采用葡萄糖參考方法為室間質量評價樣本確定靶值的應用初探

金中淦， 居 漪， 張素潔， 李 卿， 歐元祝， 虞嘯炫， 孫賀偉， 范霄宇， 虞科穎

（1. 上海市臨床檢驗中心參考測量實驗室，上海 200126；2.上海市臨床檢驗中心臨床生化免疫學研究室，上海 200126）

葡萄糖（glucose，Glu）是臨床實驗中重要的檢測項目，血糖監測是糖尿病診斷和治療的重要環節，其結果有助于評估糖尿病患者血糖代謝情況，可幫助臨床制定治療方案，并監測療效。因此，臨床實驗室Glu檢測質量在糖尿病管理中具有重要作用[1-2]。能力比對檢驗（proficiency testing，PT）/室間質量評價（external quality assessment，EQA）活動是目前管理和提高臨床實驗室檢測質量的常用方式，通常依據方法學或檢測系統進行分組統計，靶值為組內均值或中位值[3]。本研究擬運用國際檢驗醫學溯源聯合委員會（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）公布的同位素稀釋氣相色譜串聯質譜（isotope dilution gas chromatography tandem mass spectrometry，IDGC/MS）Glu參考方法[4]確定EQA樣本靶值，探索其在EQA中的可行性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集參加上海市臨床檢驗中心2018年第2次常規化學EQA活動的509家各級、各類醫院的醫學實驗室及獨立實驗室反饋結果。

1.2 樣品

正確度物質為美國國家標準與技術研究院（the National Institute of Standards and Technology，NIST）標準物質SRM 965b（-70℃保存）及國際臨床化學協會（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）提供的RELA-A和RELA-B。EQA樣品為2018年第2次EQA活動的5份樣本，編號分別為EQA1、EQA2、EQA3、EQA4和EQA5，均為凍干血清，依據中國合格評定國家認可委員會（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）-GL03-2006《能力驗證計劃樣品均勻性和穩定性評價指南》評估樣品的均一性和穩定性[5]。

1.3 儀器與試劑

Glu標準品SRM 917c，純度為（99.7±0.3）%，購自NIST；13C6-D-Glu標記物同位素豐度為99%，購自美國Cambridge Isotope laboratories公司；乙腈（質譜級）、乙酸（質譜級）購自美國Fisher公司，乙酸酐購自國藥集團。Agilent G7000B氣相質譜儀、HP-5MS UI毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）均購自美國Agilent公司，梅特勒-托勒多分析天平（Max=220 g，d=0.1 mg）購自德國METTLER公司，氮氣儀購自美國THERMO公司。

1.4 參考方法賦值

上海市臨床檢驗中心參考測量實驗室是通過CNAS ISO/IEC17025/15195認可的實驗室，被認可的項目包括血清Glu。賦值過程：（1）樣品前處理，在血清樣品中加入適量Glu標記物溶液，使血清中Glu的含量與Glu標記物含量之比約為1，加入適量無水乙醇去除蛋白質，10 000×g離心10 min，收集上清液至另一管中；（2）衍生化反應，取收集的上清液200 μL至另一樣品瓶中，60 ℃氮氣吹干后，加入鹽酸羥氨吡啶溶液（0.6 mol/L）200 μL，混勻，90 ℃條件下反應1.5 h，冷卻后加乙酸酐300 μL，90 ℃條件下反應1 h，60 ℃氮氣吹干，用400 μL二氯甲烷復溶，進行ID-GC/MS分析；（3）ID-GC/MS條件，以分流模式進樣，分樣流比為20∶l。進樣口溫度設定為270 ℃，氦氣流速為1.0 mL/min，初始爐溫為150 ℃，持續1 min，再以30 ℃/min的速率升至180 ℃，持續1 min，再以20 ℃/min的速率升至280 ℃，持續1 min。離子源溫度250 ℃，電離能為70 eV。選擇離子監測模式下采集質荷比（m/z）314和319，掃描時間為200 ms。進樣量為1 μL；（4）測定過程，參考方法賦值過程依據本實驗質譜法樣品賦值標準操作規程進行，分3批次測定，每批次每個濃度樣品重復前處理3份樣本，每份樣本與標樣同步測定，按低標-樣品（含質控）-高標的次序進樣，每份樣本最少重復測定3次，要求3次進樣檢測結果的變異系數（coefficient of variation，CV）＜2%，否則需要再增加進樣次數至滿足要求，以3次進樣的均值作為每份樣本的有效實驗結果。

