基于丁香苦苷抗菌藥效研究的丁香葉質量標志物指認

張喜武，楊斯棋，李永吉，劉振強，朱健，張麗麗，竇金金

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

丁香葉為木犀草科植物[1]，味苦、性寒為東北地區特色藥材[2]，有清熱燥濕、解毒、消炎、利濕退黃之功效[3]。藥用價值早在民間就已被認知是一味極具開發潛力的中藥，常用于治療腹瀉、爆發性火眼膜炎以及黃疸型肝炎等疾病[4]，體內外都具有較好的抗菌作用[5]。以丁香葉為原料的炎立消膠囊以及片劑等劑型具有很好的抗菌、抗病毒、抗炎作用[6-7]，也有較多文獻報道，但究竟是何種成分發揮著抗菌、抗病毒、抗炎作用目前尚不明確，雖有少數綜述報道丁香苦苷有可能成為其有效成分，但又都缺乏其抗菌的實驗數據。因此，本課題組在明確了丁香苦苷具有抗乙肝病毒作用[8]的研究基礎上，又進行了抗菌的實驗研究，進而深入挖掘丁香苦苷的藥效作用，明確丁香苦苷在丁香葉成分中的藥效學位置，為丁香苦苷成為丁香葉的質量標志物奠定研究基礎。

1 實驗材料

1.1 藥品

丁香葉2017年9月采于哈爾濱，經黑龍江中醫藥大學王振月教授鑒定為木犀科Oleaceae丁香屬Syringa植物紫丁香SyringaoblataLindl.的干燥葉，樣品保存于黑龍江中醫藥大學藥學院(20170918)。丁香苦苷原料實驗室自制；丁香苦苷對照品(實驗室自制，經面積歸一化法測定純度大于98%)；炎立消膠囊(哈爾濱華瑞生化藥業有限公司，批號：20180504)；炎可寧片(吉林敖東延邊藥業股份有限公司，批號：20180307)；頭孢克肟膠囊(哈爾濱三精海靈藥業有限公司，批號：20180413)；黃連素片(安徽國森藥業有限公司，批號：20180520)；雙黃連口服液(哈爾濱中藥二廠，批號：20180619)。

丁香苦苷的制備：取丁香葉10 kg，加8倍量水煎煮2次，合并水煎液，濃縮，上HPD 500大孔吸附樹脂柱，分別用水、30%(v/v)乙醇、50%(v/v)乙醇洗脫，收集50%(v/v)乙醇洗脫部分。50%(v/v)乙醇洗脫液，減壓回收乙醇后，水定容至一定體積，乙酸乙酯萃取3次，回收溶劑，冷凍干燥，得丁香葉提取物[9]。丁香葉提取物經硅膠柱色譜(CHCl3-MeOH梯度洗脫)分離，分別得到A、B、C、D四組分。組分C再用硅膠柱色譜(CHCl3-MeOH梯度洗脫)分離，獲得丁香苦苷原料。

1.2 主要試劑

10%水合氯醛(北京化工二廠，批號：20180521)，分析純10%福爾馬林(北京化工二廠，批號：20180518)，MH肉湯培養基(北京奧博星生物技術有限公司，批號：20180811)營養瓊脂(北京奧博星生物技術有限公司，批號：20180812)。

1.3 菌株

ATCC25923金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、ATCC25922大腸桿菌(Escherichiacoli)、ATCC27853銅綠假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、購于黑龍江省農科院；ATCC51210福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)、ATCC51203宋內氏志賀氏菌(Shigellasonnei)、ATCC51054痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)、ATCC26104白色葡萄球菌(Staphylococcusalbus)、ATCC49103變形桿菌(Proteusbacillusvulgaris)、ATCC46114肺炎桿菌(Pneumobacillus)，購于中國食品藥品檢定研究院。

1.4 主要儀器

DHP-9272型電熱恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司)，DHC-1300ⅡA/B型生物潔凈柜(蘇州凈化設備有限公司),ZDX-35B型電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠)。

2 實驗方法

2.1 定性鑒別

取適量丁香苦苷對照品，加甲醇溶解，制成0.02 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。另取丁香苦苷原料藥(20180501)適量，加甲醇溶解，制成0.1 mg·mL-1的溶液，作為供試品溶液。按照高效液相色譜法(《中國藥典》2015年版一部附錄ⅤD)試驗文獻，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；柱溫30 ℃；以甲醇-水(50∶50)為流動相；檢測波長為221 nm ；流速為1 mL·min-1。取供試品溶液、對照品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄主峰的保留時間。

