檢測多天線AAG的Lectin-ELISA方法建立及初步應用評價

關雯倩， 高致遠， 馮惠娟， 洪 松， 何羽童， 何 璐， 高春芳

（上海東方肝膽外科醫院實驗診斷科，上海 200438）

α1-酸性糖蛋白（alpha 1-acid glycoprotein，AAG）是由肝細胞合成、分泌的一種急性時相反應蛋白[1]，等電點為2.8～3.8，糖含量高達42%[2]。人血清AAG分子是一條具有183個氨基酸的多肽鏈，相對分子質量為41 000～43 000，含有5個N-linked糖基化位點（Asn-15、Asn-38、Asn-54、Asn-75、Asn-85），每個糖基化位點均可能表達具有不同分枝數的糖鏈結構[3]，多天線糖鏈結構主要是指有3條或3條以上分枝的糖鏈。血清中糖蛋白的含糖量多在20%以下，AAG的含糖量在所有糖蛋白中處于較高水平，且唾液酸含量高達15%，并以α2-3或α2-6的方式與半乳糖連接[4]。唾液酸帶負電荷，這也是AAG等電點較低的原因。由于AAG具有抗中性粒細胞和抗補體活性，因此被認為是一種天然的抗炎蛋白和免疫調節劑[5]。AAG還具有維持毛細血管通透性的功能，可提高血管內皮細胞的陰離子選擇性[6]。此外，AAG還具有抑制血小板聚集等功能[7]。AAG的多種生物學活性都依賴于其糖基化修飾，如抑制淋巴細胞增殖的功能依賴于其糖鏈分枝水平[8]；AAG經去唾液酸處理后，其抑制血小板聚集的功能加強[9]；AAG可通過N-linked糖鏈結合1型人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus 1，HIV-1），抑制病毒包膜蛋白結合CD4+單核細胞[10]。AAG糖基化改變并不僅限于急性炎癥條件下，在其他病理生理條件下也會發生相應變化，如妊娠、類風濕性關節炎、酒精性肝硬化、肝炎等[11-14]。在腫瘤的發生、發展過程中，糖基化位點和糖鏈結構均可能出現異常改變，通過對比正常人和疾病患者的糖基化狀況，可能會發現能用于臨床的新腫瘤標志物。在卵巢癌、胰腺癌等腫瘤中，AAG的糖基化改變已有相關報道[15]。在原發性肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中，異常巖藻糖基化的AAG增加也有相關報道[16]。糖鏈分枝數增加也是腫瘤中常見的異常糖基化形式。目前，關于HCC中AAG的多天線糖鏈改變情況尚缺乏相關的文獻報道。為闡明HCC患者血清多天線AAG的變化情況，本研究擬構建一種凝集素-酶聯免疫吸附試驗（lectin enzyme-linked immunosorbent assay，Lectin-ELISA）檢測體系，初步評價多天線AAG對HCC患者的診斷價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2014年—2018年的患者457例，包括HCC 220例[HCC組，其中男193例、女27例，年齡（50.3±8.22）歲]、肝內膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）74例[ICC組，其中男64例、女10例，年齡（55.72±10.18）歲]、肝硬化（liver cirrhosis，LC）120例[LC組，其中男106例、女14例，年齡（51.45±11.07）歲]、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）43例[CHB組，其中男40例、女3例，年齡（51.02±10.31）歲]，其中220例HCC患者、74例ICC患者和32例LC患者的血清樣本收集于上海東方肝膽外科醫院，79例LC患者和4例CHB患者的血清樣本收集于海軍軍醫大學附屬長征醫院，8例LC患者的血清樣本收集于中國人民解放軍聯勤保障部隊第962醫院；8例CHB患者的血清樣本收集于沈陽軍區總院；27例CHB患者的血清樣本收集于濟南傳染病院；4例CHB的血清樣本收集于臺州市第一人民醫院；1例LC的血清樣本收集于福州孟超肝膽醫院。根據醫院電子病歷系統，盡可能全面地收集所有患者的一般資料、 臨床實驗室指標及病理診斷結果。HCC患者病理診斷結果包括：腫瘤的大小、腫瘤數目、衛星結節、大血管癌栓、腫瘤包膜、分化程度、微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）、肝硬化情況等。每例患者臨床血常規、肝功能、腫瘤標志物、凝血系統功能檢查、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）標志物等臨床檢測數據與血清樣本同期收集。選取同期上海東方肝膽外科醫院體檢健康者80名（正常對照組），其中男70名、女10名，年齡（51.46±8.34）歲。各組間性別、年齡均相互匹配。本研究經海軍軍醫大學東方肝膽外科醫院倫理委員會批準，所有對象均簽署知情同意書。

