黃芪甲苷干預高糖誘導人臍靜脈內皮細胞損傷的實驗研究

程 飛，陳景福，李詩成，劉 靜，陳麗珍，郭灼林

糖尿病作為一種全身慢性多發性疾病，隨著病情的加重，病人會出現多種慢性并發癥，其中糖尿病血管病變、糖尿病性腎病和糖尿病視網膜病變是常見的嚴重并發癥，對病人的預后和生活質量產生巨大的影響。糖尿病血管病變是心血管疾病發生的誘導因素，有相關研究指出血管內皮細胞在糖尿病血管病變過程中起著重要作用。有研究表明，高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)出現損傷，伴隨細胞凋亡與糖尿病足和糖尿病視網膜病變密切相關[1]。黃芪作為一種傳統的中藥材，具有利水消腫、固表補氣的作用，同時黃芪中包含豐富的有效單體成分，如黃酮類、皂苷類和多糖類，其中黃芪甲苷在功效方面已有較多研究，研究顯示，黃芪對腎病病人尿蛋白有很好的改善作用，從而發揮保護腎功能的作用[2]。另外，黃芪甲苷具有改善腦缺血、心肌缺血和抗氧化的作用，同時還對糖尿病腎病等多種疾病具有改善作用。黃芪甲苷具有抗炎、減少氧化物產生、對抗細胞凋亡的作用[3-4]。ClC-3氯離子通道作為影響細胞容積和細胞電位的通道，對細胞的增殖、分化和凋亡等有直接的作用[5]。因此，本實驗探討ClC-3氯離子通道在高糖誘導HUVECs損傷中的分子作用以及黃芪甲苷的對抗作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 細胞培養箱為HERA Cell 150，胎牛血清和低糖DMEM均購自BI公司；二甲基亞砜、MTT試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒、一氧化氮(NO)檢測試劑盒、Caspase-3檢測試劑盒、Annexin-Ⅴ凋亡檢測試劑盒均購自碧云天生物技術有限公司；內皮型一氧化氮合酶(eNOS)酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；HUVECs株來源于美國模式培養物保藏所；黃芪甲苷購自中國藥品生物制定鑒定所，其純度高于97%。

1.2 方法

1.2.1 分組及干預方法 首先構建高糖誘導HUVECs損傷模型，采用含有10%的胎牛血清DMEM培養基對細胞進行培養，分為空白對照組、高糖組、黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷中劑量組和黃芪甲苷高劑量組，其中高糖組、黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷中劑量組和黃芪甲苷高劑量組均采用33mmol/L的葡萄糖培養細胞[6]，黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷中劑量組和黃芪甲苷高劑量組分別給予黃芪甲苷10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L[7]。黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷中劑量組和黃芪甲苷高劑量組先將HUEVCs預培養18 h后再在高糖環境下培養48 h。

1.2.2 MTT細胞活性檢測 采用MTT法檢測細胞活力，先將細胞鋪板接種于96孔板中，然后按照藥物和葡萄糖處理方式將細胞進行培養后棄掉培養液，每孔加入MTT溶液20 μL與細胞培養基180 μL混合后孵育4 h，將上清液棄掉后加入二甲基亞砜，搖床振蕩10 min后采用酶聯免疫檢測儀檢測其吸光度值，波長為490 nm。

1.2.3 細胞裂解和相應檢測樣本處理 將HUEVCs接種于六孔板中，讓細胞密度保持在每孔1×105個，然后培養24 h后進行藥物處理和造模，在處理完成后收集細胞上清液，測定細胞釋放的LDH和NO。然后收集細胞內的相關因子，采用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗3次后，采用細胞RIPA裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)將細胞從孔板上提取下來后，在12 000 g下離心15 min后將細胞碎片去除，應用蛋白定量方法(BCA)對蛋白濃度進行測定。

1.2.4 LDH測定 采用LDH試劑盒檢測，對細胞進行不同組處理后收集細胞上清液，根據試劑盒說明書進行操作后在酶標儀下進行440 nm波長下的吸光度測定，并計算LDH濃度。

1.2.5 NO和eNOS活力測定 NO采用試劑盒進行測定，對細胞分組處理后收集細胞上清液，按照說明書操作在酶標儀550 nm下進行吸光度測定。eNOS則應用ELISA試劑盒進行測定，收集細胞樣本并按照說明書操作，在酶標儀下進行450 nm的吸光度測定。

1.2.6 細胞凋亡檢測 結合Caspase-3蛋白表達量對細胞凋亡情況進行檢測，采用細胞裂解法收集細胞裂解液，并且按照說明書進行檢測，在405 nm下進行吸光度測定。

1.2.7 細胞內氯離子濃度檢測 采用氯離子熒光探針(MQAE)檢測細胞內氯離子濃度，采用HEPES緩沖液將MQAE濃度調節至10 mmol/L，將細胞培養液換成MQAE后細胞正常孵育1 h，然后將其放置于熒光顯微鏡下進行檢測，并應用軟件分析平均熒光強度。

