miRNA-155與TP53INP1 mRNA在非小細胞肺癌患者胸水脫落細胞中的表達及其臨床意義

李威 史小芳 崔晶剛 林盪 周俊東

微小RNA(miRNA)是一種真核生物中廣泛存在的長度約22nt的內源性短鏈RNA分子，無法進一步轉譯成蛋白質的RNA，可通過與靶信使mRNA的3’UTR區域互補結合，從而抑制轉錄后基因表達，在調控基因表達、細胞周期、生物體發育時序等方面起重要作用[1]。本研究實時定量PCR方法測定胸水中TP53INP1 mRNA與miRNA-155的表達，分析其表達在非小細胞肺癌合并惡性胸腔積液患者臨床意義以及預后相關性。現報道如下。

資料與方法

一、一般資料

選取2016年2月至20017年6月在南京醫科大學附屬蘇州醫院呼吸內科住院的惡性胸腔積液患者42例，男22例、女20例，年齡30歲～69歲，平均(54.3±4.1)歲。細胞學或組織病理學證實，其中腺癌26例、鱗癌16例，均為初治患者。選取良性胸腔積液患者21例，男13例、女8例，年齡18歲～70歲，平均(45.7±8.2)歲。其中結核性胸膜炎8例、肺炎7例、心衰4例、尿毒癥2例。良性胸腔積液診斷均經過細胞學、影像學檢查及臨床隨訪證實。

1 標本采集

征得受試者知情同意后，對患者常規胸腔B超定位后行胸腔穿刺術，留取第2，3管胸水50mL分別置于兩個肝素抗凝瓶中。提取分離試劑盒由北京天根生化科技有限公司提供。按操作步驟提取胸腔積液RNA。

2 研究方法

引物及內參: 帶有柄環結構的引物由廣州銳博生物科技有限公司提供，參考Chen等[2](見表1)。實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR) : 提取總RNA、反轉錄cDNA 和 cDNA 樣品作為模板，檢測胸水脫落細胞中TP53INP1 mRNA、miRNA-155。反轉錄系統: 逆轉錄buffer 2ul、引物0.2ul、dNTP 0.1ul、逆轉錄酶MMLV 0.5 ul、DEPC水5 ul、RNA模版 2 ul、總體積10 ul，逆轉錄成cDNA放置-20℃保存備用。實時定量熒光PCR,SYBR Green染料10ul、上游引物1 ul、下游引物1 ul、dNTP 1ul、Taq聚合酶2ul、待測樣品cDNA 5ul、ddH2O 30 ul、總體積50ul(94℃ 15s，60℃ 60s) 50個循環，每個循環結束時PCR儀自動檢測一次熒光值。在實時熒光定量PCR技術中，計算機自動輸出每個cDNA模版標本的擴增曲線、CT值。由軟件自動計算待測樣品,TP53INP1mRNA與miRNA-155,U6RNA含量。以U6RNA作為內參，采用實時定量PCR中的相對定量法，以N=2-△Ct表示胸水miRNA相對表達量，其中△Ct表示mRNA與內參U6RNA的CT之差。

二、統計學處理

表1 RT-PCR引物序列及內參

結 果

一、TP53INP1mRNA與miRNA-155在惡性胸水及良性胸水的表達及其相關性

表2 miRNA-155 和TP53INP1mRNA在良惡性胸水脫落細胞表達水平

二、惡性胸腔積液TP53INP1mRNA及miRNA-155的表達與臨床病理參數關系

惡性胸腔積液miRNA-155及TP53INP1mRNA表達與患者年齡，性別、腫瘤類型、腫瘤直徑及淋巴結是否轉移無相關性，惡性胸腔積液miRNA-155及TP53INP1mRNA表達與腫瘤分化程度存在相關性，腫瘤低度分化組miRNA-155表達明顯高于高度分化組，差異有統計學學意義(見表3)。

三、惡性胸腔積液 miRNA-155的表達與臨床預后關系

42例惡性胸腔積液隨訪日期至2019年6月，結果42例惡性胸腔積液患者全部死亡，中位生存時間為321天。依據miRNA-155表達水平，將42例惡性胸水患者平均分為高表達組，低表達組。兩組患者隨訪期間治療情況及意外死亡事件發生率差異無統計學意義(見表4)。miRNA-155表達與患者生存時間明顯相關，高表達組生存時間明顯長于低表達組，高、低表達組中位生存時間分別為253d、383d，兩組差異有統計學意義(見圖1)。

