慢性阻塞性肺疾病和支氣管哮喘患者社區(qū)獲得性肺炎時(shí)病原學(xué)檢測(cè)情況及分析

余小麗 陳愉生 林明 岳文香 林曉紅 胡辛蘭

慢性阻塞性肺疾病(COPD)和支氣管哮喘是常見(jiàn)的慢性氣道疾病，嚴(yán)重危害人民身體健康，目前針對(duì)此類(lèi)疾病合并患有社區(qū)獲得性肺炎時(shí)病原學(xué)傳統(tǒng)檢測(cè)方法陽(yáng)性率低，本課題組研發(fā)建立了可檢測(cè)包括多種細(xì)菌和病毒在內(nèi)的急性呼吸道傳染性疾病病原體的液態(tài)芯片快速檢測(cè)技術(shù)，具有較好的靈敏度和特異度[1]。本文主要分析我院呼吸科COPD和或支氣管哮喘患者患社區(qū)獲得性肺炎時(shí)，使用液態(tài)芯片法和實(shí)時(shí)熒光定量法細(xì)菌和病毒的檢出情況，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

一、研究對(duì)象

研究對(duì)象為2012年3月至2015年9月福建省立醫(yī)院呼吸內(nèi)科慢性阻塞性肺疾病(COPD)和支氣管哮喘患者同時(shí)符合社區(qū)獲得性肺炎診斷者。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合下列條件：(1)患者出現(xiàn)咳嗽、痰粘稠，肺部出現(xiàn)濕啰音，并有下列情況之一：①發(fā)熱；②白細(xì)胞總數(shù)和(或)中性粒細(xì)胞比例增高；③胸部X線(xiàn)顯示肺部有浸潤(rùn)性病變；(2)符合2007中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸分會(huì)制定的COPD標(biāo)準(zhǔn)[2]和或符合2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制定的支氣管哮喘標(biāo)準(zhǔn)[3]。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴住院24小時(shí)內(nèi)死亡或自動(dòng)出院患者；⑵明確或高度懷疑為肺結(jié)核、肺部真菌感染患者；⑶艾滋病或人類(lèi)免疫缺陷病毒感染患者；(4)無(wú)痰/肺泡灌洗液。

二、標(biāo)本收集及處理

收集福建省立醫(yī)院呼吸內(nèi)科2012年3月到2015 年9月期間符合要求病例痰或者肺泡灌洗液標(biāo)本，標(biāo)本均在入院當(dāng)天或者第二天早上收集，痰液用痰稀釋液消化10分鐘，將消化后痰液、肺泡灌洗液分裝三份，一份用于微生物細(xì)菌培養(yǎng)，另兩份凍存于-70℃冰箱中。細(xì)菌核酸提取試劑盒為北京艾德萊公司生產(chǎn)。病毒核酸提取試劑盒為T(mén)akala公司生產(chǎn)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由北京艾德萊生物科技有限公司生產(chǎn)；PCR試劑盒(DBI-2040 Bestar Taq DNA Polymerase)由上海星漢生物科技有限公司生產(chǎn)；熒光定量PCR試劑盒由上海之江生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；所有的試劑均在有效期內(nèi)使用。多功能流式點(diǎn)陣儀(液相芯片Luminex 100)由美國(guó)Luminex公司生產(chǎn)；熒光PCR儀為ABI公司的7500型。

三、實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果判讀

1 微生物細(xì)菌培養(yǎng)

應(yīng)用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀(VITEK-2)進(jìn)行檢測(cè)：按美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)2010年執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。

2 液態(tài)芯片方法

液態(tài)芯片檢測(cè)細(xì)菌:金黃色葡萄球菌(SA)、肺炎鏈球菌(SP)、肺炎克雷伯桿菌(KP)、鮑曼不動(dòng)桿菌(AB)、銅綠假單胞菌(PA)、嗜麥芽窄食單胞菌(SM)。非典型致病菌：肺炎支原體(MP)、肺炎衣原體(CP)；病毒：甲型流感病毒(FLUA)、甲型流感病毒N1型(N1型)、甲型流感H5型(H5型)、巨細(xì)胞病毒(HCMV)、腺病毒(AD)、人副流感病毒1-3型(PIV1、PIV2、PIV3)、人偏肺病毒(HMPV)、人博卡病毒(HBOV)、呼吸道合孢病毒(RSV)。檢測(cè)步驟及判定：按照試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作，提取DNA或RNA，其中RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR 2個(gè)小時(shí)，雜交后用Luminex100進(jìn)行判讀，一次可檢測(cè)12種呼吸道細(xì)菌或病毒，7～8小時(shí)內(nèi)完成96份標(biāo)本的檢測(cè)。檢測(cè)MFI(平均熒光強(qiáng)度)≥200則判定為陽(yáng)性，MFI<150則判為陰性，而150≤MFI<200可判定為可疑陽(yáng)性，則再進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)樣品一次，若檢測(cè)結(jié)果MFI≥150則判定為陽(yáng)性，若MFI<150則判定為陰性。

