紫朱軟膏對急性創面愈合過程中IL-1β、MMP-9和TGF-β的作用及自噬相關性研究

胡嘯明,黃仁燕,韓強,嚴仕夢,柳國斌*

(1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院中醫血管外科，上海 201203;2.上海交通大學生命科學技術學院,上海 200240)

創面修復是臨床上外科醫生經常面對的難題之一，隨著醫學技術的發展，急性創面一般預后較好，但常因治療不當或患者基礎疾病的原因，易遷延形成慢性難愈性創面，少數有癌變可能。因此，早期急性創面的處理至關重要。

已有研究提示在創面愈合過程中，細胞的自噬水平呈動態變化，決定創面最終的轉歸。現代基礎醫學的不斷發展，使我們對外科創面愈合機制的認識深入到了細胞與分子水平，從而為指導臨床治療提供了有力的支撐。前期臨床實踐中發現，中藥外用制劑的有效應用，能促進創面快速愈合，尤其在慢性難愈性創面中優勢明顯。因此，本研究觀察以“清熱祛腐生肌法”組方的中藥紫朱軟膏對急性創面愈合的療效、作用機制以及自噬和創面愈合的相互關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

選取雄性SPF級SD大鼠30只，體質量(250±20)g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產許可證號SCXK(滬)2012-0002，飼養在上海中醫藥大學實驗動物中心，常規飲食進水，飼養環境：溫度: 20～25℃，相對濕度40%～50%，光照周期12 h/日。

1.1.2 藥物與試劑

紫朱軟膏(100 kg生產處方量包括生藥朱砂3.5 kg，紫草1.5 kg，龍血竭3 kg，黃芪1.5 kg，阿膠2.5 kg，冰片0.5 kg,輔料白凡士林、羊毛脂、泊洛沙姆等共87.5 kg)為院內經驗方，委托馬應龍藥業集團股份有限公司按照制作工藝和質控標準生產。生理鹽水，四川科技藥業股份有限公司。4%多聚甲醛、蘇木精染液、1%伊紅酒精溶液，國藥集團(滬試)，2.5%戊二醛、丙酮、3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛，上海生工生物工程技術有限公司。PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)，碧云天生物工程有限公司，PrimeScriptTM RT reagent Kit(for real time)、SYBR?Premix Ex Taq?II (Tli RNaseH Plus)，日本TAKARA公司，Beclin-1、LC3、IL-1β、MMP-9、TGF-β一抗和GAPDH，美國Sigma公司。

1.1.3 儀器

EG1160包埋機、石蠟切片機、HI1120水平式烘干儀(型號：德國Leica)，正置顯微鏡(型號：日本Olympus)，透射電子顯微鏡(型號:荷蘭FEI Tecnai G2 Spirit TEM)，電泳儀(型號：EPS 300，上海)，微型垂直電泳槽(型號：VE 180，上海)，熒光化學發光成像系統(型號：ChemiQ4600，上海)，熒光定量PCR儀(型號：瑞士羅氏LightCycler?96)。

1.2 造模與分組

實驗動物適應性飼養3 d，第4天進行造模。①麻醉：10%水合氯醛腹腔內注射，每只劑量標準3 mL/kg；②脫毛：后背部6×4 cm2范圍(后脊正中線兩側各延伸3 cm；③制作皮膚創面：以后脊正中線旁開2 cm，用皮膚打孔器(規格內徑12 mm)于脫毛區域鉆孔，順鐘向旋轉，待皮膚分離，用眼科剪配合連帶皮下筋膜一并剪去，止血。造模成功后，大鼠按體質量編號，生成隨機數字表，隨機分為對照組和治療組，每組 15只。

1.3 干預

治療組給予紫朱軟膏按0.032 g/cm2比例外用換藥，1次/d；對照組給予生理鹽水外用換藥，1次/d；觀察周期21 d。

1.4 檢測指標與方法

在創面形成后1 d、4 d、7 d、14 d和21 d共5個時間點，每個時間點每組各取3只大鼠，分別進行指標檢測。

1.4.1 創面愈合率

將數碼相機(5D Mark III，Canon公司，日本)采集的圖片導入計算機，選出最清晰圖片，用Image-Pro Plus Version 6.0軟件計算4、7、14、21 d創面面積，再計算創面愈合率[1],創面愈合率=(原始創面面積-未愈合創面面積)/原始創面面積×100%。

1.4.2 組織學觀察

剪取創面組織標本，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察創面組織形態[2]。

1.4.3 自噬體觀察

2.5%戊二醛固定，丙酮脫水、包埋、固化、超薄切片機切成50～60 nm切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察兩組大鼠在各時相點的創面組織細胞的自噬體形態、結構[3]。