1.2 入選和排除標準

HCC均為經術后病理檢查明確診斷。排除標準：（1）合并甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒等感染；（2）患繼發性肝癌、其他器官惡性腫瘤、嚴重感染及其他器官嚴重疾病等。HCC分期依據TNM標準[美國癌癥聯合會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第8版]。T1期：單個腫瘤＜2 cm或＞2 cm但無血管浸潤；T2期：單個腫瘤＞2 cm，伴有血管浸潤，或多發性腫瘤且均＜5 cm；T3期：多發性腫瘤，其中至少1個＞5 cm；T4期：任意大小的單個或多個腫瘤侵犯門靜脈或肝靜脈，或腫瘤直接侵犯膽囊以外的臨近器官或腹膜臟層。

ICC均經術后病理明確診斷。LC均經過臨床表現和影像學檢查確診的HBV相關LC患者，排除自身免疫性肝病、酒精性肝病，藥物性肝病及其他原因引起的慢性肝病、Wilson病、腎功能不全、血液病等。CHB均為乙型肝炎表面抗原陽性持續6個月以上的患者。

1.3 血清樣本采集

采用促凝管采集所有對象靜脈血3～4 mL，室溫靜置30 min，1 500×g離心10 min，吸取血清置于專用的Eppendorf管中，300～500 μL/管，-80 ℃保存。

1.4 實驗室常規檢測指標

肝功能指標均采用Modular P800全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑檢測。相關指標參考區間分別為總蛋白（total protein，TP）65～85 g/L，白蛋白（albumin，Alb）40～55 g/L，總膽紅素（total bilirubin，TB）3.4～21.0 μmol/L，直接膽紅素（direct bilirubin，DBil）＜6.84 μmol/L，總膽汁酸（total bile acid，TBA）＜12 μmol/L，丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）9～50 U/L，天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）15～40 U/L，γ-谷氨酰基轉移酶（gamma-glutamyltransferase，GGT）10～60 U/L，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）45～125 U/L，唾液酸（sialic acid，SA）456～754 mg/L，白蛋白/球蛋白（albumin/globulin，A/G）比值1.5～2.5。

血常規指標采用XE-2100D全自動血液分析儀（日本Sysmex公司）及配套試劑檢測。相關指標參考區間分別為白細胞（white blood cell，WBC）計數（3.5～9.5）×109/L，血小板（platelet，PLT）計數（125～ 350）×109/L，紅細胞（red blood cell，RBC）計數男性（4.0～5.5）×109/L、女性（3.5～5.0）×109/L，血紅蛋白（hemoglobin，Hb）男性120～160 g/L、女性110～150 g/L。

腫瘤標志物采用cobas e601電化學發光全自動免疫分析系統（瑞士羅氏公司）及配套試劑檢測。相關指標參考區間分別為甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）＜20 μg/L，癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）＜10 μg/L，糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）19-9＜39 U/mL。甲胎蛋白異質體（alpha-fetoprotein variant，AFP-L3）檢測試劑盒購自北京熱景公司，參考區間為＜10%。

