝物脫氫后，使分子內能量重新分布，無機磷酸酯化形成中間代謝，使ADP變成ATP的過程。刺玫果可影響ATPe基因的表達，調節ADP的電子傳遞、H+傳遞及氧的利用，從而產生產生H2O和ATP，全身功能。通過測序結果我們發現，與空白組相比，給與刺玫果喂養的果蠅體內ATPe(F型H+轉運ATP酶C亞單位)基因表達增高，上調氧化磷酸化代謝通路，從而影響果蠅的能量代謝。

2.7.2 刺玫果對谷胱甘肽代謝通路的影響

谷胱甘肽不僅能消除人體自由基[9]，還可以提高人體免疫力,維護健康，抗衰老，在老人遲緩化的細胞上所發揮的功效比年輕人大。谷胱甘肽不僅可使血紅蛋白不受自由基氧化從而維持氧氣的運輸，而且還可以保護紅細胞膜上蛋白質的巰基處于還原狀態，有效的防止溶血。給與刺玫果喂養的果蠅，體內谷胱甘肽含量明顯增加，提示其抗自由基活性增強，從而具有延緩衰老的作用。轉錄組測序結果表明，刺玫果影響果蠅體內GstS1(谷胱甘肽轉移酶)基因，上調谷胱甘肽的代謝通路，使果蠅體內谷胱甘肽含量明顯增加從而增強果蠅抗氧化能力延緩衰老。

2.7.3 刺玫果對長壽調節途徑的影響

HSP是一種被熱激或其他脅迫條件所誘導的分子伴侶，具有參與細胞運輸、蛋白降解，亞基組成和蛋白折疊的功能調節蛋白的功能和活性[10]。當機體受到外界刺激時，HSP可加速異常蛋白質的降解，抵抗細胞損傷以維持細胞的正常代謝。同時，HSP還可以與蛋白酶等構成細胞抗氧化防御體系，防止氧化自由基所致的蛋白損傷，起到抗衰老的作用[11]。前期實驗研究表明，給與刺玫果醇提物喂養的果蠅壽命得到了顯著的延長，RNA-Seq結果顯示與空白對照組相比，給藥組果蠅體內HSP基因表達顯著提高，對長壽代謝途徑有明顯的上調作用，這無疑提高了果蠅應激能力和果蠅體內蛋白質空間構像，使果蠅體內蛋白質聚集折疊幾率降低，促進跨膜運輸，增加果蠅免疫能力和耐熱性，保護細胞活動和細胞生存等方面延長果蠅壽命。

2.7.4 刺玫果對內質網中的蛋白質加工代謝通路的影響

研究表明，當果蠅給予一定劑量的刺玫果醇提物喂養后，與空白對照組相比老年果蠅體內HSP90和HSC71基因表達水平顯著上調，以加速降解受損蛋白質，維持細胞的正常功能。蛋白質二硫鍵異構酶3(PDIA3)具有催化蛋白質二硫鍵形成、氧化還原及異構化的作用，是內質網中PDI家族的一員。Chichiarelli等[12]已經發現PDIA3可通過結合特殊的DNA修復蛋白來參與應激反應，CCT3屬于TCP1的Y亞單位，是HSP60家族蛋白的分子伴侶復合體，與ATP依賴的方式和細胞骨架蛋白組裝，對肌動蛋白等重要的蛋白質的折疊起著重要的作用。衰老會加速蛋白錯誤折疊及變性，對結構蛋白產生不可逆的不利影響，刺玫果醇提物可通過上調HSP家族基因的表達，上調蛋白質加工通路來修復衰老引起的蛋白質受損。

2.7.5 刺玫果對內質網中的蛋白質表達代謝通路的影響

IMP2基因在腦、骨髓、腸、肌肉、胰腺、腎臟、腫瘤等人組織中廣泛表達，IMP2基因不僅與糖尿病和調節平滑肌細胞的粘附和活動相關，還在成肌細胞和骨骼肌細胞增殖過程中顯示重要的作用，這個作用受到HMGA2基因的調節[13-15]。刺玫果可增加IMP2基因在果蠅體內表達含量，從而提高內質網中蛋白質表達的代謝通路，提高蛋白質正確的折疊、蛋白質的合成轉運、糖基化修飾和質控等。

2.7.6 刺玫果對剪切體代謝通路的影響

剪切體是在剪接過程的各個階段隨著snRNA的加入而形成的。也就是說在完整的pre-mRNA 上形成的一個剪接中間體[16]。剪接體本身需要一些不會翻譯出任何蛋白的小核RNA的參與，這些小核RNA對調控遺傳活動起著重要的作用。刺玫果醇提物通過上調剪切體代謝通路調控RNA的合成和有關蛋白質合成，從而調節機體的各項生理功能。

