銀杏內酯B對心肌缺血再灌注損傷大鼠炎性因子、血管新生和認知功能的影響

張艷艷，柴麗娜

心肌缺血再灌注損傷是指心肌組織在長時間缺血后再恢復血液的灌流，但會出現更嚴重的心肌損傷和功能失常，主要現象為冠狀動脈血流量減少和血管反應性改變等[1]。近年來，高血壓、高脂血癥等疾病的發病率逐年提高，導致冠狀動脈粥樣硬化性心臟病以及引發的急性心肌梗死發病率也隨之增加，嚴重威脅人類的身心健康[2]。急性心肌梗死在心血管疾病中為高發病率和高死亡率的疾病之一，因此，心肌缺血再灌注損傷的關注度也逐年增加[3]。但心肌缺血再灌注損傷的病理機制極其繁雜，目前相關研究發現心功能異常、炎癥反應和血管新生等是其病程發生發展的關鍵病理機制。

炎癥反應是心肌缺血再灌注損傷的主要發病機制[4]。有關研究表明，急性心肌梗死會活化補體和產生自由基，引發梗死的心肌釋放炎性因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)[5]。TNF-α繼而刺激白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等其他促炎細胞因子。有研究表明促炎細胞因子IL-6和TNF-α是心肌功能障礙的關鍵損害因子。IL-6和TNF-α將進一步激發炎癥細胞黏附、浸潤到心肌，繼而阻塞毛細血管、血管活性物質和釋放細胞毒性成分[6]。有研究發現，缺血損傷后再灌注過程中炎癥反應處于升高水平，而阻斷炎癥反應將有利于心肌缺血再灌注病人的恢復[7]。血管新生可促進相應缺血組織周圍側支循環的建立，改善心肌缺血和壞死等，恢復心肌血流量，從而改善心肌缺血再灌注病人的療效和預后情況[8]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)為促血管生成因子，在血管新生的過程中起重要作用。有研究表明，在心肌缺血再灌注病人中，VEGF蛋白表達水平明顯降低[9]。

目前，心肌缺血再灌注的主要治療方式是溶栓和急診經皮冠狀動脈介入治療，均是心肌治療最實用和最廣泛的措施，但是療效均不盡如人意。銀杏內酯B是一種從銀杏葉中提取的活性物質，具有抗氧化、抗炎、促血管新生等生物學作用[10]。有研究表明，銀杏內酯B能保護和改善缺血模型損傷的腦細胞，緩解心臟毒性。因此，銀杏內酯B具有改善心肌缺血再灌注的神經保護作用[11]。本實驗通過建立心肌缺血再灌注大鼠模型并采用銀杏內酯B進行預處理，觀察其對大鼠心肌梗死面積，血清TNF-α、IL-6水平，VEGF蛋白表達水平以及認知功能的影響，以期為銀杏內酯B提供臨床用藥依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 隨機選取雄性健康Wistar大鼠80只，體重200～250 g，分為假手術組、模型組、銀杏內酯B低劑量組(低劑量組)、銀杏內酯B高劑量組(高劑量組)，每組20只。低劑量組、高劑量組大鼠分別在造模前灌胃銀杏內酯B 15 mg/kg、60 mg/kg，連續灌胃7 d，其他組大鼠灌胃同體積生理鹽水。參照相關文獻，采用冠狀動脈結扎法制備心肌缺血再灌注損傷模型[12]。戊巴比妥麻醉大鼠后，連接呼吸機和心電圖機，暴露心臟，剪開心包膜，于左冠狀動脈前降支起始部結扎，心肌顏色由紅變灰白，形成心肌缺血。心電圖為ST段抬高持續30 min后松結扎線，恢復冠狀動脈血流，心肌變為紅色，ST段回落，形成缺血再灌注。假手術組只穿線不結扎。

1.2 避暗實驗 采用避暗實驗評價大鼠的認知功能[13]。造模24 h后進行該實驗的適應性訓練，依次將大鼠頭朝外放入避暗箱的明室(無電擊)，按照大鼠的趨暗習性則會進入到暗室，但是進入到暗室的大鼠會受到0.5 mA、5 s的電擊，多次電擊后大鼠會產生記憶不進入到暗室，訓練期記錄大鼠進入暗室的潛伏期(Retention-1)。次日進行測試，依次觀察和記錄各大鼠進入暗室前的潛伏期(Retention-2，從大鼠放入明室到第1次進入到暗室并電擊的時間)和5 min內進入暗室的錯誤次數。行為學測試結束24 h后處死動物。

1.3 氮藍四唑染色法測定心肌梗死面積 行為學測試后，麻醉大鼠取出心臟，將大鼠心室平行切成厚度相等的5片，再加入0.1%氮藍四唑溶液中，37 ℃烘箱內染色15 min。染色后進行圖像采集，灰白色為梗死心肌，藍色為正常心肌。心肌梗死面積(%) = 梗死區面積/心室總面積×100%[14]。

1.4 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定炎性因子TNF-α和IL-6水平 取出備用的心肌組織解凍，吸干多余水分和雜質后，稱取重量；研磨后置于EP管中，4 ℃離心勻漿組織樣本，取上清液，再進行蛋白定量；根據試劑盒說明書將標準品分別稀釋為不同濃度；隨后將樣品依次加入樣品孔中，蓋上封板膜后37 ℃恒溫箱孵育；稀釋洗滌液進行洗滌，在各孔中加入酶標抗體，密封后進行孵育，再次重復上述洗滌過程；再加入顯色試劑，密封并避光孵育；孵育后再滴加終止液終止反應。用酶標儀檢測吸光度值，最后計算各標準曲線及各指標含量[15]。