1.5 主要試劑和儀器

酶標板購自德國Greiner Bio One公司，AAG抗體（ab118809）購自英國Abcom公司，Coating buffer（#421701）購自美國BioLegend公司，Biotinylated DSA（B-1185）、Carbofree coating buffer（SP-5040）購自美國Vector公司，LowCross-buffer購自德國Candor Bioscience公司，Peroxidase-conjugated avidin、Substrate Reagent Pack（DY999）購自美國RD公司，磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）（20×）、Tween-20購自上海博光生物科技有限公司，Stop solution購自上海西塘生物公司。移液器購自美國Gilson公司，恒溫培養箱購自上海精宏儀器設備有限公司，Gen5酶標儀購自美國BioTek Instruments公司，BN-Ⅱ特定蛋白分析儀購自德國西門子公司。

1.6 方法

1.6.1 Lectin-ELISA的建立 根據曼陀羅凝集素（Datura stramonium agglutinin，DSA）可特異性識別多天線糖鏈結構的原理[17]構建檢測多天線AAG的Lectin-ELISA方法。采用AAG抗體包被酶標板，捕獲血清樣本中的目的蛋白AAG，采用DSA特異性識別AAG的多天線糖鏈結構，檢測DSA與多天線AAG結合物（DSA-AAG）的水平。經證實，抗體分子上不含多天線結構，不影響DSA對目的蛋白多天線糖鏈結構的識別和結合，因此無需對抗體分子上的糖鏈結構進行封閉[18]。具體步驟：（1）用包被液將AAG抗體按比例稀釋后加入酶標板，每孔加入100 μL，4 ℃過夜，每孔加入400 μL洗板液洗滌4次，最后1次洗滌后用吸水紙拍干；（2）每孔加入300 μL封閉液，37 ℃孵育1 h，洗滌4次后用吸水紙拍干；（3）用LowCross-buffer將血清樣本1∶100稀釋，每份樣本加入2個孔中（雙復孔），每孔加入100 μL，室溫孵育2.5 h，洗滌4次后用吸水紙拍干；（4）用PBS將biotinylated DSA按比例稀釋，每孔加入100 μL，室溫孵育1 h，洗滌4次后用吸水紙拍干；（5）用酶稀釋液將peroxidase-conjugated avidin按比例稀釋，每孔加入100 μL，室溫孵育45 min，洗滌4次后用吸水紙拍干；（6）每孔加入配制好的辣根過氧化物酶顯色底物100 μL，室溫避光孵育30 min；（7）每孔加入50 μL終止液，輕晃酶標板混勻，10 min內放入Gen5酶標儀檢測吸光度（A）值。

1.6.2 方法學評估 由于目前尚無多天線AAG標準品，因此以5名健康人混合血清替代標準品進行檢測。根據前期條件摸索，將混合血清以1∶5、1∶20、1∶80、1∶320、1∶1 280、1∶5 120、1∶20 480稀釋，采用建立的Lectin-ELISA進行檢測，獲得濃度梯度曲線，以此評估該方法的線性。對高、中、低值樣本重復檢測5個批次，計算該方法的批間變異系數（coefficient of variation，CV）。以此評估該方法的重復性。采用Interference check A PLUS干擾檢測試劑盒（日本Sysmex公司）進行干擾試驗，干擾物質包括游離膽紅素（free bilirubin，FBil）、結合膽紅素（conjugated bilirubin，CBil）、溶血（Hb）和乳糜。按說明書要求配制干擾樣本。具體步驟：在各干擾物質中分別加入2 mL超純水，充分溶解，取1 mL與預先制備好的混合血清樣本9 mL充分混勻，作為樣本A。在空白對照中加入2 mL超純水，充分溶解，取1 mL與預先制備好的混合血清樣本9 mL充分混勻，作為樣本B。將樣本A與樣本B按0∶1、0.2∶0.8、0.4∶0.6、0.6∶0.4、0.8∶0.2、1∶0配制成不同稀釋比例的樣本，采用建立的Lectin-ELISA檢測，判斷各干擾物質對該方法的影響。

