PPARγ相關自噬在急性肺損傷中的作用機制研究

史婧 關鍵

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)臨床診斷為急性呼吸窘迫綜合征，主要表現為肺泡及毛細血管的損傷及引起的肺水腫，是敗血癥和肺炎等疾病最嚴重的的并發癥之一，ALI的死亡率仍高達40%[1]，探究ALI發病機制具有重要的臨床意義。炎癥系統的持續激活與ALI的進展和結局有著密切的因果關系，包括腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素(interleukin，IL)-1的增加和抗炎細胞因子的降低[2]。ALI與自噬有關，研究發現自噬會緩解炎性反應，從而保護脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的肺損傷[3]。并且上調自噬的水平會并保護急性肺損傷[4]，但是關于ALI相關自噬的調控機制尚不清楚。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptors γ，PPARγ)是一種轉錄因子，具有促進自噬的作用[5]。此外，一項最新的研究結果顯示PPARγ通路的激活會抑制炎性反應，在ALI中，PPARγ的抑制與炎性反應的激活有關，而激活PPARγ會抑制炎性因子的表達[6]。據此，我們推測PPARγ可能通過調控自噬抑制炎性反應，并可能緩解ALI，本文主要研究PPARγ相關自噬對ALI的影響及相關作用機制。

資料與方法

一、動物及建模方法

雄性BALB/c小鼠(SPF級，8周齡)(Laboratory Animal Cecter，中國)。LPS(Sigma公司，美國)。PPARγ激動劑吡格列酮、PPARγ拮抗劑GW9662(Selleck公司，中國)。小鼠TNF-α、IL-1β酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(北京樂博公司，中國)。蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(武漢華美公司，中國)。倒置顯微鏡(Olympus IX71，Tokyo，Japan)。小動物血氣分析儀ABL90(Radiometer公司，丹麥)。anti-PPARγ、anti-Beclin、anti-LC3、和二抗(Abcam公司，美國)。PVDF膜(Bio-Rad公司，美國)。倒置顯微鏡(Olympus IX71，Tokyo，Japan)。

二、分組及建模方法

將40只小鼠隨機分為4組，即對照組、ALI組、ALI+吡格列酮(PPARγ激動劑)組和ALI+GW9662(PPARγ抑制劑)組，每組10只。通過呼吸道滴注LPS的方式建立小鼠ALI模型[7]，在建模同時，LPS干預6 h前，ALI+吡格列酮組小鼠腹膜內注射吡格列酮(10 mg / kg)激活PPARγ通路，ALI+GW9662組小鼠腹膜內注射GW9662[1 mg / kg，10%(v/v)DMSO]抑制PPARγ通路，連續3 d。小鼠進行血氣分析后使用在5%的戊巴比妥(50 mg / kg)麻醉后通過頸脫位法處死小鼠，收集血液和肺組織用于實驗。

三、檢測指標

1 血氣分析及ALI建模評估

在建模后通過小動物血氣分析儀檢測氧合指數(PaO2/FiO2)，根據參考文獻[8]將PaO2/FiO2<300 mmHg定義為建模成功。

2 HE染色檢測肺組織損傷情況

已經進行血氣分析和BALF采樣后的小鼠處死并取出肺組織，將肺組織固定后包埋在石蠟中。將樣品切成4μm厚的均勻薄片并置于APES涂覆的載玻片上。 使用二甲苯將樣品脫石蠟并水合并用HE試劑染色。加入蘇木精，將樣品在室溫下溫育5min。 洗滌后，加入曙紅，將樣品在室溫下溫育約2min。 在顯微鏡下觀察肺組織損傷情況，并按照參考文獻[9]，根據出血、肺泡水腫以及浸潤的嚴重程度評分，分值為0～4分，分數越高提示肺損傷越嚴重。

3 ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)炎性因子水平

將小鼠麻醉后切開氣管，并插入導管，使用0.5 mL的生理鹽水灌洗抽吸3 次，然后將吸出的BALF離心(2 000 rps)10 min取上清液，通過ELISA檢測BALF中TNF-α和IL-1β濃度，按照試劑盒說明書操作。

4 Western blot檢測PPARγ、Beclin和LC3蛋白

在液氮下將肺組織研磨并使用RIPA裂解緩沖液裂解，并使用BCA蛋白測定試劑盒測量總蛋白含量。然后使用SDS-PAGE分離等量的總蛋白(120 V下電泳90 min)，然后將蛋白轉移到PVDF膜上(50 V，120 min)，在含有5%脫脂牛奶的封閉溶液中封閉。然后將PDVF膜與anti-PPARγ、anti-Beclin、anti-LC3(1∶500稀釋)在4℃孵育過夜，然后加入1∶5 000稀釋的HRP偶聯二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL試劑盒可視化蛋白條帶，并使用ImagePD軟件使用GAPDH作為內參對蛋白條帶的灰度進行定量。

四、統計學處理

所有實驗設立3個復孔。數據以均數±標準差(SD)表示。 統計分析使用SPSS 19軟件。 計數資料進行卡方檢驗，多組計量資料進行單因素方差分析，多組之間兩兩比較使用SNK-q檢驗。 統計學顯著性表示為P<0.05。

結 果

一、各組血氣指標和肺損傷情況比較

ALI組的PaO2/FiO2顯著低于對照組，而肺組織損傷評分顯著高于對照組(P<0.05)。ALI+吡格列酮組的PaO2/FiO2顯著高于ALI組，而肺組織損傷評分顯著低于ALI組(P<0.05)。ALI+GW9662組的PaO2/FiO2顯著低于ALI組，而肺組織損傷評分顯著高于ALI組(P<0.05)。吡格列酮組緩解LPS引起的ALI小鼠模型肺損傷，而GW9662加重肺損傷(見表1、圖1)。