1.2.8 細胞內ClC-3氯離子通道的mRNA和蛋白水平檢測 不同組樣本處理后對細胞進行蛋白裂解后提取，結合聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-page)電泳分離，采用抗體孵育后檢測ClC-3氯離子通道的蛋白表達量，抗體購自上海碧云天生物技術有限公司，一抗濃度為1∶200[8]。mRNA檢測采用TRIZOL法提取總RNA后經逆轉錄和聚合酶鏈式反應(PCR)擴增檢測相對表達量。實時熒光定量PCR(qPCR)中ClC-3氯離子通道的上游引物為5′-ATGACAAATGGAGGCAGCAT-3′，下游引物為5′-TTTCCCAAGTAACCTCTGATGC-3′，內參ACTIN引物上游引物為5′-GCCAACCGTGAGAAGATGAC-3′，下游引物為5′-GTGGTGGTGAAGCTGTAGC-3′。

2 結 果

2.1 黃芪甲苷對高糖誘導的HUVECs活力的影響 高糖成功誘導HUVECs損傷模型，MTT和細胞凋亡檢測顯示高糖成功導致細胞損傷，細胞活力在高糖處理后其活性下降至70.31%，不同濃度黃芪甲苷能夠增加細胞活力，降低細胞損傷。詳見表1。

表1 各組HUVECs活力比較(±s)單位：%

2.2 黃芪甲苷對高糖誘導的HUVECs相關指標的影響 高糖環境處理HUVECs后，細胞分泌的NO明顯減少，LDH明顯增加，同時細胞內eNOS明顯減少，Caspase-3明顯增加，而黃芪甲苷處理細胞后，NO、eNOS較高糖組明顯增加，LDH、Caspase-3較高糖組明顯降低，這與HUVECs活力提高結果相一致。詳見表2。

表2 各組HUVECs相關指標比較(±s)

2.3 黃芪甲苷處理高糖環境的HUVECs后細胞內氯離子濃度 對損傷細胞應用黃芪甲苷后細胞內氯離子濃度檢測發現，細胞損傷后細胞內氯離子有明顯降低，同時黃芪甲苷能夠抑制細胞損傷導致的氯離子外流。詳見圖1。

2.4 ClC-3氯離子通道情況 對各組ClC-3氯離子通道蛋白和mRNA檢測發現，在高糖環境下，ClC-3氯離子通道蛋白和mRNA水平明顯降低，而不同濃度黃芪甲苷組mRNA和蛋白水平較高糖組有所增加。詳見圖2。

與空白對照組比較，*P<0.01；與高糖組比較，△ P<0.05，# P<0.01。圖1 各組細胞內氯離子濃度相對表達量比較

與空白對照組比較，*P<0.01；與高糖組比較，△ P<0.05，# P<0.01。圖2 各組ClC-3氯離子通道蛋白和mRNA水平比較

3 討 論

高血糖是糖尿病血管性病變的重要并發癥，高糖誘導內皮細胞損傷導致發病，且多項研究表明，高糖環境會導致內皮細胞凋亡數量明顯增加。本研究結果顯示，高糖處理后其細胞活力降低，凋亡細胞增多。目前，糖尿病血管性病變的臨床治療方式有采用具有抗細胞凋亡的藥物，本研究結果顯示，黃芪甲苷預處理能夠有效抑制高糖導致的細胞損傷和細胞凋亡。同時在細胞損傷后產生的LDH均明顯增加，而應用黃芪甲苷后相應指標的釋放量都減少，表明對細胞損傷起著保護作用。對細胞凋亡因子Caspase-3進行檢測發現，細胞在高糖誘導下凋亡細胞增多，而應用黃芪甲苷處理后，Caspase-3降低。

在高糖環境下，細胞多種活力因子和炎性因子發生明顯改變，同時伴隨多種機制和信號通路的改變[9]。已有研究顯示，高糖環境下，伴隨細胞穩態、酸堿平衡的紊亂，在細胞受到損傷過程中，細胞出現皺縮，電生理數據改變[10-11]，鉀、氯離子通道負載的離子出現外流現象。本研究結果顯示，對高糖處理后細胞內氯離子濃度明顯降低，表明氯離子流失，而應用黃芪甲苷后，氯離子流失減輕，表明黃芪甲苷可能通過氯離子通道減少氯離子流失[12]，減少HUVECs凋亡。

綜上所述，黃芪甲苷能夠通過ClC-3氯離子通道降低高糖誘導的HUVECs損傷；高糖誘導的HUVECs損傷過程中有胞內氯離子的外流，而黃芪甲苷能夠增加ClC-3氯離子通道的表達，并增加胞內氯離子濃度，黃芪甲苷通過ClC-3氯離子通道降低高糖誘導的HUVECs損傷，揭示黃芪甲苷降低高糖誘導HUVECs損傷的分子機制。