黃芩內生真菌發酵黃芩苷生成千層紙素A的代謝途徑及轉化條件研究

馬宗敏，苗文麗，劉 佳，何 培，孫國強，裴 林

河北省中醫藥科學院 濁毒證重點實驗室，石家莊 050031

千層紙素A(oroxylin A，OA，5,7-dihydroxy-6-methoxy flavone，C16H12O5，結構式見圖4)是中藥黃芩的活性組分之一，為黃酮類化合物，在黃芩中的含量約為0.05%～0.2%[1]。近年來的研究發現千層紙素A具有多種藥理活性，包括抗炎[2]、抗過敏[3]、抑制病毒[4]、改善心力衰竭[5]、保護肝臟[6]、血管[7]、保護神經細胞并改善記憶[8]、抗腫瘤[9]等。尤其是千層紙素A的抗腫瘤作用受到了廣泛關注，不斷有國內外研究證實其對多種腫瘤細胞具有抑制作用[10,11]。千層紙素A通過誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞遷移、抑制糖酵解、自噬等途徑發揮其抗腫瘤作用[12]。同時，千層紙素A選擇性殺傷腫瘤細胞而對正常造血系統影響較小，這是目前腫瘤化療藥物不具備的[13]。

天然化合物活性高且毒副作用較低，但因資源有限及其特殊的立體結構，使得天然化合物的應用受到一定限制。同樣的，雖然千層紙素A的藥效研究樂觀可期，但是千層紙素A的生產和單方制劑研究卻寥寥無幾[12]。千層紙素A當前的來源主要是化學提取和合成，南京某公司報道了從木蝴蝶中分離純化千層紙素A的方法[14]，通過有機溶劑提取、大孔樹脂富集和聚酰胺柱層析分離純化、重結晶后得到產物。該法提取得到的千層紙素A不足藥用植物本身質量的0.1%。Majeed等[15]也報道了從一種印度藥用植物Oroxylumindicum中利用有機溶劑提取千層紙素A的方法，提取物中千層紙素A含量為10%～15%，但報道中并未提及產物得率。鑒于植物中千層紙素A含量低，提取成本過高且污染嚴重，而且容易破壞產物的天然立體結構，對藥效造成影響[12,14,15]，因此國內外學者也對千層紙素A的化學合成進行了研究，合成起始物包括黃芩素和黃芩苷。Li等[16]以黃芩素為起始物通過4步化學反應得到千層紙素A，Li等[17]以黃芩苷為起始物，通過甲基化和去保護基步驟得到千層紙素A，化學合成所需步驟較多，用到多種有機試劑，污染嚴重，尚無適用于大規模生產的方法見諸報道。微生物發酵轉化法生產千層紙素A具有高效、清潔、環保的優勢，且能最大限度保留其天然活性[18]，更容易實現大規模生產。但對于以黃芩苷為底物通過微生物發酵轉化合成千層紙素A的研究未見報道，僅Zhang等[19]報道了利用基因工程氧甲基化轉移酶轉化黃芩素生成千層紙素A，文獻主要針對酶的反應位點特異性進行研究。課題組前期從中藥黃芩植株根部篩選得到一株能夠轉化黃芩苷生成千層紙素A的內生青霉菌Penicilliumsp.R3[20]，開發了一條千層紙素A微生物合成的新途徑。在前期工作基礎上，本研究明確了Penicilliumsp.R3生長的規律，對其轉化黃芩苷生成千層紙素A的途徑進行了初步探索和論證，同時采用單因素結合正交試驗法優化了發酵轉化的條件并提高了產量，為千層紙素A的微生物合成及開發利用奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

菌株Penicilliumsp.R3為野生黃芩新鮮植株根部內生青霉菌，由河北省中醫藥科學院濁毒證實驗室分離、鑒定并保藏[20]。

1.1.2 培養基

菌種活化及發酵培養基均為馬鈴薯葡萄糖培養液(PDB)，孢子制備培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面。發酵轉化培養基為PDB培養液滅菌后加入一定比例底物。各培養基詳細制備方法參考文獻[21]。

