心房顫動病人射頻消融前后miRNA-328、miRNA-223表達與預后的關系

肖金平，付景秋，李小雷，陳 俊

心房顫動是臨床常見的一種心律失常，成人發病率為0.3%左右，60～74歲老年人發病率高達8.0%左右[1]。隨著心力衰竭、糖尿病、高血壓等危險因素的增加，心房顫動患病率越來越高。男性發生心房顫動的危險是女性的1.5倍左右，心房顫動不但可加重原有心臟疾病，還可引起血栓形成和栓塞，比如腦栓塞、肢體動脈栓塞等嚴重并發癥，增加病人的死亡率和致殘率[2-3]。心房顫動的病因與發病機制多樣，包括自主神經系統、電重構、解剖重構、局灶觸發及多子波折返、腎素-血管緊張素-醛固酮系統等[4]。在治療中，由于發病機制沒有得到明確闡述，為此無論是藥物、射頻消融、外科手術、植入式心房除顫器、雙心房起搏等手段，對心房顫動的復律、竇性心律維持的預防和治療都無根治性效果[5]。但射頻消融造成心肌熱損傷，產生瘢痕組織，成為心肌電傳導的絕緣帶，可以替代心房切割-縫合，使手術操作過程簡化，可能有更好的預后效果[6]。miRNA是一種基因表達調控因子，從理論上來講，miRNA若將心房顫動電重構與結構重構相關的蛋白基因作為靶基因，則就與心房顫動形成及持續存在相關性。近年來研究發現，miRNA參與調控心房顫動時心肌組織的電重構、離子重構和結構重構，其涉及的機制包括細胞內鈣超載、心房局部腎素-血管緊張素系統激活、心房肌組織纖維化、通道和受體蛋白的改變、鈣依賴性中性蛋白酶變化等[7]。miRNA通過多途徑參與上述因素的調節，最后表現為促心房顫動或抗心房顫動、促凋亡或抗凋亡等[8]。本研究觀察心房顫動病人射頻消融術前與術后相關miRNA表達水平變化，了解射頻消融術對心房顫動相關因子miRNA表達的影響，進一步分析心房顫動病人射頻消融術前后miRNA表達的影響與預后相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年9月—2018年5月在我院心內科住院的心房顫動病人62例。納入標準：心電圖確診為心房顫動，既往有確切的心房顫動病史；合并二尖瓣關閉不全；存在二尖瓣置換術適應證(瓣葉穿孔、腱索斷裂、成形手術難以完全矯正或成形手術失敗)；未治療狀態下坐位時血壓≥140/90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)；年齡20～80歲；病人知情同意本研究并簽署知情同意書；預計生存期大于3個月。排除標準：合并惡性腫瘤、近期感染、結締組織病、自身免疫性疾病及嚴重腎功能不全病人；妊娠期間出現心房顫動等。62例病人中男32例，女30例；年齡28～74(56.34±4.19)歲；吸煙34例；左房內徑(56.35±8.45)mm；心胸比0.63±0.05；左室射血分數0.56±0.07；合并疾病：冠心病22例，糖尿病21例，高血壓34例，風濕性心臟病11例；舒張壓(73.45±8.21)mmHg，收縮壓(130.24±13.98)mmHg；疾病類型：按照2006年《美國心房顫動治療指南》分類為陣發性心房顫動30例，持續性心房顫動20例，長期持續性心房顫動12例。

1.2 治療方法 所有病人在二尖瓣置換術同期直視下進行射頻消融術治療，選擇Stockertep Shuttle射頻消融儀和CRTO快速三維心內膜電解剖標測系統。術前常規進行全身檢查與生命體征的檢測，了解肺靜脈解剖、肺靜脈走行、肺靜脈開口位置與左心房的關系。病人局部麻醉下穿刺左鎖骨下靜脈及右股靜脈，常置10極冠狀靜脈竇電極導管，穿刺房間隔2次并保留鞘于左心房，靜脈注射肝素。經長鞘將7.5F四極冷鹽水灌注導管送入左心房，造影定位肺靜脈開口，行雙側環肺靜脈線性消融及左房附加線性消融。消融參數：冷鹽水流量17 mL/min；消融能量30～35 W，消融時間30～45 s，上限溫度45 ℃，消融終點為兩側肺靜脈實現電學隔離。

