恒溫擴增芯片法對兒童大葉性肺炎病原學檢測的臨床研究

盧紅霞 黃晗 梁利紅 吳琳琳 王蕊

據統計，社區獲得性肺炎是<5歲兒童死亡的主要原因，在我國居兒童死亡原因的首位[1]。大葉性肺炎是臨床常見的獲得性肺炎，多發于兒童群體，具有起病急驟、病程較長等特點，對患兒健康及生命安全造成極大威脅[2]。臨床實踐證實，明確病原菌類型對合理用藥至關重要[3]。且有資料顯示，盡早根據病原學檢測結果采取針對性抗生素治療能降低住院率及30天內死亡率[4]。而傳統細菌培養雖可檢出病原菌，但耗時較長、干擾因素較多，可能導致錯失最佳治療時機，影響疾病轉歸。恒溫擴增芯片法是一種基于環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)原理的檢測方法，從標本處理到報告結果全過程僅需2 h，檢測周期明顯縮短[5]。為此，本研究嘗試分析恒溫擴增芯片法對兒童大葉性肺炎病原學檢測的臨床價值，旨在為臨床診治提供更多途徑。現報告如下。

資料與方法

一、一般資料

選擇2017年10月～2018年10月我院收治的大葉性肺炎患兒500例作為研究對象，其中女182例，男318例，年齡1～10歲，平均年齡(6.23±1.80)歲，病情程度：輕癥290例，重癥210例。本研究經我院委員倫理委員會審批通過。

二、選取標準

1 納入標準

均確診為兒童大葉性肺炎，且符合《兒童社區獲得性肺炎管理指南(2013修訂)(上)》中兒童大葉性肺炎相關診斷標準[6]；入院前病程<1周，未接受抗生素等正規治療；患兒均具備纖支鏡術適應證；血常規、凝血時間、凝血酶原時間、肝功能、心電圖等檢查正常；患兒監護人均知情同意本研究方案，并簽訂支氣管肺泡灌洗術、纖支鏡術同意書；臨床資料完整。

2 排除標準

伴有肝腎功能障礙者；合并心功能不全者；伴有其他感染性疾病者；存在肺結核、支氣管哮喘等其他肺部疾病者；臨床資料缺失者；參與本研究前服用抗生素、免疫抑制劑者。

三、方法

所有患者均于明確病原菌后給予針對性抗生素治療。

1 儀器設備與材料

支氣管肺泡灌洗采用購自日本olympus公司的支氣管纖維鏡，型號為Olympus BF-XP60型(外徑：2.8 mm；內徑：1.2 mm)、BF-1ci3C40(外徑：3.6 mm；內徑：1.2 mm)、BF-MP60(外徑：4.0 mm；內徑：2.2 mm)；上海賴氏電子科技有限公司的熒光顯微鏡(olympuscx21型)；博奧生物有限公司的離心機、恒溫振蕩器(SmartMixerTM24型)及晶芯RTisochip-A恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀；ELMI公司的混懸振蕩器；海爾公司的冰箱(BCD-235F/T型)；法國Gilson公司的加樣器；美國Axygen公司的Eppendor管；法國生物梅里埃公司的VITEK2 compact全自動細菌分析儀。

2 標本采集方法

所有操作均嚴格按照無菌操作要求執行，完善術前準備，選擇合適鏡條，經鼻腔插入，行氣道局部麻醉，插入過程中仔細觀察氣管，尤其是病變部位；拍照后，推注5 mL生理鹽水(37℃)，灌洗后吸出灌洗液，中間不停頓，重復3次，立即將收集的灌洗液裝入涂硅滅菌玻璃容器或硅塑瓶，密封保存，置于含有冰塊的保溫瓶中，送往實驗室，分裝置入-80℃冰箱內凍存，剩余部分標本按常規操作規程行實驗室檢查。

3 常規培養檢測法 參照《全國臨床檢驗操作規程》進行檢測，消毒無菌接種環，冷卻后蘸取標本，分別接種于中國藍平板、血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板，置于培養箱孵化18～24 h，中國藍平板置入普通培養箱，血瓊脂、巧克力平板置入含有5%～10%二氧化碳的培養箱；24 h后觀察培養平板內菌落生長情況，并準確記錄，初步判斷微生物數量；取培養出的主要微生物種類的單個菌落行革蘭染色，根據染色結果行下一步鑒定，將可疑菌落與氯化鈉溶液(濃度為0.45%)在PH值4.5～7.2范圍內混勻，配成0.50～0.63 MCF的菌懸液，將VITEK2革蘭氏陰性與陽性細菌鑒定卡的輸樣管插入到菌液中，按照順序置于載卡架上，采用VITEK2 compact全自動細菌分析儀進行檢測。