1.1.3 儀器

LS-35HD型高壓蒸汽滅菌器(江陰濱江醫療設備有限公司)；XB.K.25型血球計數板(上海求精生化試劑儀器有限公司)；DMBA300型生物數碼顯微鏡(Motic實業集團中國有限公司)；SPX-150型生化培養箱(北京市永光明醫療儀器有限公司)；THZ-98AB型恒溫振蕩培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)；DHG-9053A型電熱鼓風干燥箱(中儀國科北京科技有限公司)；HP-01型無油真空泵(天津市恒奧科技發展有限公司)；KH-300E型超聲儀(昆山禾創超聲儀器有限公司)；1260型高效液相色譜儀(安捷倫公司，美國)；ELGA超純水儀(威立雅公司，英國)；CP-214型電子分析天平(上海奧豪斯儀器有限公司)。

1.1.4 試劑

黃芩苷對照品(北京盛世康普化工技術研究院，批號151121，純度≥99%)；黃芩素、千層紙素A對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號分別為C02A6Y1、Y29D6Y17716，純度均≥98%)；黃芩苷、黃芩素(上海源葉生物科技有限公司，批號分別為C22J7Y9309、C04D8Y49741，純度均≥90%)；色譜甲醇(Tedia公司，美國)；超純水(自制)；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備

菌種活化后劃線至PDA斜面，28 ℃恒溫培養，待斜面長滿孢子后，取出1支，加入10 mL已滅菌的生理鹽水，輕輕搖晃，充分沖洗孢子，然后在超凈工作臺中將沖洗液用無菌脫脂棉進行過濾，孢子濾液中加入無菌玻璃球，然后搖床震蕩30 min使成團的孢子打散，制備好孢子懸浮液搖勻后用血球計數板置于顯微鏡下觀察計數，計算孢子濃度[22]，并按實驗需要稀釋成所需濃度進行接種。

1.2.2 菌體培養及生長曲線測定

取孢子懸浮液按5%比例接種至配制好的PDB培養液中，28 ℃，150 rpm培養，于培養0～10天每日取出，搖勻后取10 mL，過濾得到菌體，于80 ℃烘干至恒重，稱重后計算菌體干重[22]，繪制菌體生長曲線，每日3組平行。

1.2.3 高效液相色譜法(HPLC)分析轉化產物

供試品溶液的制備[21]：發酵液超聲10 min后搖勻，取0.5 mL，加甲醇8～9 mL，超聲10 min后放至室溫，繼續精密加入甲醇至10 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾得供試品溶液。以未接種孢子的培養液同法處理作為空白對照。

對照品溶液的制備：精密稱取黃芩苷、黃芩素和千層紙素A對照品適量，加甲醇配成質量濃度分別為106.4、57.80、52.10 μg/mL的混合對照品溶液。

色譜條件[21]：色譜柱 Agilent ZORBAX Eclipse plus C18(4.6×250 mm，5 μm)；紫外檢測器(VWD)；流動相為0.2 %冰醋酸甲醇溶液(A)-0.2 %冰醋酸水溶液(B)梯度洗脫(0～15 min：49%A；15～18 min：49%→61%A；18～36 min：61%A)，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長275 nm，進樣量10 μL。

1.2.4 標準曲線的繪制

精密稱取“1.2.3”項下混合對照品溶液，加甲醇梯度稀釋成6個不同濃度的對照品溶液，按“1.2.3”項下色譜條件進行測定，每濃度進樣3次，以濃度及對應峰面積繪制標準曲線并得到線性回歸方程。

1.2.5 各成分含量及轉化率計算

各成分含量利用標準曲線所得線性回歸方程進行計算，轉化率采用產物與發生轉化的底物的摩爾比進行計算，計算方法參考文獻[21]。

1.2.6 轉化途徑分析

取Penicilliumsp.R3孢子懸浮液按5%比例接種至PDB培養液中，培養3天后各瓶分別加入0.1%黃芩苷、黃芩素和千層紙素A進行轉化實驗，每組2個平行，同時設置未接種瓶作為空白對照，轉化6天后取出，按“1.2.3”項下方法制備供試品及空白溶液，取“1.2.3”項下對照品溶液稀釋5倍作為對照品，按“1.2.3”項下條件進行HPLC檢測，分析產物。

1.2.7 發酵條件單因素優化實驗

底物黃芩苷加入時間：取相同濃度的Penicilliumsp.R3孢子懸浮液，按5%比例接種至PDB培養液中，28 ℃，150 rpm培養，分別在培養第0、1、2、3、4天時加入0.1%的黃芩苷繼續培養至第7天，取出，按“1.2.3”項下方法制備供試品及空白溶液并測定黃芩苷及千層紙素A含量。