1.4.4 Western Blot法檢測目的蛋白

取大鼠皮膚創面組織50 mg，加入適當量的裂解液，比例為1∶100，充分裂解后，11 000 r/min的4 ℃離心機離心10 min，取上清。按照BCA定量法計算出蛋白濃度，補充適量RIPA液，加入 loading buffer，使各個樣本等體積等量上樣，煮沸5 min使蛋白變性。50 μg上樣量，用15%分離膠使蛋白分離，半干轉膜200 mA，1 h使蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜( 一抗稀釋比例1∶1 000，β-actin作為內參) ，二抗(稀釋比例1∶1 000)常溫孵育30 min，暗室發光，顯影，洗片。拍照，用Image J軟件計算灰度值并進行分析。

1.4.5 RT-PCR法檢測目的基因

取大鼠皮膚創面組織100 mg置于研缽中，加入500 μL TRIzol試劑及100 μL氯仿提取總RNA，應用Prime ScriptTM RT試劑盒進行逆轉錄制備cDNA。以GAPDH為內參進行熒光定量PCR擴增以檢測各組大鼠皮膚創面組織中Beclin-1、LC3、IL-1β、MMP-9和TGF-β mRNA的表達水平。擴增引物由美國Thermo Fisher Scientific公司合成，引物序列見表1。反應條件：50 ℃預處理2 min，循環1次；95 ℃預變性30s，循環1次；95 ℃變性5 s，循環40次；60 ℃退火34 s，循環40次；72 ℃延伸30 s，循環40次。各組均設3個復孔。以2-ΔΔCt法表示各目的基因的相對表達量。

表1 引物信息

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 創面愈合率

4 d，兩組組創面逐漸縮小，無明顯液性滲出。7 d時，兩組創面邊緣區域部分已結痂，逐漸向中心靠攏，紫朱軟膏組創面愈合率達到45%，兩組有統計學差異(P<0.01)。14 d時，兩組創面面積縮小明顯，愈合面積過半，具有統計學差異(P<0.01)。21 d時，紫朱軟膏組已基本愈合，愈合率達到 98%，高于對照組，且有統計學差異(P<0.01)。見表2、圖1和圖2。

表2 兩組創面愈合率的比較

圖1 兩組創面愈合情況

圖2 兩組創面愈合率比較

2.2 組織學觀察

7 d時，與對照組相比，紫朱軟膏組有較多成熟肉芽組織和新生毛細血管；14 d時，紫朱軟膏組初步形成毛細血管網，上皮組織可見排列較整齊的膠原纖維組織，而對照組上皮組織間隙較多，未見成熟的膠原纖維；21 d時，紫朱軟膏組形成規則的毛細血管網，一定數量的腺體結構，而對照組相對較少(見圖3)。

圖3創面組織HE染色(×100)

2.3 自噬體觀察

透射電鏡拍照結果如下圖所示，7 d時，可以看出NS組出現自噬現象，細胞核染色質開始凝集，核膜有凹陷，胞漿中出現有多層膜或雙層膜包繞的泡狀結構即自噬泡；14 d時,NS組自噬現象明顯比7 d時有所增加。相同時相點，紫朱軟膏組細胞核染色質凝集現象明顯，核染色質在核質中呈塊狀凝集，大小不等地分散于核質內，但自噬泡均較對照組明顯減少(見圖4)。

圖4 創面組織內自噬體的電鏡觀察(Bar=2 μm),紅色箭頭所示為自噬體

2.4 Beclin-1 、LC3、IL-1β、MMP-9和TGF-β蛋白的檢測

對照組14 d時Beclin-1 、LC3蛋白的表達要高于前一時間點7 d，有統計學差異(P<0.05)；MMP-9蛋白的表達在不同時間點有統計學差異(P<0.05)，7 d<14 d<21 d；各時相點IL-1β蛋白的表達有統計學差異(P<0.05)，7 d>14 d>21 d。相同時間點，紫朱軟膏組Beclin-1 、LC3、IL-1β蛋白的表達要弱于對照組，有統計學差異(P<0.05)，MMP-9和TGF-β的表達要強于對照組，有統計學差異(P<0.05)(見表3、圖5)。