2.2 倍比稀釋法

采用二倍稀釋法，用微量加樣器將MH肉湯培養基100 μL加到96孔板第2～8孔中，第1孔不加。取滅菌藥液100 μL加到第1孔及第2孔中，從第2孔開始將藥液和MH肉湯充分混勻后吸取100 μL加到第3孔中充分混勻后再吸取100 μL加到第4孔中，如此反復，依次稀釋至第8孔，混勻后吸取100 μL棄去。每孔分別加入106CFU/mL的菌液100 μL。同時設有不加菌的樣品對照孔和不加樣品的菌液生長對照孔。置37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，觀察有無細菌生長，按照上述操作流程重復做3次平行實驗。

2.3 打孔法

將未稀釋前的菌液(即含菌量為5×107～5×108CFU/mL)用棉簽均勻涂布在MH瓊脂培養皿上，然后用滅菌的6 mm打孔器在MH瓊脂上均勻地打6個孔，每孔注入50 μL的供試藥物，(各藥物濃度為：丁香苦苷原料200 mg·mL-1，炎立消膠囊200 mg·mL-1，炎可寧片200 mg·mL-1，頭孢克肟膠囊128 μg·mL-1，黃連素片100 mg·mL-1，雙黃連口服液用原液。37 ℃培養，18 h取出，測定抑菌環直徑，按照上述操作流程重復做3次平行實驗，抑菌環直徑取其平均值。

2.4 體外殺菌實驗

采用二倍稀釋法，用微量加樣器將MH肉湯培養基100 μL加到96孔板第2～8孔中，第1孔不加。取滅菌丁香苦苷藥液100 μL加到第1孔及第2孔中，從第2孔開始將藥液和MH肉湯充分混勻后吸取100 μL加到第3孔中充分混勻后再吸取100 μL加到第4孔中，依次稀釋至第8孔，混勻后吸取100 μL棄去。每孔加入106CFU/mL的菌液100 μL，置37 ℃恒溫培養箱中培養24 h。按照上述方法再進行炎立消膠囊、炎可寧片、頭孢克肟膠囊、黃連素片、雙黃連口服液對照藥物96孔板實驗，實驗結束后觀察有無細菌生長。以細菌不生長的最低藥物濃度為該細菌的MIC值為最終結果。

3 實驗結果

3.1 定性鑒別結果

供試品峰保留時間與對照品峰保留時間一致。定性鑒別結果見圖1。

圖1 丁香苦苷對照品和自制丁香苦苷原料藥的色譜圖

由圖1結果顯示，制備得到的丁香苦苷原料藥在與對照品色譜相應的保留時間上，呈現相同色譜峰，表明該原料藥為丁香苦苷。

丁香苦苷為淡黃色粉末，味極苦，易溶于水，可溶于乙醇、甲醇、乙酸乙酯等有機溶劑。分子式C24H30O11，分子量494.5，熔點156～156.5 ℃?；瘜W結構見圖2、圖3。

圖2 丁香苦苷的化學結構式

圖3 丁香苦苷的立體化學結構

UV光譜：λmax nm(ε)221(11 500) ，271(470)。

IR光譜：VKBrmax 1 734，1 692，1 633，1 516，843。

1H-NMR譜：(500 MHz，CD3OD)δ7.00 (2H，d， J=8.5 Hz， H-2″，H-6″) ， 6.68(2H，dd， J=8.5，2 Hz，H-3″，H5″)，2.80(2H，t，J=6.5 Hz，H-α)，4.21(2H，t，J=6.5 Hz,H-β)， 5.57 (1H， d， J=3 Hz，H-1)， 7.40(1H，d，J=6.5 Hz，H-3)， 2.86 (1H，dd， J=12， 2 Hz，H-5)， 2.51(1H， dd，J=19.2，8 Hz，H-6α)，2.37(1H，dd， J=19.2，8 Hz，H-6β)， 2.06(1H， dq，H-8)， 2.28(1H， ddd， J=14，7.2，3.5，H-9)， 4.64(1H，d，J=8 Hz，H-1)， 3.62 (1H，dd，J=14，6.5 Hz，H-6α)， 3.56(1H，dd，J=14，6.5 Hz，H-6′β)。

13C-NMR譜:(500 MHz，CD3OD)δ95.41(C-CH)，153.19(C-3，-CH)， 111.18(C-4，-C)， 28.22(C-5，-CH)， 43.5(C-6，43.5)， 220.74(C-7，-C)， 46.62(C-8，-CH)， 44.46(C-9，-CH)， 13.67(C-10，-CH3) 168.37(C-11，-C)， 100.19(C-1′，-CH)， 74.62(C-2′，-CH)， 77.93 (C-3′，-CH)， 71.53(C-4′，-CH)， 78.36 (C-5′，-CH)， 62.71(C-6′，-CH2)，130.09(C-1″，-C)，130.90(C-2″，C-6″，-CH)， 116.29(C-3″，C-5″，-C)， 157.02(C-4″，-C)， 66.29(C-α，-CH2)，35.26(C-β，-CH2)。