4 LAMP檢測方法

根據GenBank公布的病原菌相對保守段基因序列，通過BLAST、Align X和Primer5.0程序選擇并設計13種下呼吸道感染常見病原體的6條引物，其中包括兩條外引物(F3、B3)、兩條內引物(FIP、BIP)及兩條環結合引物(FL、BL)(見表1)。引物序列由北京博奧生物有限公司合成(即為所檢測的13種病原菌)，以每管20ul 分裝后于-20℃保存。

表1 LAMP引物設計

按照痰液標本液化、清洗、提取標本核酸、核酸檢測的順序進行檢測，根據陽性外對照的已知拷貝數和出峰時間(Tp值)確定標準曲線，利用RTisochip-A分析軟件校正Tp值后再運用Calculator軟件計算檢出標本細菌濃度(copies/mL)。結果判定：標本病原體濃度≥1×103copies/mL判定為感染，檢出濃度<1×103copies/mL判定為定植病原體。

5 支原體檢測方法

對采集的所有肺泡灌洗液標本進行支原體抗體、支原體支原體聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction，PCR)的核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)檢測，并以支原體PCR RNA檢測結果為金標準，分析對比三種檢測方法對支原體診斷敏感性、特異性。

四、療效判定標準

(1)臨床判定標準：根據癥狀、體征、實驗室檢查(白細胞計數、中性粒細胞百分比，炎癥相關指標、血氣分析等)及影像學檢查結果分為好轉、維持、加重。(2)LAMP檢測判定標準：好轉：原檢出病原體消失或檢測拷貝數下降幅度≤1個數量級為好轉；維持：原檢測病原體拷貝數下降或上升<1個數量級，或無變化；加重：原病原體拷貝上升≥1個數量級或檢出新的病原體。

五、觀察指標

(1)細菌培養結果。(2)LAMP檢測結果。(3)細菌培養與LAMP檢測一致性分析。(4)LAMP檢測支原體診斷敏感性、特異性。(5)療效評估。

六、統計學方法

應用SPSS 22.0 軟件進行統計分析實驗數據，等級資料采用Ridit檢驗，一致性分析采用Kappa檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、細菌培養結果

細菌培養，180例標本呈陽性，陽性率為36.00%，以鮑曼不動桿菌(47.78%)、銅綠假單胞菌(26.11%)為主(見表2)。

二、LAMP檢測結果

LAMP檢測，291例標本呈陽性，陽性率為58.20%，鮑曼不動桿菌(20.96%)、耐甲氧西林葡萄球菌(19.93%)、銅綠假單胞菌(12.03%)居于前三位(見表3)。

表2 細菌培養結果

表3 LAMP檢測結果

典型病例：王某，男，年齡8歲，以發熱伴咳嗽、伴胸悶、胸痛為主訴入院就診，胸片或肺部CT檢查顯示肺野呈斑片狀密度增高影，懷疑為肺部感染，經氣管鏡下采集氣道分泌物，行LAMP檢測，證實大腸埃希菌呈陽性，結合影像學檢查結果，確診為大葉性肺炎。

三、一致性分析

LAMP檢測與細菌培養的陽性符合率為66.67%，經Kappa分析顯示，LAMP檢測與細菌培養的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌一致性較高(P<0.05)；其余病原菌Kappa值均<0.4，一致性欠佳(見表4)。

四、支原體診斷敏感性、特異性

支原體PCR RNA檢測出35例肺炎支原體感染，以此為金標準。LAMP檢測支原體診斷敏感性94.29%、特異性99.35%高于支原體抗體檢測77.14%、90.11%(P<0.05)，且與支原體PCR RNA檢測結果相當(見表5)。

表4 一致性分析

表5 支原體診斷敏感性、特異性

五、療效評估

Ridit檢驗顯示，LAMP檢測療效評估結果與臨床療效評估結果無明顯差異(P>0.05)(見表6)。

表6 療效評估(n=291)