1.6.3 Lectin-ELISA的初步臨床應用 采用建立的Lectin-ELISA檢測所有對象的血清樣本。

1.6.4 血清AAG檢測 采用BN-Ⅱ特定蛋白分析儀及配套試劑檢測所有對象的血清AAG水平。

1.7 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。呈正態分布的數據以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。呈非正態分布的數據以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，組間比較采用非參數秩和檢驗。采用Spearman相關分析評估各項目之間的相關性。采用Logistic回歸方法建立多指標聯合檢測模型。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估單項指標及聯合檢測模型診斷HCC的效能。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC組、ICC組、LC組、CHB組及正常對照組一般資料的比較

HCC組、ICC組、LC組、CHB組及正常對照組之間血清ALT、AST、TB、DBil、Alb、TP、AFP水平差異有統計學意義（P＜0.05），性別及年齡差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 方法學評估

2.2.1 線性范圍 以混合血清替代標準品進行檢測，以A值為縱坐標，以血清稀釋倍數的對數為橫坐標，繪制濃度梯度曲線，線性回歸系數r2=0.976，見圖1。HCC組、ICC組、LC組、CHB組及正常對照組血清以1∶100稀釋后DSAAAG水平均在此范圍內。

圖1 血清DSA-AAG的濃度梯度曲線

表1 HCC組、ICC組、LC組、CHB組及正常對照組一般資料的比較 ±s

表1 HCC組、ICC組、LC組、CHB組及正常對照組一般資料的比較 ±s

組別 例數 AST/（U/L） ALT/（U/L） GGT/（U/L） TB/（μmol/L）HCC組 220 29.00（20.00～42.00） 29.00（20.00～42.00） 56.00（34.00～104.5） 14.00（10.90～18.38）CHB組 43 223.00（88.00～519.00） 295.00（183.00～767.00） 114.00（63.00～165.00） 23.40（14.70～69.10）LC組 120 32.00（24.25～44.75） 27.00（18.00～40.25） 46.50（28.25～79.75） 23.85（15.00～40.15）ICC組 74 23.00（18.00～35.00） 24.50（16.00～34.25） 84.50（61.75～113.00） 14.35（10.70～18.43）正常對照組 80 20.00（16.00～25.75） 14.65（12.00～16.63）統計值 17.295 17.744 2.271 18.798 P值 ＜0.001 ＜0.001 0.132 ＜0.001組別 DBil/（μmol/L） Alb/（g/L） TP/（g/L） AFP/（μg/L）HCC組 5.50（4.10～7.10） 42.01±3.74 69.62±8.28 61.00（4.70～1 210.00）CHB組 9.60（5.20～47.00） 37.69±4.24 69.09±6.26 8.31（3.71～45.47）LC組 10.20（6.00～20.00） 33.08±10.18 63.63±16.81 3.60（2.23～8.84）ICC組 5.15（3.85～6.80） 42.26±3.46 68.67±5.12 2.90（2.00～4.70）正常對照組 47.91±1.97 75.87±3.20 3.50（2.60～3.50）統計值 22.056 46.845 161.700 82.406 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2.2 批間CVLectin-ELISA檢測血清DSAAAG的批間最大CV為10.51%，滿足批間CV＜15%的要求。見表2。

表2 Lectin-ELISA的批間CV

2.2.3 干擾試驗 Lectin-ELISA檢測血清DSAAAG的A值隨干擾物濃度的變化僅出現輕微變化，符合臨床應用要求。見圖2。

2.3 血清DSA-AAG和AAG水平

將ICC組、LC組、CHB組合并為疾病對照組，HCC組血清DSA-AAG水平顯著高于疾病對照組和正常對照組（P＜0.001），且疾病對照組高于正常對照組（P＜0.001）。HCC組、疾病對照組血清AAG水平明顯高于正常對照組（P＜0.001），而HCC組與疾病對照組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