3.2 倍比稀釋法實驗結果

由表1結果顯示，丁香苦苷對選定的9個菌株均有抑菌作用，以細菌不生長的最低藥物濃度為該細菌的MIC值為最終結果[10]。其中對白色葡萄球菌及肺炎桿菌抑菌作用較強，MIC為3.125 mg·mL-1及6.25 mg·mL-1；對金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、福氏志賀氏菌、宋內氏志賀氏菌、變形桿菌等5個菌株MIC為12.5 mg·mL-1；對大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌抑制作用一般，MIC為50 mg·mL-1。

表1 丁香苦苷的抑菌效果和最低抑菌濃度

3.3 打孔法實驗結果

從打孔法實驗結果表2可以看出，丁香苦苷與對照藥炎立消膠囊和炎可寧片比較可知，對金黃色葡萄球菌的抑菌作用強于炎可寧片，稍差于炎立消膠囊，對大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌丁香苦苷、炎立消膠囊和炎可寧片均無抑菌環，表明對大腸桿菌抑菌、銅綠假單胞桿菌作用不明顯。對白色葡萄球菌、肺炎桿菌、痢疾志賀氏菌、宋內氏志賀氏菌、變形桿菌與炎立消膠囊和炎可寧片的抑菌作用基本相當。對福氏志賀氏菌的抑菌作用比炎立消膠囊和炎可寧片的均強。與雙黃連口服液相比較，抑菌作用均不及雙黃連口服液明顯。與黃連素片對比，黃連素片對銅綠假單胞桿菌有抑菌環，強于丁香苦苷，其余均不及丁香苦苷。

表2 不同供試藥物對九種菌株的抑菌環直徑(mm)

注:/表示在選定的藥物濃度下沒有抑菌環。

丁香苦苷對選定的9個菌種中的7個菌種有抑菌作用。對大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌沒有抑菌環；比較倍比稀釋法結果，說明丁香苦苷對這兩個菌種的抑菌作用不明顯，對其余7個菌種有抑菌作用。

3.4 體外殺菌實驗結果

由表3可知丁香苦苷對大部分菌株均有殺菌作用，其中對白色葡萄球菌和肺炎桿菌作用顯著，MBC分別3.125 mg·mL-1及6.25 mg·mL-1；對痢疾志賀氏菌福氏志賀氏菌變形桿菌金黃色葡萄球菌殺菌效果相近；對宋內氏志賀氏菌殺菌作用一般，MBC50 mg·mL-1；在最大藥物濃度下對大腸桿菌，銅綠假單胞桿菌沒有殺菌作用。

表3 不同供試藥物對9種菌株的最低殺菌濃度結果(mg·mL-1)

4 結論

通過丁香苦苷對9種菌株的MIC、MBC、抑菌圈的直徑測定，說明丁香苦苷具有良好抑菌活性，白色葡萄球菌及肺炎桿菌抑菌作用強，最低抑菌濃度(MIC)為3.125 mg·mL-1及6.25 mg·mL-1，僅對大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌作用不明顯。打孔法丁香苦苷對除大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌外7個菌種均出現抑菌環，與倍比稀釋法結果一致。丁香苦苷與對照藥炎立消膠囊和炎可寧片比較可知，對金黃色葡萄球菌的抑菌作用強于炎可寧片，稍差于炎立消膠囊。與黃連素片對比，除黃連素片對銅綠假單胞桿菌強于丁香苦苷外，其余均不及丁香苦苷抗菌效果。由此說明，以丁香葉為原料的炎立消膠囊具有廣譜抗菌作用，且作用效果顯著，其有效成分丁香苦苷作用與炎立消膠囊相近，可以推斷丁香苦苷為丁香葉中抗菌的主要有效成分，進一步增加了丁香苦苷的藥用范圍。

隨著抗生素的發現與應用，多種由致病菌引起的細菌感染性疾病有了很好的控制和治療效果，但抗菌藥物在發揮強大抗菌功效的同時，致病菌也不斷對現有藥物產生耐藥性[11-12]，可供臨床選擇的抗生素越來越局限，因此，從中藥中篩選抗菌藥物進行細菌的非抗生素治療研究具有重要意義[13]。丁香苦苷毒性極小甚至無毒[14]，無不良反應，不易產生耐藥性，從實驗結果可知，丁香苦苷和炎立消膠囊都是治病殺菌的良藥，通過本課題的研究為以丁香葉為原料的炎立消膠囊或者片劑體內外抗菌作用提供實驗數據，為開發丁香苦苷的抗菌新藥奠定基礎。