表1 各組小鼠PaO2/FiO2和肺組織損傷評分比較

二、各組小鼠炎性反應的水平比較

ALI組的BALF中TNF-α和IL-1的水平顯著高于對照組(P<0.05)，ALI+吡格列酮組的TNF-α和IL-1顯著低于ALI組(P<0.05)，ALI+GW9662組的TNF-α和IL-1顯著高于ALI組(P<0.05)(見表2)。

圖1 HE染色檢測各組小鼠的肺組織損傷情況(×200)

表2 各組小鼠BALF中TNF-α和IL-1的水平比較

三、各組肺組織中自噬相關蛋白水平

ALI組的肺組織中Beclin和LC3蛋白的水平顯著低于對照組(P<0.05)，ALI+吡格列酮組的Beclin和LC3顯著高于ALI組(P<0.05)，ALI+GW9662組的Beclin和LC3顯著低于ALI組(P<0.05)(見表3、圖2)。

表3 各組Beclin和LC3水平比較

四、各組肺組織中PPARγ水平比較

ALI組的肺組織中PPARγ蛋白水平顯著低于對照組(P<0.05)，ALI+吡格列酮組的PPARγ水平顯著高于ALI組(P<0.05)，ALI+GW9662組的PPARγ水平顯著低于ALI組(P<0.05)(見表4、圖2)。

表4 各組PPARγ水平比較

圖2 Western blot檢測各組肺組織中Beclin、LC3和PPARγ蛋白

討 論

臨床上，ALI一般是由于嚴重創傷、休克、感染和其他因素的彌漫性肺泡炎癥和對毛細血管壁的損害，導致肺水腫并最終導致嚴重的低氧血癥[10]。從組織學上講，人的ALI的特征是在肺部和中性粒細胞性肺炎中出現嚴重的急性炎癥反應。來自微生物病原體(如LPS等)的免疫炎癥刺激物具有誘導肺部炎癥的能力。目前ALI的臨床治療方法包括保護性肺通氣治療、俯臥位通氣、高呼氣末正壓通氣和高頻通氣，但這些治療不能有效降低ALI的死亡率，并且患者最終會遭受肺纖維化，導致永久性肺功能障礙。炎癥反應在ALI中發揮重要作用，但是ALI的炎性機制涉及細胞和細胞因子相互作用，其中關鍵因子和細胞較多，調節機制較為復雜，分析ALI的進展機制對于診斷和治療ALI具有重要意義。

細胞自噬是一種常見的進程，其主要是將受損的細胞器或者大分子蛋白包裹進入自噬小體，然后遞送進入溶酶體分解，將分解的小分子物質如氨基酸、核酸等進行重新利用[11]。細胞的自噬可以幫助調節細胞自身降解，促進細胞在低氧等不利條件下存活，研究顯示當Toll樣受體(TLR)相關的途徑誘導炎癥反應時，它們可以同時觸發細胞自噬，而細胞自噬對TLR信號和炎癥反應具有顯著的負調節作用[12]。在ALI中，研究已經發現了自噬水平的異常，Yang等[13]研究顯示在LPS引起的肺損傷小鼠模型中，自噬水平降低，而提高自噬水會緩解肺損傷程度。Lei等[14]的研究結果顯示自噬水平與炎性因子IL-33相關，提示在ALI中自噬和炎性反應具有相互調節的作用。此外，也有研究發現通過調節自噬的水平會保護膿毒癥小鼠的肺損傷[15]。這些均提示了自噬在ALI炎性反應和疾病進展中的作用，但是具體調控機制還不清楚。

PPARγ是一種轉錄調節因子，其可通過與其配體結合和激活，然后與靶基因啟動子上游的PPAR反應元件相互作用，最終調節靶基因的轉錄并調節細胞中的代謝過程[16]。有研究發現LPS誘導的RAW 264.7細胞急性炎性損傷模型中， PPARγ蛋白水平被抑制，并且PPARγ的激活可以抑制炎癥反應[17]。He等[18]的研究結果顯示羅格列酮通過PPARγ/SGK1依賴性信號通路促進ENaC介導的AFC，減輕ALI小鼠模型的肺水腫。這提示了PPARγ在ALI中發揮抗炎和保護作用。PPARγ也是調節自噬途徑的重要蛋白，而自噬會抑制炎性反應[19]。最新研究發現在克羅恩病中，抑制自噬會促進炎性反應，從而加重病情[20]。Gao等[21]研究發現自噬會通過調節炎性反應緩解炎癥性腸病小鼠模型的癥狀。據此我們推測在ALI中，PPARγ通路會促進自噬和抑制炎性反應緩解肺損傷。在本次研究中，我們分別通過PPARγ激動劑吡格列酮激活PPARγ以及PPARγ拮抗劑GW9662抑制PPARγ，結果顯示在ALI小鼠模型中，PPARγ通路被抑制，而激活PPARγ通路可促進自噬并抑制炎性反應，緩解肺損傷提高肺功能，而抑制PPARγ通路會進一步加重ALI小鼠的肺損傷。

綜上所述，在ALI小鼠模型中，PPARγ相關的自噬會抑制炎性反應，從而減輕肺損傷和提高肺功能。但是關于PPARγ在ALI中的抑制機制仍需要進一步分析，并且自噬和炎性反應互相調節的機制值得進一步研究。