1.3 樣本采集 收集病人住院期間血清及右心房心肌組織，采用無菌注射器抽取病人8 mL靜脈血，在室溫下進行低速離心5 min，將上層血漿提取出來，將血漿保存于-80 ℃冰箱中。同時所有病人術中取右心耳心肌組織約200 mg，清洗干凈后心肌組織立即置于液氮中，取適量心肌組織予10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋待用。

1.4 miRNA表達檢測與HE/Masson染色 采用QIAGEN公司的miRNeasy Mini Kit試劑盒對抽取的血漿提取總RNA，通過miRNA數據庫查找所要研究的miRNA-328和miRNA-223的序列。逆轉錄成cDNA后進行實時熒光定量RT-PCR反應，嚴格按照Access RT-PCR System試劑盒說明書在生物安全柜中配制qRT-PCR反應體系進行操作，內標采用U6標準誤。固定的石蠟心肌組織進行蘇木精-伊紅(HE)染色，4 μm切片后采用二甲苯脫蠟，接著各級乙醇至水洗，選取蘇木精或Masson進行5 min染色，鹽酸乙醇30 s分化，伊紅15 s復染，采用無水乙醇進行脫水，然后二甲苯透明及中性樹膠進行封固，在400倍光鏡下觀察。

1.5 預后觀察 觀察病人術后竇性心律轉復情況(跨二尖瓣、三尖瓣血流A峰流速若>10 cm/s)，同時觀察與記錄手術前后的左心室舒張末期內徑、左房直徑與左室射血分數。

2 結 果

2.1 預后情況 62例病人射頻消融術后竇性心律轉復51例，轉復率為82.3%。超聲檢查顯示，術后病人左心室舒張末期內徑、左房直徑均較術前降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 心房顫動病人手術前后超聲指標變化(±s)

2.2 miRNA-328、miRNA-223相對表達量 射頻消融術后病人miRNA-328和miRNA-223相對表達量均低于術前，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 心房顫動病人手術前后miRNA-328、miRNA-223相對表達量比較(±s)

2.3 心肌組織病理改變 心房顫動病人心肌組織HE染色顯示，心肌細胞變大，細胞核明顯增大，以及肌束明顯增粗，心肌細胞的排序比較紊亂。Masson染色切片可見心肌細胞染色呈紅紫色，細胞走行不一，大小不均，心肌細胞增大。詳見圖1、圖2。

圖1 HE染色心肌組織病理切片(×100)

圖2 Masson染色心肌組織病理切片(×400)

2.4 預后轉復率與各因素的相關性分析 以全體研究對象進行分析，以預后轉復率水平為應變量，以性別、年齡、合并疾病、疾病類型、吸煙行為、超聲指標、心胸比、miRNA表達、收縮壓、舒張壓、其他危險因素為自變量，進行多元線性回歸顯示，miRNA-328和miRNA-223相對表達量、左房直徑與舒張壓為影響預后轉復率的獨立危險因素(P<0.05)。詳見表3。