表3 TP53INP1mRNA的表達與非小細胞肺癌的臨床病理參數關系

表4 非小細胞肺癌患者miRNA-155高表達組與低表達組治療情況

圖1 惡性胸腔積液miRNA-155表達亞組的生存分析

討 論

miRNA在物種間具有較高的保守性、時序性和組織特異性，可能參與決定細胞和組織的功能特異性。miRNA的生物學功能主要通過調控靶基因的表達來實現的，它們與靶基因組成了一個復雜的調控網絡，控制細胞及個體的重要生命活動[3]。

大量研究證實miRNA-155在甲狀腺癌[4]、乳腺癌[5]、肺癌[6]、結腸癌[7]等多種癌組織、血液，體液中高表達。本課題組前期的實驗結果也提示檢測胸水miRNA-155的表達對診斷惡性胸水具有較高的特異性、敏感性，對惡性胸水的診斷具有一定的價值[8]。本研究采用實時定量PCR技術檢測miRNA-155在NSCLC胸水中表達量，分析其與惡性胸腔積液患者臨床病理特征相關性，未發現與性別，年齡，病理類型，腫瘤大小、淋巴結是否轉移的相關性，但發現高miRNA-155表達與腫瘤細胞低度分化有關，提示miRNA-155可能參與腫瘤細胞分化等生物學過程。本研究miRNA-155表達與患者生存時間單因素相關性分析，兩組患者隨訪期間治療方案及意外死亡事件發生率差異無統計學意義，惡性胸水組中miRNA-155高表達組、低表達組中位生存時間分別為253d、383d，兩組差異有統計學意義。提示miRNA-155高表達提示惡性胸水患者生存時間減少，預后差，與Yanaihara等[9]和Donnem等[10]的兩項非小細胞肺癌臨床研究文獻報道相符。Yanaihara等[9]研究了64例一期的肺腺癌患者，發現高miRNA-155和低let-7的表達是獨立的預后負面預測因子。Donnem等[10]采用原位雜交技術研究191例鱗癌，95例腺癌，31例大細胞癌和18例肺泡細胞肺癌患者，研究結果提示，miRNA-155在癌組織較癌旁組織中表達上調，miRNA-155在各種病理亞型中無顯著性差異，miRNA-155高表達組患者生存率明顯下降。本研究不足之處，由于初始資料樣本量限制，缺少亞組生存分析，以及多因素回歸分析，有待樣本量擴大，進一步研究。

TP53INP1是一種轉錄因子，TP53INPl能與P53、P73相互作用，誘導Caspase-3級聯反應來介導細胞凋亡,在細胞應激極化時表達上調,能使細胞周期發生停滯，通過抗增殖、促凋亡來調節細胞穩定性[11]。應用生物信息學方法，miRNA-155靶向調節TP53INP1,miRNA-155與TP53INP1 mRNA3’-UTR結合，引起mRNA翻譯中止，或誘導其降解，調控基因表達[12]。Gironella等[13]在對胰腺癌的研究中發現，miRNA-155在胰腺癌組織中的表達明顯高于正常組織，miRNA-155能在轉錄水平調節TP53INPl，抑制內源性TP53INPl的表達，促進腫瘤的發生。本研究發現惡性胸水患者miRNA-155表達與胸水細胞TP53INP1mRNA呈負相關，提示miRNA-155可能通過調控TP53INP1通路，從而在肺癌發生中起癌基因的作用，但是miRNA-155在肺癌中是否還調控其他信號通路及具體調控機制，還需要進一步的研究證實。

綜上所述．miRNA-155的高表達對診斷惡性胸水具有一定的價值,miRNA-155高表達提示預后差，生存時間減少，其可能靶向TP53INP1基因參與肺癌的發生和發展過程中發揮重要作用，下調miRNA-155表達可抑制肺癌細胞的增殖，誘導細胞凋亡，有可能成為肺癌治療的靶基因。