1.5 臨床實驗室EQA過程

樣本通過上海市臨床檢驗中心指定冷鏈系統運送到參評實驗室，各參評實驗室按照標準操作規程測量樣本，記錄測量結果，并通過網絡平臺上傳測定結果、所用儀器、方法等相關信息。

1.6 統計學方法

使用上海市臨床檢驗中心EQA評價管理平臺及Excel 2016軟件進行數據的分析處理，計算中位數及偏移。

2 結果

2.1 參考方法性能

Glu參考方法測量不精密度≤2.0%，測量參考物質相對偏移＜1.0%。本實驗室參加IFCC參考實驗室網絡比對，測定結果均在規定的等效限內。見表1。

表1 參考方法主要性能評價

2.2 EQA樣本賦值結果

實驗過程中同步測定正確度物質，要求正確度物質測定結果在靶值允許偏移范圍內，否則該批次實驗結果無效。參考方法為EQA樣本定值結果。見表2。

表2 參考方法測定血清Glu結果

2.3 EQA結果分析

2.3.1 按照Glu檢測的不同方法對調查結果進行分析 按照Glu檢測方法對檢測結果進行分析，不同方法測定的Glu水平中位值與參考方法定值結果的相對偏移為-2.22%～4.51%，見圖1。按WS/T 403-2012[6]中偏移2%的評價標準，其中己糖激酶法5個濃度的測定值與參考方法確定靶值的相對偏移均＜2%。

圖1 不同方法測定的Glu濃度與參考方法確定靶值的相對偏移

2.3.2 按照不同檢測系統對結果進行分析 不同常規分析系統測定的血清Glu濃度中位數與參考方法確定靶值的相對偏移見圖2。13個系統檢測EQA1～5結果中位數與參考方法確定靶值的相對偏移分別為-1.71%～3.47%、-0.17%～3.75%、-2.3%～3.60%、0.50%～7.52%、-1.70%～3.23%。按WS/T 403-2012[6]中偏移2%的評價標準，只有7.69%（1/13）的常規分析系統測定的5個Glu結果與參考方法定值的相對偏移＜2%，有61.54%（8/13）的系統只有1個結果與參考方法定值的相對偏移＞2%，有15.38%（2/13）的系統2個結果與參考方法定值的相對偏移均＞2%，有7.69%（1/13）的系統3個結果與參考方法定值的相對偏移＞2%，有7.69%（1/13）的系統測定的5個Glu濃度與參考方法定值的相對偏移＞2%。

圖2 不同常規分析系統測定的血清Glu濃度與參考方法賦值結果的相對偏移

2.3.3 EQA結果分析 分別以實驗室所有數據中位數、參考方法定值為靶值，并且以WS/T 403-2012[6]中允許總誤差的7%評價實驗室合格率，結果見表3。

表3 實驗室合格率

3 討論

EQA中靶值的正確性、客觀性一直是質量評價機構努力的方向。本研究主要利用Glu參考方法確定EQA樣本靶值，初步探討其在上海地區EQA工作中的可行性。

本實驗室Glu參考方法已通過2018年CNAS ISO/IEC17025/15195認可[7]，并于2019年通過JCTLM評審認可，該項目的檢測能力已獲得國際組織認可，可以為全球提供賦值服務，保證了本實驗室檢測靶值的可靠性。我們所分析的上海地區509家臨床實驗室的數據，不同檢測原理測定的Glu濃度中位數與參考方法確定靶值的相對偏移為-2.22%～4.51%，己糖激酶法5個濃度的測定值與參考方法確定靶值的相對偏移均＜2%，顯示出較好的正確性。己糖激酶法的特異性高于葡萄糖氧化酶法，是公認的血糖測定的參考方法，己糖激酶法常規分析方法原理與參考方法類似，因此其測定準確性是比較高的。