2.7.7 刺玫果對磷酸鹽代謝通路的影響

無機磷酸鹽[17]可作為有氧代謝和糖酵解的激活劑。近年來運動時高能磷酸鹽的代謝與運動性疲勞的產生有了較深刻的認識，磷酸鹽代謝與肌肉收縮力和運動能力有密切關系。當人體進行大量的運動過后，體內肌細胞中的磷濃度比正常狀態下高3倍以上，最高則高達10倍。這促使Ca2+進入線粒體內，不但影響肌細胞中各亞細胞結構對Ca2+的敏感性，而且還影響氧化磷酸鹽產生ATP的效果，使肌肉能力降低。果蠅攀爬強度的爬運動可影響PCYT1(膽堿磷酸胞苷酰轉移酶)基因的表達含量，從而影響無機鹽的代謝通過，可能通過ATP和對Ca2+的敏感性改變果蠅抗疲勞作用，從而對果蠅攀爬能力產生影響。

2.7.8 刺玫果對精氨酸和脯氨酸代謝通路的影響

精氨酸在動物體內可以通過精氨酸酶分解成鳥甘酸和尿素。而合成胺類的前體就是鳥苷酸，它們促進細胞增殖，調節細胞生長，在細胞體內起著重要的作用。精氨酸[18]在相關酶作用可轉化成谷氨酰胺、脯氨酸、腐胺，腐胺可以生成精胺和亞精胺，統稱為多胺。谷氨酰胺可在三羧酸循環過程中氧化供能產生CO2。精氨酸還可經一氧化氮合成酶的氧化途徑，生成具有一定生物活性的一氧化氮，精氨酸還通過氧化途徑,經一氧化氮合成酶(NOS) 催化生成具有維持血管張力的恒定與調節血壓穩定等重要生物活性的一氧化氮(NO)。NO作為內皮舒張因子可維持血管的通透性,改善腸道的缺氧和缺血功能。NO也能在神經細胞系統間發揮作用，促進學習和記憶功能。研究表明，刺玫果醇提物給藥后，上調了P4HA(脯氨酰4-羥化酶)基因精氨酸和脯氨酸代謝通路，增加果蠅氧化功能作用，延緩果蠅衰老。

3 討論

給與刺玫果醇提物喂養的果蠅與空白對照組果蠅相比，共發現128個差異基因，其中包括53個上調，75個下調。其中103個差異基因的來源基因可注釋到包括細胞進程、分子功能進程及生物進程在內的60個GO條目，上述來源基因還可注釋到19條KEGG代謝通路，由29個基因注冊到19條通路包括花生四烯酸代謝(ko00590)、光傳導-飛行通路(ko04745)、磷酸鹽與磷酸酯代謝(ko00440)、精氨酸與脯氨酸代謝(ko00330)、長壽調節途徑-多物種(ko04213)、甘油磷脂代謝(ko00564)、海馬信號通路(ko04391)、吞噬體(ko04145)、α-亞麻酸代謝(ko00592)、剪接體(ko03040)、蛋白表達通路(ko03060)、醚脂代謝(ko00565)、內吞作用(ko04144)、內質網中的蛋白質加工(ko04141)、氨基糖與核苷酸糖代謝(ko00520)、谷胱甘肽代謝(ko00480)、藥物代謝-細胞色素P450(ko00982)、細胞色素P450(ko00980)、氧化磷酸化代謝通路(ko00190)等。在果蠅行為學實驗中，果蠅抗氧化能力增加且體內抗氧化指標谷胱甘肽、SOD等氧化指標發生變化。通過果蠅RNA-Seq測序結果表明，刺玫果醇提物可調控ATPe、P450、HPGDS、P4HA基因影響果蠅抗氧化能力。推測果蠅抗氧化應激能力提高，體內抗氧化指標谷胱甘肽等指標發生改變與這些基因表達調控有關。

在果蠅行為學實驗中其攀爬能力、果蠅體內肝、肌糖原、LDA等能量代謝指標發生變化，基因測序結果表明刺玫果醇提物可影響ATPe、CHS1、PLA2G、PCYT1、P4HA、PTGS、HPGDS基因的表達調節果蠅體內氨基酸糖、花生四烯酸、脂類和磷酸鹽等能量代謝通路，推測果蠅體內肝、肌糖原、LDA等能量代謝指標發生變化與這些基因的表達調控有關。

研究發現，刺玫果醇提物使果蠅壽命延長還體現在可上調HSP、HSP70、HSP73等長壽基因和IMP2基因來提高了果蠅應激能力，調節蛋白質加工通路來修復衰老引起的蛋白質受損，調節細胞的生理功能維持細胞的生存能力，降低蛋白在表達過程中的出現異樣的伸展、折疊和解聚等情況來延緩果蠅壽命。除此之外，刺玫果醇提物提取物還可下調ACTB-G1、Actin、HIPPO等基因調控果蠅吞噬體內吞作用、光傳導和HIPPO等信號通路，這些通路是如何作用在果蠅體內和果蠅的表現形式等一系列問題，有待更深入的研究。通過對正常喂養和刺玫果醇提物喂養的30日齡果蠅的基因序列進行深入分析，提供了基因在正常喂養和刺玫果喂養的果蠅生長過程中的表達譜和差異表達信息。本研究結果為進一步闡明刺玫果抗衰老作用機制和綜合開發利用野生刺玫果提供了一定的實驗基礎。