討 論

兒童大葉性肺炎是臨床常見肺炎類型之一，流行病學調查顯示，其發病率可達到0.4%～1.6%左右，需給予重視[7-8]。肺炎發病主要是由于病毒、細菌、衣原體、支原體等多種病原微生物感染而致，臨床表現不一，僅依靠胸部X線檢查及臨床表現無法有效區分病原體類型[9-10]。而研究指出，明確病原學對合理治療、降低死亡率尤為重要[11-12]。故需盡快建立更快速、敏感和準確的病原學診斷方法。

目前，細菌培養是臨床診斷肺炎感染病原菌的金標準，但其操作復雜、時間較長，無法達到在疾病早期快速診斷的目的，可能延誤最佳治療時機，影響病情轉歸及預后改善[13]。劉志遠等[14]研究中對94例合格痰標本采用恒溫擴增芯片法、細菌培養進行病原學檢測，前者檢出63株病原菌，后者檢出10株病原菌。本研究發現，LAMP檢測出13種病原體，遠遠超過細菌培養所檢出的7種病原菌，與上述研究結果相符，提示LAMP檢測可顯著提高病原體檢出率，存在明顯優勢。LAMP是一種新型分子生物診斷技術，主要依賴于特異的外部引物與內部引物對靶基因6個特定區域進行識別，同時利用具備鏈置換特性的脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)聚合酶，于等溫條件下實現恒溫快速擴增，不僅能從微量拷貝中獲得目的基因，從而促使檢出率明顯上升，還具有操作簡便、費用低廉、擴增反應快等優勢，為快速檢驗病原學提供新途徑[15-17]。同時，LAMP檢測時設定有Tp值，在一定時間內擴增拷貝數達到一定數量才可判定為陽性，可有效區分定植菌與致病菌，從而避免將所有能檢測到病原體DNA的標本都判斷為陽性，減少假陽性發生[18]。且在大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌等兒童大葉性肺炎主要致病菌方面，經Kappa分析，LAMP檢測與細菌培養一致性較高，證實LAMP檢測與細菌培養，在檢出主要病原體方面具有較高一致性。但LAMP與細菌培養的總體陽性符合率僅為66.67%，主要是由于細菌培養檢出病原菌類型少，假陰性現象嚴重，而LAMP檢測檢出嗜肺軍團菌、肺炎鏈球菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、結核分枝桿菌復合群、金黃色葡萄球菌等病原體，故導致兩者陽性符合率欠佳。提示臨床在檢測小兒大葉性肺炎病原體時可優先選擇恒溫擴增芯片法，既可顯著提高病原體檢出率，還可縮短檢驗周期，快速明確病原學種類，有利于及時采取針對性抗生素治療，一定程度上降低死亡風險。

肺炎支原體屬于常見肺炎病原體，嚴重影響患兒生命健康[19]。臨床多通過支原體抗體檢測明確其感染情況，但干擾因素較多、診斷敏感性欠佳。支原體PCR RNA檢測為肺炎支原體診斷金標準，具有操作簡便、高特異性、高敏感性等特點，但對環境及儀器設備要求較高，無法區分定植菌和致病菌，亦不能進行藥敏試驗[20-21]。本研究表明，LAMP檢測支原體診斷敏感性為94.29%、特異性為99.35%，顯著高于支原體抗體檢測，且與支原體PCR RNA檢測結果相當，說明LAMP檢測可作為臨床檢測肺炎支原體感染的首選方法。推測原因，LAMP檢測過程中擴增產物大，易檢測，從而提高診斷敏感性，同時要求4條特異性引物完全匹配靶基因6個不同位點，有利于保障高度特異性[22]。此外，在上述研究結果基礎上，本研究進一步分析LAMP檢測在療效評估中的應用價值，發現其評估結果與臨床依據癥狀、體征、實驗室檢查及影像學檢查結果判定療效無明顯差異，可見其可以為臨床判定療效、合理調整治療方案提供可靠信息，有利于促進病情轉歸。

綜上可知，恒溫擴增芯片法應用于兒童大葉性肺炎病原學檢測中可同時檢測出13種病原體，顯著提高病原菌檢出率，且對支原體診斷敏感性、特異性較高，有利于快速診斷、及時制定針對性治療方案，還可為評估療效提供參考依據。