表3 兩組創面目的蛋白的表達比較

注:Z指紫朱軟膏，N指生理鹽水。圖5 兩組創面LC3、Beclin-1、IL-1β、MMP-9和TGF-β蛋白的表達

2.5 Beclin-1、LC3、IL-1β、MMP-9和TGF-β基因的檢測

2.5.1 各時相點Beclin-1、LC3、IL-1β、MMP-9和TGF-β mRNA的表達變化

對照組各時相點Beclin-1、LC3、MMP-9和TGF-β mRNA的表達有統計學差異(P<0.05)，7 d<14 d<21 d；IL-1β mRNA的表達在不同時相點有統計學差異(P<0.05)，7 d>14 d>21 d。4 d時，紫朱軟膏組LC3 、TGF-β mRNA的表達要弱于對照組，有統計學差異(P<0.05)，MMP-9 mRNA的表達要高于對照組，有統計學差異(P<0.05)；7 d時，紫朱軟膏組IL-1β、TGF-β mRNA的表達要弱于對照組，有統計學差異(P<0.05)，紫朱軟膏組MMP-9 mRNA的表達要高于對照組，有統計學差異(P<0.01)；14 d時，紫朱軟膏組Beclin-1、TGF-β mRNA的表達要弱于對照組，有統計學差異(P<0.01)，紫朱軟膏組MMP-9 mRNA的表達要高于對照組，有統計學差異(P<0.05)；21 d時，紫朱軟膏組IL-1β mRNA的表達要弱于對照組，有統計學差異(P<0.01)，紫朱軟膏組MMP-9、TGF-β mRNA的表達要高于對照組，有統計學差異(P<0.05)(見表4)。

表4 兩組創面目的基因的表達比較

2.5.2 各時相點IL-1β、MMP-9和TGF-β和自噬基因LC3 mRNA表達變化的相關性

創傷14 d時，IL-1β表達量與LC3顯著正相關(r=0.953，P<0.01)；創傷4 d和14 d時，MMP-9表達量與LC3顯著負相關(4 d：r-0.916，P=0.01；14 d：r=-0.756，P=0.019)。創傷4 d、7 d和21 d時，TGF-β表達量與LC3顯著負相關(4 d：r=-0.911，P=0.001；7 d：r=-0.862，P<0.03；21 d：r=-0.860，P=0.03)(見圖6～8)。

圖6 各時相點LC3與IL-1β的相關性分析

圖7 各時相點LC3與MMP-9的相關性分析

圖8 各時相點LC3與TGF-β的相關性分析

3 討論

在自噬和創面愈合關系的各種研究中結果顯示其具有一定的關聯性，在燒傷創面中，Beclin-1自噬相關基因高表達，增加自噬活性有利于創面愈合[4]。然而，同時也存在過度的自噬活性表達導致創面愈合延遲的情況。在多項涉及患者或大鼠模型實驗的研究中[5-7]，應用自噬誘導劑雷帕霉素，機體最終出現創面延遲愈合。目前，幾種小分子調節劑如雷帕霉素、海藻糖、鋰和利美尼定參與了自噬途徑，已經確定能夠調節自噬活性。然而，這些調節劑在臨床上的應用仍然有限。常見的雷帕霉素的自噬誘導過程相對緩慢，具有較長的間接作用時間，而且其作用始終是暫時的[8]。因此，尋找新的理想自噬調節劑在臨床上具有重要的應用價值。

中醫藥在治療創面愈合方面具有顯著優勢，且多項研究顯示中醫藥對自噬具有調節作用[9-12]。中醫認為創面的主要病理因素責之于“熱”“瘀”“虛”，病機為“因虛致瘀、瘀久化熱、熱盛肉腐”，因此以“補氣化瘀、清熱解毒、化腐生肌”理論來指導創面的治療[13]。創面愈合不良的因素往往是炎癥反應過激及相關生長因子分泌不足，而清熱祛瘀生肌中藥具有調節炎癥反應、促進生長因子生成的作用[14-16]。紫朱軟膏是以“清熱祛腐生肌法”組方，借鑒我國著名中醫外科大家奚九一教授的經驗方“撈底膏”，在前期研究的基礎上進一步優化形成的經驗方，全方以朱砂、紫草為君，其中朱砂具解毒祛腐之功；紫草有涼血活血之效，兩君相得益彰，共湊清“熱”解毒、祛腐化“瘀”之效；黃芪味甘性微溫，為補氣生肌之要藥，托毒退腫之上品，阿膠、血竭同為甘平之品，均有補血生肌之功，其中阿膠補血滋陰俱佳，血竭為治療潰瘍不斂之要藥，三者共為臣藥，補氣血之“虛”；佐以冰片，味辛，通透肌腠以助藥效，有效的針對了“熱”“瘀”“虛”病理因素。在本研究中，與對照組比較，紫朱軟膏組愈合率高，愈合時間短，創面血管新生、再上皮化速度快，體現出了較好的療效。