3 RT-PCR方法

(1)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作，提取RNA，加入混合液及酶后，應(yīng)用熒光定量PCR儀(ABI7500)進(jìn)行檢測(cè)，一次檢測(cè)一種病毒，分別檢測(cè)上述9種(11亞型)病毒。(2)結(jié)果判讀：通過(guò)計(jì)算Ct值進(jìn)行結(jié)果判讀，F(xiàn)AM UNDET或40，樣本低于檢測(cè)限，報(bào)告為陰性；Ct≤38報(bào)告為陽(yáng)性；38≤FAM<40之間，復(fù)檢一次，如仍為38≤FAM<40，則報(bào)告為陰性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0匯總分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、COPD和哮喘患者患社區(qū)獲得性肺炎時(shí)細(xì)菌感染情況

2012年3月至2015年9月我院呼吸內(nèi)科COPD和或支氣管哮喘患者同時(shí)患社區(qū)獲得性肺炎的住院患者共入選病例113例。以液態(tài)芯片法從113例標(biāo)本中檢測(cè)出54株細(xì)菌，陽(yáng)性率47.7%(95%CI:43.0%,56.9%)，其中檢出肺炎鏈球菌(SP)13株、金黃色葡萄球菌(SA)3株、肺炎克雷伯桿菌(KP)11株、銅綠假單胞菌(PA )12株、鮑曼不動(dòng)桿菌(AB)6株、嗜麥芽窄食單胞菌(SM)6株。合計(jì)革蘭陽(yáng)性菌16株、革蘭陰性菌35株。

傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法檢出細(xì)菌9株，陽(yáng)性率7.9%(95%CI:2.95%,12.8%)，其中SA 1株、KP 1株、PA 3株、AB 1株、SM 2株。液態(tài)芯片法和傳統(tǒng)方法相比，細(xì)菌總體檢出率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 細(xì)菌感染情況

二、COPD和哮喘患者患社區(qū)獲得性肺炎時(shí)病毒和非典型病原菌感染情況

以液態(tài)芯片法113例中檢出病毒共51株，陽(yáng)性率45.1%(95%CI:35.9%,54.3%)，其中甲型流感病毒(FLUA)22株、甲型流感H5型(H5型)1株、巨細(xì)胞病毒(HCMV) 21株、腺病毒(AD)1株、人副流感病毒1-3型(PIV1、PIV2、PIV3)4株、人偏肺病毒(HMPV)1株、肺炎支原體或衣原體 1株。

RT-PCR法共檢出病毒53株，檢出率為46.9%(95%CI:37.7%,56.1%)，其中檢出FLUA 19株、HCMV 23株、PIV 4株、RSV2株、HMPV 2株、CP+EP 3株。兩者病毒總體檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 病毒及非典型病原菌感染情況

三、COPD和哮喘患者患社區(qū)獲得性肺炎時(shí)下呼吸道混合病原體檢出情況

細(xì)菌檢測(cè)以微生物培養(yǎng)法及液態(tài)芯片法任一陽(yáng)性者判定為陽(yáng)性，病毒檢測(cè)以液態(tài)芯片法或RT-PCR法任一陽(yáng)性者判定為陽(yáng)性，113例中同時(shí)檢出細(xì)菌和病毒18例，混合檢出率為15.9%(95%CI:9.16%,22.6%)，混合病原菌中巨細(xì)胞病毒達(dá)12株，肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌合并感染為多。