底物黃芩苷轉化時長：取相同濃度的Penicilliumsp.R3孢子懸浮液，按5%比例接種至PDB培養液中，28 ℃，150 rpm培養3天后，加入0.1%的黃芩苷分別繼續培養1～7天，每天取出，按“1.2.3”項下方法制備供試品及空白溶液并測定黃芩苷及千層紙素A含量。

底物黃芩苷添加比例：取相同濃度的Penicilliumsp.R3孢子懸浮液，按5%比例接種至PDB培養液中，28 ℃，150 rpm培養3天后分別按0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%、0.14%的比例加入黃芩苷繼續培養6天，取出，按“1.2.3”項下方法制備供試品及空白溶液并測定黃芩苷及千層紙素A含量。

1.2.8 發酵條件正交優化實驗

以單因素試驗優化條件為基礎，選取裝液量(A)、轉速(B)、溫度(C)、接種量(D)為考察因素，分別以轉化后培養液中千層紙素A的轉化率及產量為考察指標，按表1進行四因素三水平正交試驗L9(34)，具體發酵轉化條件為取250 mL錐形瓶為發酵容器，在相應條件下接種培養3天，然后按0.08%比例加入黃芩苷并進行6天的轉化實驗，發酵完成后取樣，按“1.2.3”項下方法制備供試品及空白溶液并測定黃芩苷及千層紙素A含量。

1.2.9 優化條件驗證

按照單因素及正交實驗優化的發酵條件進行3次重復驗證試驗，計算轉化率、產量及相應的RSD值，分析穩定性及可行性。

2 實驗結果

2.1 菌株生長曲線

培養液接種孢子后于28 ℃，150 rpm培養，發酵菌液生長良好，由乳白色逐漸變為墨綠色，細屑狀。

表1 正交因素水平L9(34)表Table 1 L9(34)orthogonal test factors and levels

由菌體生長曲線(圖1)可看出，菌體在0～1天處于停滯期，1～4天處于對數生長期，4天之后進入穩定期，之后生物量變化不大。由于以菌體干重為標準繪制生長曲線，因此不能很好反映菌體的衰落期。但是本曲線基本符合一般微生物生長規律，正確的反映出Penicilliumsp.R3的生長情況，明確了其快速生長期，且可看出菌株生長迅速，前期生物量的迅速積累，有利于底物的轉化。菌株的生物量在第5天和第7天略有下降，在生長穩定期，菌體處于死亡和新生的一個平衡階段，大致處于總生物量穩定狀態，但出現波動是難免的。

圖1 菌株Penicillium sp.R3生長曲線Fig.1 Growth curve of Penicillium sp.R3

2.2 標準曲線

按“1.2.3”測定并繪制黃芩苷、千層紙素A標準曲線(圖2)，得到兩種物質峰面積對應濃度的線性回歸方程，黃芩苷(Y=31.666X+5.524；R2=0.995 0)，千層紙素A(Y=58.222X+13.485；R2=0.998 2)。黃芩苷、千層紙素A分別在0.020～0.638、0.010～0.313 μg范圍內線性關系良好，可用于發酵液中相應物質含量的計算。

2.3 轉化途徑分析

由HPLC譜圖(圖3)可看出，經6天轉化反應后，菌株轉化黃芩苷得到黃芩素和千層紙素A兩種產物(圖B)，轉化黃芩素得到產物千層紙素A(圖C)，但千層紙素A未發生轉化(圖D)，相應空白均未發生轉化(圖b、c、d)，由此可證明黃芩苷在轉化過程中得到的兩種產物是具有相關性的，并非分別獨立轉化，這也與我們之前文章中提出的黃芩素可能為中間產物的設想相一致[20]。菌體先轉化黃芩苷生成黃芩素，再進一步轉化黃芩素為千層紙素A，黃芩素為中間產物，轉化途徑見圖4，但詳盡轉化途徑和機制還需進一步深入研究。由此，明確黃芩苷經內生菌Penicilliumsp.R3轉化終產物為千層紙素A，后續將以千層紙素A為指標進行優化條件研究。

圖2 黃芩苷(A)和千層紙素A(B)標準曲線Fig.2 Calibration curve of baicalin(A)and oroxylin A(B)

圖3 對照品、轉化樣品及空白的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of standard substances,biotransformation samples and blanks注：1.黃芩苷；2.黃芩素；3.千層紙素A。A.對照品；B.黃芩苷轉化樣品；C.黃芩素轉化樣品；D.千層紙素A轉化樣品。a.對照品；b.黃芩苷轉化空白；c.黃芩素轉化空白；d.千層紙素A轉化空白。Note:1.Baicalin;2.Baicalein;3.Oroxylin A.A.Standard substances;B.Baicalin biotransformation sample;C.Baicalein biotransformation sample;D.Oroxylin A biotransformation sample.a.Standard substances;b.Baicalin biotransformation blank;c.Baicalein biotransformation blank;d.Oroxylin A biotransformation blank.