按照檢測系統進行分組分析，大部分系統測定的Glu濃度與參考方法賦值結果的相對偏移與行業標準中2%偏移的要求還存在一定距離，但大部分系統是能夠滿足1/2允許總誤差的要求。張傳寶等[8]用參考方法對血清進行賦值，并用標準物質SRM 965a對系統進行校準，評價了13種Glu常規檢測系統的正確性，校準前大部分系統為正偏移，與我們的研究結果一致，常規方法測定Glu的特異性問題可能是主要原因。另外，目前大部分體外診斷試劑均采用的是單一校準品，該校準品的濃度和定值準確性是臨床實驗室檢測結果的重要保證。

以行業標準中允許總誤差7%來評價實驗室合格率，當靶值為所有實驗室檢測結果的中位數時，EQA1～5不合格率分別為2.16%、2.95%、3.34%、3.14 %、1.77%；當靶值為參考方法賦值結果評價時，EQA1～5不合格率分別為2.75%、3.14%、2.75%、7.86%、2.16%。提示不同的靶值對實驗室來講，可能會導致不同的質量評價結果。CNAS-GL002：2018《能力驗證結果的統計處理和能力評價指南》[9]指出，在能力驗證中指定值的確定方式有多種，除去采用已知值和有證參考值外，參考方法賦值比采用參加者公議值為指定值等級高，不確定度要小[9]，可以適當減少均值或中位數的偏移導致靶值出現偏差的情況，提高靶值和質量評價的客觀性。EQA的關鍵是掌握樣本的互換性及靶值的設定過程，本研究主要探討靶值的設定過程，對于樣本的互換性，需進一步探討。值得注意的是，EQA樣品雖為人血清基質，但為了滿足保存和運輸的要求，可能會添加一定的穩定劑，因此對于臨床實驗室檢測EQA4樣本出現的較大偏差是來自于系統的正確性問題還是樣本存在的互通性問題，仍需進一步研究。EQA4樣本濃度在4 mmol/L左右，為較低水平的濃度，而本實驗室認可的參考測量范圍是1.8～26.3 mmol/L，校準和測量能力為1.4%，故參考方法定值的準確性比較高。對于低濃度Glu的準確測量是值得被關注的。當血糖濃度為3.4～3.9 mmol/L時，約有29.92%糖尿病住院患者易發生有癥狀低血糖；而當血糖值為2.8～3.3 mmol/L時，約31.80%糖尿病住院患者易發生無癥狀低血糖[10]。低血糖的危害主要是對神經系統的損傷，因此應及時檢測血糖，提高低血糖的診斷準確率，以達到早期預防、及時干預的目的，減少低血糖的臨床危害[2]。后續我們將著手2方面的工作：一是嘗試開展正確度驗證工作，使用新鮮冰凍血清考察臨床實驗室檢測水平；二是研究EQA樣本的互換性，因常規EQA樣本在保存、運輸及成本上相對正確度樣本具有較大優勢，因此有必要評價選擇質量較高的EQA樣本，并且制定合理的EQA評價方案，為提高臨床實驗室檢測質量發揮作用。目前較高質量EQA樣本的獲得需要實驗室、質量評價機構及體外診斷試劑企業的共同努力[11]。

綜上所述，如何確立靶值在臨床實驗室質量管理中有重要意義。參考方法可在推動臨床實驗室量值溯源工作、提高實驗室檢測質量中起一定作用。質量監管機構應關注EQA樣本的質量，臨床實驗室應關注低濃度Glu測量的可靠性。