表3 心房顫動病人預后轉復率與各因素的相關性分析

3 討 論

心房顫動是最常見的心律失常之一，其發病率隨著年齡增加而增加。引起心房顫動的病因復雜多樣，因為它是心腦血管病的潛在并發癥，所以受到臨床高度關注及深入研究，但當前病理機制還不夠明確。研究顯示，心房顫動時心排血量減少≥25%[9]；無瓣膜病合并心房顫動較無心房顫動者腦卒中發生概率高5～7倍，腦栓塞發生率相對較高。心房顫動病理解剖學的基質為心房擴大與心房纖維化，在早期，表現出離子通道特征與電重構發生變化，心房纖維化形成在心房顫動心房結構重構改變起重要作用，最終促進心房顫動的發生與維持。本研究中心房顫動病人的心肌組織HE染色顯示心肌細胞變大，細胞核明顯增大，以及肌束明顯增粗，心肌細胞的排序比較紊亂；Masson染色切片可見心肌細胞染色呈紅紫色，細胞走行不一，大小不均，心肌細胞增大。

現代研究表明，心房顫動是由多種因素共同作用而產生的一種心律失常，具有多階段特征，其發病因素包括電生理重構、自主神經系統失調、炎癥和氧化應激、結構重構、鈣離子穩態失調等，而心房結構重構是重要因素，特別是左心房大小是發生心房顫動的獨立危險因素，在短時間內快速進行心房起搏，能夠導致犬心房進行結構重構、收縮重構以及電重構[10-11]。

近年來，隨著醫學技術的發展，射頻消融技術得到了廣泛應用。本研究62例病人進行射頻消融術后竇性心律轉復51例，轉復率為82.3%，術后病人的左心室舒張末期內徑和左房直徑均低于術前(P<0.05)。之所以取得良好的臨床效果，不僅與嚴格病例選擇有關，同時也與射頻裝置不斷革新相關，射頻裝置的優點為可以透壁，避免局部溫度升高太多，使得射頻的熱能穿透心房組織4 mm左右，避免在空白期內心房顫動的復發，改善病人遠期預后。

miRNA是新發現的一類內源性非編碼RNA，轉錄后對靶基因的mRNA分子進行調節，從而參與到多種生理病理過程[12]。現階段，miRNAs被當作生物標志物，廣泛運用于肌肉損傷等不同研究領域，能夠對心肌電重構產生影響，如miRNA-133、miRNA-1通過對鉀通道基因表達進行調節，可能對心臟電活動傳導及節律產生影響，miRNA-27等參與鈣通道的調節[13]。近年來，miRNA和心房顫動發生及維持存在密切關系，miRNA對靶基因進行調節，從而參與到心肌活動中[14]。miRNA通過對編碼心房顫動電重構和結構重構基因調節，參與心房顫動的發生和維持，早期先是電生理及離子通道特征發生改變，然后出現抗凋亡或促凋亡、抗心房顫動或促心房顫動等作用[15]。

研究表明，miR-328水平與L型鈣通道蛋白亞基之間存在負相關，miR-328可以發揮促心房顫動作用，當前治療心房顫動的一個有效策略是對miR-328進行抑制[16]。比如說miRNA-29能夠對膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ以及纖維素蛋白進行調控，從而引起心房纖維化，出現結構重構，最終引發心房顫動[17]。當心房顫動發生時，miRNA-1能夠對鉀通道產生影響，進而影響機體心肌細胞膜的電位水平，從而在心房的電重構中發揮作用[18]。本研究結果顯示，射頻消融術后病人miRNA-328和miRNA-223相對表達量均低于術前(P<0.05)。有研究顯示，可能是miRNA-328和miRNA-223過表達降解正常膠原組織，刺激心房間質肌結締組織、纖維組織增生，從而導致心房的擴大和心肌纖維化，形成心房顫動的易感基質[19]。本研究多元線性回歸顯示，miRNA-328和miRNA-223相對表達量、左房直徑與舒張壓為影響心房顫動病人預后轉復率的獨立危險因素(P<0.05)。即左房內徑越大，血壓越高，miRNA-328和miRNA-223表達量越高，預后就越差。miRNA-328和miRNA-22也可以通過多種途徑參與心肌纖維化，心肌細胞拉長、變細，導致左心房增大。

總之，射頻消融術治療心房顫動有很好的轉復效果，miRNA-328和miRNA-223表達增加可能有助于臨床心房顫動的預后評估。