圖4 菌株發酵轉化黃芩苷的生物轉化途徑Fig.4 Biotransformation pathway of bacalin by Penicillium sp.R3

2.4 發酵條件單因素優化實驗

2.4.1 底物黃芩苷加入時間

由圖5可見于培養0～1天加入黃芩苷，底物消耗多，千層紙素A的產量及轉化率卻不高，第2天之后加入黃芩苷，消耗率較之前降低，轉化率及產量卻有所提高，第3天加入黃芩苷，千層紙素A的轉化率及產量均為最高。結合菌體生長曲線(圖1)可知，0～1天菌體正處于吸收累積營養為快速生長做準備階段，此時加入黃芩苷，菌體可能將部分黃芩苷用于生長，進而導致消耗多產出少。第3天快速生長階段基本完成，此時加入的黃芩苷極少用于生長，轉化率及產量均提高且達到最高值。因此選取培養第3天為底物的最佳添加時間。

2.4.2 底物黃芩苷轉化時長

由圖6的轉化率曲線可看出，從第2天開始，轉化率變化幅度很小，隨著黃芩苷的消耗產物逐漸積累至底物基本消耗完成，轉化6天后，千層紙素A產量達到峰值，黃芩苷消耗殆盡，之后千層紙素A質量濃度略有下降，可能是菌體進入生長衰退期引起的，具體原因還有待于進一步分析，但由此可看出轉化時間過長并不利產物累積，因此選取6天為添加底物后最佳轉化時長。

圖5 接種后加入黃芩苷的最適時間Fig.5 Optimal adding time of substrate after inoculation

圖6 底物發酵轉化最適時長Fig.6 Optimal transformation time of the substrate

2.4.3 底物黃芩苷添加比例

由圖7可看出，隨著黃芩苷添加量的增加，其消耗率逐漸下降，在菌體轉化率變化不大的狀態下，底物黃芩苷在一定時間內的消耗量也是穩定的，因此添加量越多消耗率越低，比例低于0.06%時黃芩苷可100%消耗，但耗盡后菌體尚有轉化能力底物卻不足，黃芩苷添加比例高于0.06%時，底物充足，可使菌體轉化能力得到最大利用，當黃芩苷添加量為0.08%時，轉化率最高同時千層紙素A產量與峰值接近，黃芩苷的利用率達到80%。綜合各因素，選取黃芩苷添加比例為培養液的0.08%。

圖7 底物的最適添加比例Fig.7 Optimal additive proportion of the substrate

2.5 發酵條件正交優化實驗

單因素優化實驗結果為接種培養3天后按0.08%比例加入黃芩苷，繼續轉化6天結束培養。以此為基礎按“1.2.8”方法進行正交實驗優化，實驗結果及方差分析見下表2和3，以千層紙素A轉化率和產量為考察指標的正交試驗中(表2)，各因素對兩個指標影響的大小順序相同，均為A(裝液量)>B(轉速)>C(培養溫度)>D(接種孢子濃度)，針對轉化率最優轉化條件為A1B3C1D2，即裝液量10%，轉速200 rpm，培養溫度25 ℃，接種孢子濃度1×106～2×106個/mL。針對產量最優轉化條件為A1B2C3D2，即裝液量10%，轉速150 rpm，培養溫度30 ℃，接種孢子濃度1×106～2×106個/mL。

以極差最小的D因素作為誤差項進行方差分析[23]，結果(表3)表明，4個因素中，裝液量對轉化率和產量均有顯著影響(P<0.05)，而其他因素并未表現出顯著影響，在以產量為考察指標的正交實驗中，轉速的顯著性P值介于0.05和0.10之間，比其他指標影響略大一些。兩指標綜合結果可看出，裝液量是主要影響因素，其次是轉速，而接種量和溫度影響并不大。