圖2 干擾物質對Lectin-ELISA檢測DSA-AAG的干擾

表3 HCC組、疾病對照組和正常對照組血清DSA-AAG、AAG水平的比較 x±s

將HCC組和ICC組合并為癌癥組，將LC組、CHB組和正常對照組合并為非癌癥組。癌癥組血清DSA-AAG和AAG水平均高于非癌癥組（P＜0.001）。見表4。

HCC組血清DSA-AAG水平高于ICC組（P＜0.001），血清AAG水平低于ICC組（P＜0.001）。見表5。

表4 癌癥組與非癌癥組血清DSA-AAG、AAG水平的比較 ±s

表4 癌癥組與非癌癥組血清DSA-AAG、AAG水平的比較 ±s

注：與非癌癥組比較，*P＜0.001

組別 DSA-AAG（A值） AAG/（g/L）癌癥組 0.46±0.08* 0.67±0.32*非癌癥組 0.43±0.10 0.52±0.28

表5 HCC組與ICC組血清DSA-AAG、AAG水平的比較 ±s

表5 HCC組與ICC組血清DSA-AAG、AAG水平的比較 ±s

注：與ICC組比較，*P＜0.001

組別 DSA-AAG（A值） AAG/（g/L）HCC組 0.47±0.07* 0.63±0.30*ICC組 0.43±0.10 0.79±0.35

2.4 HCC組DSA-AAG與臨床各項指標的相關性

HCC組DSA-AAG與AFP呈負相關（r=0.147，P＜0.05），與TP、Alb、A/G比值、GGT、TB、DBil、ALT、AST、RBC計數、Hb、糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）19-9均無相關性（r值分別為0.040、0.039、-0.017、0.052、-0.012、-0.031、0.061、0.059、-0.094、-0.056、0.001，P＞0.05）。

2.5 不同腫瘤大小和TNM分期HCC患者血清DSA-AAG和AAG水平的比較

將HCC按直徑分為小肝癌（直徑＜5 cm，106例）和大肝癌（直徑≥5cm，112例），大肝癌血清AAG水平高于小肝癌（P＜0.001），而血清DSA-AAG水平二者之間差異無統計學意義（P＞0.05）。將HCC患者按TNM分期分為T1期（65例）、T2期（74例）和T3+T4期（79例），T3+T4期患者血清AAG水平顯著高于T1、T2期患者（P＜0.001），不同分期患者之間血清DSA-AAG水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表6。

2.6 AFP陰性HCC患者與非癌癥者血清DSAAAG水平的比較

220例HCC中有90例（40.9%）患者血清AFP為陰性（＜20 ng/mL）。將肝硬化患者、CHB患者、正常對照者合并為非癌癥組。AFP陰性HCC組血清DSA-AAG和AAG水平均高于非癌癥組（P＜0.001、P＜0.05）。見表7。

表6 不同腫瘤大小和TNM分期HCC患者血清DSA-AAG和AAG水平的比較 ±s

表6 不同腫瘤大小和TNM分期HCC患者血清DSA-AAG和AAG水平的比較 ±s

項目 DSA-AAG（A值） AAG/（g/L）腫瘤大小/cm＜5 0.47±0.08 0.53±0.22≥5 0.47±0.07 0.73±0.33 TNM分期T1期 0.47±0.07 0.58±0.27 T2期 0.47±0.09 0.52±0.22 T3+T4期 0.47±0.06 0.78±0.33

表7 AFP陰性HCC組與非癌癥者血清DSA-AAG、AAG水平的比較 ±s

表7 AFP陰性HCC組與非癌癥者血清DSA-AAG、AAG水平的比較 ±s

注：與非癌癥組比較，*P＜0.05、**P＜0.001

組別 DSA-AAG（A值） AAG/（g/L）AFP陰性HCC組 0.48±0.09** 0.60±0.28*非癌癥組 0.43±0.10 0.52±0.29

2.7 DSA-AAG及AAG單項及聯合檢測診斷HCC的效能

采用Logistic回歸分析建立DSA-AAG、A A G和A F P聯合檢測鑒別診斷H C C與非HCC的模型為LogitAAG1=6.578×DSA-AAG+1.445×AAG+0.013×AFP-3.258。ROC曲線分析結果顯示，DSA-AAG、AAG及AFP單項和聯合檢測模型LogitAAG1鑒別診斷HCC與非HCC的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.651、0.632、0.803和0.836，LogitAAG1的準確性（74.9%）高于DSA-AAG（63.9%）和AAG（57.0%），與AFP（74.0%）相當，敏感性最高的是DSA-AAG（85.4%），特異性最高的是AFP（84.8%）。見表8和圖3。