四、COPD和支氣管哮喘病原學(xué)分布

113例中單純患COPD 63例(55.7%)，支氣管哮喘35例(31.0%)，COPD合并支氣管哮喘15例(13.3%)。按液態(tài)芯片法，63例COPD患者檢出革蘭陰性菌19株，檢出率30.2%(95%CI: 18.9%,41.5%)，以銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯桿菌為主；檢出革蘭陽(yáng)性菌11株，檢出率為17.4%(95%CI:8.0%,26.8%),以肺炎鏈球菌為主。35例支氣管哮喘檢出革蘭陰性菌11株，檢出率31.4%(95%CI:16.0%,46.8%)，銅綠假單胞菌(3株)、肺炎克雷伯桿菌(3株)、鮑曼不動(dòng)桿菌(3株)、嗜麥芽窄食單胞菌(2株)散在分布；檢出革蘭陽(yáng)性菌6株，檢出率17.1%(95%CI:4.6%,29.6%)，以肺炎鏈球菌為主。COPD和支氣管哮喘，革蘭陰性菌檢出率對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；二者革蘭陽(yáng)性菌檢出率對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

按RT-PCR法，COPD病毒檢出31株，檢出率49.2%(95%CI:36.9%,61.5%),支氣管哮喘檢出病毒11株，檢出率31.4%(95%CI:16.0%,46.8%)，均以甲型流感病毒和巨細(xì)胞病毒為主；病毒檢出率相比，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

五、病毒檢測(cè)陽(yáng)性者人口學(xué)特征、時(shí)間分布和基礎(chǔ)疾病

入選113例患者中，年齡分布27～91歲，平均年齡70歲，男性83例(73.5%)，女性30例(26.5%), 病毒檢測(cè)陽(yáng)性者年齡為71±10歲，病毒檢測(cè)陰性者年齡為69±12歲，兩組年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4)。 RT-PCR法檢出甲型流感病毒19株，時(shí)間主要分布在3月(7株)和7月(6株)，其他月份分布在4月(2株)、8月(2株)、9月(1株)和10月(1株)。檢出巨細(xì)胞病毒23株，分布在3、4、5月共8株，7、8月共4株，9、10、11月共6株，12、1月共5株。病毒檢測(cè)陽(yáng)性者42例患者中，心功能不全17例，病毒檢測(cè)陰性者72例患者中心功能不全為24例，兩組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表3)。病毒檢測(cè)陽(yáng)性者合并有糖尿病2例，合并腦梗塞1例，無(wú)合并肺外惡性腫瘤。

表3 病毒陽(yáng)性者和陰性者年齡和心功能比較

討 論

慢性阻塞性肺疾病和支氣管哮喘是影響人們?nèi)粘Ｉ钯|(zhì)量的重要公眾健康問(wèn)題，隨著人口老齡化全球疾病負(fù)擔(dān)逐年增加。細(xì)菌、病毒和非典型病原體感染是COPD和支氣管哮喘急性加重的重要原因，目前臨床上疑似呼吸道感染的常規(guī)檢查主要依靠微生物實(shí)驗(yàn)室診斷及血清學(xué)檢測(cè)，但往往陽(yáng)性率低，難以做到快速診斷。對(duì)于細(xì)菌感染方面，本文通過(guò)液態(tài)芯片法檢出細(xì)菌的陽(yáng)性率(47.7%)高于微生物培養(yǎng)法(7.9%)；慢性阻塞性肺疾病和支氣管哮喘通過(guò)兩種檢測(cè)方法，顯示均以檢出革蘭陰性菌為主，與大部分研究相符[4-7]，國(guó)內(nèi)研究顯示革蘭陰性菌以銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯桿菌為突出[4-6]，國(guó)外Wark PA等學(xué)者研究顯示以流感嗜血桿菌和銅綠假單胞菌為主[7]。上述研究還可見(jiàn)革蘭陰性菌如銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等相對(duì)于革蘭陽(yáng)性菌如肺炎鏈球菌多見(jiàn)于反復(fù)多次住院患者。從本文研究結(jié)果也可得知 COPD和支氣管哮喘患者社區(qū)獲得性肺炎時(shí)細(xì)菌感染種類(lèi)相似，反復(fù)多次住院者應(yīng)重視革蘭陰性菌感染可能。液態(tài)芯片法較高檢出率，為臨床工作提供幫助之時(shí)也存在無(wú)法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的弊端；此外COPD和支氣管哮喘常常因肺部感染反復(fù)加重，發(fā)展至結(jié)構(gòu)性肺病呼吸道常存在定植菌可能，故兩種方法檢測(cè)結(jié)果都不能排除其為定植菌可能，不能根據(jù)結(jié)果簡(jiǎn)單判別為患者的感染病原體，需根據(jù)臨床信息相互補(bǔ)充共同判斷是否為致病原，以指導(dǎo)下一步臨床診療。