1.5 蛋白質印跡法(Western Blot)測定VEGF蛋白表達水平 取大鼠腦組織備用，去掉多余組織殘渣和血水，依次稱重后按照說明書進行蛋白定量計算上樣量。根據目的蛋白的分子量配制分離膠，用37 ℃烘箱孵育，冷卻后加入濃縮膠插入齒梳，然后按照定量計算的上樣量進行上樣并電泳，再根據切膠轉膜，封閉2 h后室溫孵育一抗。次日進行洗滌，再室溫孵育二抗2 h，同上述洗滌后顯影成像，再進行灰度值掃描[16]。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積比較 與假手術組比較，模型組心肌梗死面積明顯增加(P<0.01)，經不同劑量銀杏內酯B治療后，低劑量組、高劑量組心肌梗死面積較模型組明顯縮小(P<0.05或P<0.01)，且高劑量組縮小更明顯。詳見表1。

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較(±s) 單位：%

2.2 各組炎性因子TNF-α、IL-6水平比較 與假手術組比較，模型組心肌組織炎性因子TNF-α和IL-6水平明顯升高(P<0.01)，經不同劑量銀杏內酯B治療后，低劑量組、高劑量組心肌組織TNF-α和IL-6水平較模型組明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且高劑量組降低更明顯。詳見表2。

表2 各組炎性因子TNF-α、IL-6水平比較(±s)

2.3 各組大鼠心肌組織VEGF蛋白表達水平比較 與假手術組比較，模型組心肌組織VEGF蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，經不同劑量銀杏內酯B治療后，低劑量組、高劑量組VEGF蛋白表達水平較模型組明顯升高(P<0.05)，且高劑量組升高明顯。詳見圖1。

A為假手術組；B為模型組；C為低劑量組；D為高劑量組。與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

2.4 各組大鼠的認知功能比較 訓練期各組大鼠Retention-1比較差異均無統計學意義(P>0.05)，表明在行為學實驗前各大鼠的基本狀態無區別。次日的測試期，與假手術組比較，模型組大鼠進入暗室前的潛伏期Retention-2明顯降低(P<0.01)，5 min內進入暗室的錯誤次數明顯增加(P<0.01)；經不同劑量銀杏內酯B治療后，低劑量組、高劑量組Retention-2較模型組明顯延長(P<0.05)，5 min內進入暗室的錯誤次數較模型組明顯減少(P<0.05)。詳見圖2～圖4。

圖2 各組大鼠Retention-1比較

與假手術組比較，* P<0.01；與模型組比較，# P<0.05。

與假手術組比較，* P<0.01；與模型組比較，# P<0.05。

3 討 論

心肌缺血后再灌注損傷指冠狀動脈部分或者是完全急性梗阻之后，在一定時間內又重新獲得再通的過程，雖然缺血的心肌能再恢復正常的灌注，但心肌組織損傷進一步加重[17]。腦血管疾病仍然是全球人群致殘和死亡的第三大原因，且發病率逐年增加[18-19]。心肌缺血再灌注損傷嚴重影響病人的臨床治療效果和預后情況，而且發生機制極其復雜，比如氧化應激、炎癥反應、血管新生等，多種發病機制互相聯系和影響，最終造成心肌功能障礙和認知功能障礙[20]。

炎癥細胞的聚集和炎性因子的釋放為心肌缺血再灌注損傷的關鍵步驟。在炎癥反應中，許多細胞因子得以釋放，如TNF-α、IL-6等促炎因子，而TNF-α是激發心肌缺血再灌注損傷炎癥反應的關鍵因子，可促進其他促炎細胞因子IL-6等的釋放，也可誘發細胞黏附分子，導致急性心肌組織損傷[21]。另外，TNF-α也參與血管重構、阻礙心肌收縮，損害心肌功能。本實驗結果同樣顯示，模型組心肌梗死面積和炎性因子TNF-α、IL-6水平明顯高于假手術組(P<0.05)。血管新生是指從已存在的血管網中新生長出來的過程。VEGF是一種特異性的肝素結合生長因子，也是血管新生的關鍵因子，主要生物學作用為誘導血管新生。有研究表明，VEGF在體內可增加內皮的通透性，誘導血管的生成，也是一種重要的血管生成活性物質[22]。在缺血性腦血管相關疾病的血管新生治療和預后中，VEGF發揮重要作用[23]。有研究表明，VEGF能修復和改善缺血再灌注損傷后的血管新生和腦神經保護[24]。本實驗結果顯示，模型組VEGF蛋白表達水平和認知功能明顯低于假手術組(P<0.05)。

銀杏內酯是中藥銀杏葉中的關鍵活性物質之一，主要包括銀杏內酯A、B、C、M和白果內酯，均是血小板活化因子受體拮抗劑，具有抗氧化、抗炎、抗過敏、促血管新生、促學習記憶等多種生物學作用[25]。大量研究發現，銀杏內酯B可清除缺血再灌注損傷中的自由基，降低微血管張力，縮小梗死面積[26-27]。本實驗結果顯示，心肌缺血再灌注大鼠經低、高劑量銀杏內酯B治療后，心肌梗死面積和TNF-α、IL-6水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，VEGF蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，認知功能障礙明顯改善(P<0.05)，但是高劑量銀杏內酯B療效更好。

綜上所述，銀杏內酯B可明顯改善心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌梗死面積和認知功能，其機制可能與降低炎癥反應和促進血管新生有關，這可能是銀杏內酯B治療心肌缺血再灌注損傷疾病的重要分子機制之一，但是高劑量銀杏內酯B療效更明顯。