表8 DSA-AAG、AAG及AFP單項和聯合檢測模型LogitAAG1鑒別診斷HCC與非HCC的效能

采用Logistic回歸分析建立DSA-AAG、Alb和TB聯合檢測鑒別診斷AFP陰性HCC與非HCC的模型為LogitAAG2=6.912×DSA-AAG-0.126×TB-0.193×Alb+6.417。ROC曲線分析結果顯示，DSA-AAG、AAG單項和聯合檢測模型LogitAAG2鑒別診斷AFP陰性HCC與非HCC的AUC分別為0.669、0.607、0.929，LogitAAG2的診斷效能優于DSA-AAG和AAG單項檢測。見表9和圖3。

表9 DSA-AAG、AAG單項和聯合檢測模型LogitAAG2鑒別診斷AFP陰性HCC與非HCC的效能

圖3 各項指標單項及聯合檢測診斷HCC的ROC曲線

3 討論

糖基化是一種重要的蛋白質翻譯后修飾，血清中有50%～70%的蛋白為糖基化修飾蛋白[19]。糖基化修飾在很多關鍵的生物學過程中起重要作用，如細胞的生長、分化、黏附以及分子運輸和清除、受體激活、信號轉導、內吞作用等，對維持蛋白質結構穩定及其生物學功能同樣起著重要作用，同時還直接參與疾病的病理生理過程[20]。肝臟是體內除B細胞外最重要的糖基化修飾部位[21]。AAG是由肝細胞合成并分泌的急性時相反應蛋白，其糖基化改變與肝臟疾病具有密切關聯。DSA-AAG代表的是血清中能與DSA特異性結合的AAG，即含有多天線糖鏈結構的AAG。

目前，臨床上常用的腫瘤標志物大部分為糖蛋白，如AFP、CEA、前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）、CA19-9、CA125等。在腫瘤發生、發展過程中，糖蛋白會出現異常糖基化修飾[22]，因此異常糖基化腫瘤標志物也成為新的研究熱點。大多數經異常糖基化修飾的蛋白質位于細胞膜上或直接被分泌到血清中，血清中的聚糖結構通常很穩定，這使得將血清作為樣本檢測異常糖基化修飾蛋白成為可能。目前已有異常糖基化腫瘤標志物成功地應用于臨床：2005年，美國食品與藥品監督管理局（U. S. Food and Drug Administration，FDA）批準核心巖藻糖基化的AFP，即甲胎蛋白異質體用于臨床。我國原發性肝細胞癌診療規范（2017版）也指出：血清AFP及其異質體是診斷肝癌的重要指標和特異性最強的腫瘤標志物，常用于肝癌的普查、早期診斷、術后療效監測和隨訪，且有助于鑒別腫瘤的來源[23]。因此，聚焦于異常糖基化改變為發現敏感性和特異性更高的腫瘤標志物提供了一個新的思路。

然而，由于聚糖結構的高度復雜性，給異常糖基化蛋白質的研究和臨床應用帶來了一定的困難。隨著高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）、毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）、質譜（mass spectrometry、MS）等技術的應用，人們對聚糖結構有了更全面的認識[24]。在尋找異常糖基化腫瘤標志物的過程中，凝集素發揮著重要的作用。凝集素是一類特殊的蛋白質或糖蛋白，能識別特定糖鏈結構并與之非共價、可逆地結合。許多凝集素，尤其是植物凝集素，成為糖復合物研究中的重要工具[22]。

酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）省去了分離和富集單個蛋白的繁瑣步驟，方法簡便、敏感、易于標準化，可實現大批量樣本的檢測。DSA能特異性識別多天線糖鏈結構。通過基于DNA測序儀的熒光糖電泳技術對IgG的N-糖鏈結構圖譜進行研究，結果顯示IgG分子不含多天線糖鏈結構[25]。因此將DSA與ELISA聯用建立的Lectin-ELISA方法可避免抗體分子自身糖鏈結構對檢測的干擾，又具有常規ELISA的特點。

本研究構建了檢測血清DSA-AAG的Lectin-ELISA，并對該方法的檢測性能進行了初步評價。由于目前尚無關于正常人血清多天線糖鏈結構AAG水平的相關報道，同時也缺乏相關的標準品，因此本研究以健康人混合血清替代標準品進行檢測。為盡量減少檢測過程中非特異性結合對結果產生的干擾，在預實驗中，本研究嘗試了多種血清稀釋液，結果顯示LowCrossbuffer對降低本底和非特異性干擾的效果比其他稀釋液更明顯，因此采用LowCross-buffer作為血清樣本稀釋液。同時設置空白對照，計算時扣除本底，以此來減少非特異性結合的干擾。有研究結果顯示，HCC患者血清AAG巖藻糖基化和唾液酸水平升高[16，26]。本研究結果顯示，HCC患者血清DSA-AAG水平高于疾病對照組和正常對照組（P＜0.001），癌癥組血清DSA-AAG水平高于非癌癥組（P＜0.001）。因此，AAG多天線糖鏈結構的改變與肝癌的發生可能具有潛在聯系。HCC患者血清DSA-AAG水平高于ICC患者（P＜0.001），提示DSA-AAG的產生可能與腫瘤細胞的來源也具有一定的關系。MEHTA等[27]的研究結果顯示，肝癌組織中DSA結合的三、四天線結構的糖鏈水平顯著高于癌旁組織（P＜0.001）。本研究結果還顯示，不同腫瘤大小和分期的HCC患者之間血清DSA-AAG水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。因此，DSAAAG可能與腫瘤的進展、侵襲等生物學行為無關。ROC曲線分析結果顯示，DSA-AAG、AAG和AFP的聯合檢測模型LogitAAG1對鑒別診斷HCC與非HCC具有較高的價值。本研究中AFP陰性的HCC患者占HCC患者的40.9%。目前，AFP陰性的HCC患者尚缺乏可靠的實驗室診斷指標。本研究結果顯示，AFP陰性HCC組血清DSAAAG水平顯著高于非癌癥組（P＜0.001），DSAAAG、Alb與TB的聯合檢測模型LogitAAG2鑒別診斷AFP陰性HCC與非HCC的AUC達0.929，這為AFP陰性HCC的鑒別診斷提供了一個較好的血清學診斷指標。

本研究采用Lectin-ELISA檢測血清DSAAAG水平，結果顯示HCC患者血清DSA-AAG水平顯著升高，與本實驗室前期基于DNA測序儀的熒光糖電泳得到的HCC患者血清N-糖鏈結構圖譜一致，圖譜中代表多天線糖鏈結構的峰值顯著升高[25]。HCC患者血清多天線糖蛋白水平升高可能與肝癌組織中合成多天線結構相關的糖基轉移酶升高，導致肝癌細胞分泌的蛋白糖鏈分枝增加有關[28]，其具體機制還有待進一步研究。

綜上所述，DSA-AAG及聯合檢測模型對HCC以及AFP陰性HCC的鑒別診斷可能有一定價值。但現階段的研究缺乏獨立驗證及跟蹤隨訪數據，因此尚不能評估以上指標在治療前、后的變化情況及在預后判斷中的價值。此外，由于標準品的缺乏，現階段暫時難以進行Lectin-ELISA靈敏度及準確性的相關研究，這也是Lectin-ELISA的局限所在，因此該方法還有很大的改善空間。后續將依托上海東方肝膽外科醫院多中心分子診斷合作平臺進一步收集各期HCC患者術后的血清樣本，完善跟蹤隨訪數據，并進行多中心驗證，為后續的臨床轉化和應用奠定基礎。