創面修復是一個連續復雜的過程，主要包括炎癥階段、增殖階段、組織重塑階段3個密切聯系、交互重疊的階段。在此過程中，細胞的自噬水平呈動態變化。在本研究中，14 d時電鏡觀察創面自噬現象明顯比7 d時有所增加，相同時相點，紫朱軟膏組自噬泡均較對照組明顯減少；各時相點自噬基因Beclin-1和LC3的表達隨時間逐漸升高，相同時相點，紫朱軟膏組Beclin-1和LC3的表達要弱于對照組，說明紫朱軟膏組可能通過抑制細胞的自噬活性從而促進創面的愈合。

而在創面愈合的各個階段，自噬發揮的作用有所不同：①炎癥階段，自噬具有調節炎癥反應的作用，適度的炎癥反應有利于去除異物、細菌和受損組織以防止加重感染，過度持續性、慢性炎癥反應會造成創面愈合障礙。自噬可通過調節促炎與抑炎因子的表達，使創面炎癥反應趨于平衡，有利于創面修復。自噬體將細胞質成分傳遞給溶酶體進行降解，而炎癥小體是受感染或應激激活的分子平臺，這些分子平臺調節白介素1β(IL-1β)和IL-18等的成熟。SHI等[17]數據表明自噬伴隨著炎癥小體活化，活性炎癥小體消除可緩解炎癥。本研究中，IL-1β 表達量與LC3顯著正相關，說明自噬活性增強會加重炎癥反應。同一組別IL-1β的表達隨著時間變化逐漸下降，而兩組同一時相點，紫朱軟膏組IL-1β的表達要弱于對照組，表明紫朱軟膏組可以抑制過度的炎癥反應。②增殖(血管新生和上皮化)階段，氧化應激會引起局部代謝產物堆積和營養物質匱乏，導致機體進一步損傷，自噬在增殖階段發揮抗氧化應激作用，通過控制對氧化應激的適應性反應來減少細胞凋亡，促進細胞遷移、增殖和分化。LONG等[18]人的研究表明，誘導降低氧化應激水平，可調節基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的遷移和增殖相關基因的表達。巨噬細胞對于創面修復至關重要，LIAO等[19]研究顯示上調自噬水平，通過MAPK1/3磷酸化途徑增加MMP9的活性可促進巨噬細胞的遷移。本研究中， MMP-9 表達量與LC3顯著負相關，細胞自噬活性增強減少了MMP-9的表達，與既往研究不盡相同。同一組別MMP-9的表達隨時間逐漸升高，而兩組同一時相點，紫朱軟膏組MMP-9的表達要強于對照組，表明紫朱軟膏組表現出更好的血管新生、上皮化能力。③組織重塑階段，主要涉及成纖維細胞(FB)的過度增殖以及細胞外基質(ECM)的沉積，自噬可通過調控FB的凋亡和ECM的合成與降解來促進組織瘢痕的重建。轉化生長因子β(TGF-β)是創面修復中的重要信號分子，可調節各種類型細胞的增殖、分化和死亡，其參與膠原及細胞外基質的合成與降解，TGF-β與瘢痕愈合有關，可誘導體內各種組織纖維化反應等[20]。DING等[21]研究表明，LC3缺乏誘導自噬水平降低可引起促纖維化因子TGF-β的升高，從而導致膠原沉積的增加和成熟，加速纖維化進程。本研究中，TGF-β表達量與LC3顯著負相關，細胞自噬活性減弱有利于TGF-β的產生；而同一組別TGF-β的表達隨時間逐漸升高，兩組同一時相點，紫朱軟膏組TGF-β的表達要強于對照組，表明紫朱軟膏組更易誘導組織纖維化形成瘢痕。

本研究結果表明，紫朱軟膏的作用機制可能是在創傷修復過程中抑制細胞的自噬活性，通過下調IL-1β的表達抑制炎癥反應，上調MMP-9和TGF-β的表達促進血管新生、組織纖維化，從而達到創面愈合的目的。相關研究結果顯示，IL-1β能通過增強MMP-9 mRNA的穩定性，進而介導MMP-9的高表達[6]。也有研究表明，MMP-9可通過其水解作用使TGF-β轉變為活性狀態[22]。MMP-9可能在創面修復自噬機制中承擔著關鍵角色，有可能成為潛在的治療靶點，但有待進一步深入研究證實。