兩個考察指標的最優條件中裝液量均為10%，接種量均為1×106～2×106個/mL，具有一致性，差別在于溫度及轉速。考慮到在產量為指標的正交試驗中，轉速的影響也較明顯，因此轉速采用150 rpm，在溫度控制方面，30 ℃比25 ℃在實際培養及后期放大培養中更容易穩定控制，25 ℃需要低于20 ℃的環境溫度或有制冷功能的培養設備中才能良好保持，不利于環保節能及后期擴大培養，因此采用30 ℃為培養溫度。經過正交試驗優化最終確定的培養條件為裝液量10%，轉速150 rpm，培養溫度30 ℃，接種孢子濃度1×106～2×106個/mL。

2.6 優化條件驗證試驗

按照單因素及正交實驗優化的發酵條件進行3次重復驗證試驗，結果見表4，轉化率及產量穩定性較好，3次驗證試驗轉化率的RSD=4.0%(n=3)，產量的RSD=4.5%(n=3)，該轉化條件是可行的。

3 結論

菌株Penicilliumsp.R3生長速度快，4天內即達到最大生物量，有利于縮短培養周期，節約能源，提高產品生產效率，是一株優良的生產菌株。

表2 黃芩苷發酵轉化條件正交試驗結果Table 2 Orthogonal test design and result of fermentation process of baicalin

表3 正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test

表4 Penicillium sp.R3轉化黃芩苷生成千層紙素A最優條件驗證Table 4 Verify results of biotrasformation process from bacalin to oroxylin A by Penicillium sp.R3

在大量優化實驗過程中我們發現產物黃芩素的產量變化不大，但千層紙素A的產量隨實驗條件呈現明顯波動，于是推測黃芩素可能為中間產物，經過研究初步驗證了此設想。黃芩素與千層紙素A僅6號位取代基不同，分別為羥基和甲氧基，推測菌株Penicilliumsp.R3極可能同時產生葡萄糖苷酶和甲基轉移酶兩種酶，先利用葡萄糖苷酶將黃芩苷糖苷鍵斷開生成黃芩素，進而利用甲基轉移酶將黃芩素6號位甲基化生成千層紙素A，且該甲基轉移酶很可能是能夠特異性催化黃酮6位羥基甲基化的甲基轉移酶[19]，此推測還需后續研究驗證。

考慮到多數菌株的高產酶階段處于生長平穩期，我們采用了先培養后添加底物的發酵模式，并優化了底物添加的時間節點及添加量，在生物量快速積累基本完成的第3天加入黃芩苷，轉化率和產量明顯高于0～2天時加入。過早加入黃芩苷會因為黃芩苷部分用于菌體生長且轉化酶濃度低降低轉化率及產量。

正交試驗采用了千層紙素A轉化率和產量兩個指標相結合進行優化。理論上轉化率和產量應為正相關，而在實際的培養轉化過程中我們發現這兩者呈現出了部分的不一致性，可能原因是在轉化反應中消耗的黃芩苷并沒有100%轉化為產物，有一部分用于菌體生長，有一部分轉化為中間產物黃芩素，而轉化率是以產物千層紙素A的摩爾量與消耗底物黃芩苷的摩爾量之比進行計算，存在發酵液中千層紙素A產量高，但同時黃芩苷消耗也高，致使轉化率并不高的情況，反之亦然。兩個指標結合可盡量避免這一影響，得到最優化條件。

利用微生物轉化黃芩苷合成千層紙素A尚未見報道，本研究以黃芩苷為底物通過微生物發酵轉化得到千層紙素A，最優條件下的轉化率達到42.44%。有文獻報道以黃芩苷或黃芩素為起始物用化學法合成千層紙素A，總收率分別為56%和30%[16,17]，方法中均用到大量有機試劑，不利于清潔環保。Zhang等[19]報道了利用來自苔蘚的基因工程氧甲基化轉移酶轉化黃芩素生成千層紙素A，實驗室條件下孵化1 h轉化率可達75%，酶催化下的生物轉化反應，足夠的酶量和轉化時間可使底物達到100%轉化，這與活體轉化是不同的。同時基因工程酶的獲取需要經過復雜的基因擴增、轉化、產物表達、酶的分離純化等步驟，成本較高。本實驗采用的微生物轉化法具有成本低廉、轉化效率較高，培養簡單的優勢，具有進一步的研究應用價值。

在分析了菌體的生長規律，初步明確的產物的轉化途徑并優化了菌體發酵轉化條件之后，我們將對轉化機制進行進一步探索，包括菌體產生的與轉化相關的酶的種類、功效及活性。還將擴大發酵轉化規模，對產物進行提取分離，得到純度較高的產品進行下一步應用研究。