AECOPD 患者中有下呼吸道病毒感染在Mohan A[8]等學(xué)者研究中，平均加權(quán)流行率為34.1%，另有報(bào)道約30%～80%的哮喘急性發(fā)作患者中，病毒感染發(fā)揮了作用，合并有流感病毒感染的哮喘患者常常需要住院治療[9]。Perotin JM等學(xué)者在COPD急性呼吸道感染前瞻性研究中應(yīng)用RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)有44%存在病毒感染，以人鼻病毒(20%)和人偏肺病毒(18%)為多，而流感病毒占6%[10]。本研究COPD和哮喘總體人群以RT-PCR法檢測(cè)病毒均以甲型流感病毒(16.8%)和巨細(xì)胞病毒(19.6%)為主，并且提示這兩種氣道疾病病毒檢出率無(wú)差別。與國(guó)外學(xué)者研究結(jié)果差異，可能是由于檢測(cè)的病毒種類(lèi)的未完全一致，導(dǎo)致檢出率構(gòu)成比的差異，期待未來(lái)更多的研究一起揭示病毒感染構(gòu)成比情況。

甲型流感在本研究中多在3月和7月，甲型流感病毒感染后，產(chǎn)生的α腫瘤壞死因子及白細(xì)胞介素13可提高氣道高反應(yīng)性導(dǎo)致病情加重[11]。流感疫苗是預(yù)防流感發(fā)病與流行的有效手段[12]，研究中所有病例均未接種流感病毒疫苗，故增強(qiáng)慢性氣道疾病人群的流感疫苗接種意識(shí)，可有望減少相關(guān)疾病負(fù)擔(dān)。巨細(xì)胞病毒在本次研究中檢出率無(wú)明顯季節(jié)聚集性。巨細(xì)胞病毒在人群中感染普遍，常為無(wú)癥狀的隱性感染，在免疫力低下時(shí)易于播散感染。部分COPD和哮喘患者長(zhǎng)期使用激素，可影響免疫功能狀態(tài)，增加潛伏巨細(xì)胞病毒感染風(fēng)險(xiǎn)。需要指出的是，本次研究檢測(cè)出病毒陽(yáng)性是否為本次患者感染的病原尚不能區(qū)分，結(jié)合HCMV-IgM或IgG血清學(xué)檢查及臨床特點(diǎn)可綜合評(píng)估是否為現(xiàn)癥感染。綜合分析基礎(chǔ)上早期應(yīng)用抗病毒治療可防止病情惡化和縮短住院時(shí)間。在檢測(cè)方法上，本研究病毒和非典型病原體檢出率上使用液態(tài)芯片法(45.1%)和RT-PCR法(46.9%)均較高，兩種方法相比無(wú)明顯差異，但RT-PCR價(jià)格昂貴，一次只能檢測(cè)一種病毒；液態(tài)芯片技術(shù)可對(duì)同一個(gè)微量樣本中的多個(gè)不同分子同時(shí)進(jìn)行快速的定性、定量分析，價(jià)格相對(duì)低廉，有望在臨床進(jìn)一步推廣。

COPD和支氣管哮喘，下呼吸道感染中細(xì)菌和病毒也常常合并感染，Mallia等[13]使用鼻病毒感染中度COPD患者發(fā)現(xiàn)60%COPD患者病毒感染后發(fā)生了繼發(fā)性細(xì)菌感染。本研究細(xì)菌和病毒混合檢出率為15.9%，以巨細(xì)胞病毒合并條件致病菌感染為多。而針對(duì)成人巨細(xì)胞病毒肺炎合并細(xì)菌感染的發(fā)病機(jī)制研究較少，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，COPD和支氣管哮喘社區(qū)獲得性肺炎時(shí)，細(xì)菌和病毒均具有較高檢出率，部分存在混合感染。液態(tài)芯片法可檢測(cè)細(xì)菌、病毒，具有快速、高通量特點(diǎn)，對(duì)臨床病原學(xué)分析可提供重要臨床線(xiàn)索，早期進(jìn)行針對(duì)性病原學(xué)治療，可一定程度上減少疾病負(fù)擔(dān)。