從相關到因果：運動與腸道菌群
--腸--腦軸

杜然浩，宋 剛*，趙吉春

機體微生物與人是一種共生關系，在一定的條件下通過互相作用實現共同生存。大部分菌群存在于腸道中，構成腸道菌群這一復雜系統。腸道菌群與宿主健康之間的關系，一直是生命科學研究的熱點。目前，運動與腸道菌群-腸-腦（microbiota-gutbrain，MGB）軸之間的研究引起了研究者的興趣，并取得了一定數量的成果。需要指出的是，運動與MGB軸的研究不夠深入，很多情況下都只發現了相關性的證據，缺少因果關系（Brunkwall et al.，2017）。本文對運動與MGB軸研究的因果范式進行了梳理。

1 腸道菌群--腸--腦交互作用及可能機制

人類很早就知道腸道菌群能夠影響大腦生理和行為。黃帝內經有“心合小腸”的表述，中醫據此總結出“心與小腸相表里”的理論并用于實踐（李艷等，2019）。西方醫學奠基人希波克拉底提出，所有的疾病都始于腸（Gasbarrini et al.，2016）。胃腸道內的微生物群落是一個復雜的生態系統，由與宿主共生的腸道菌群組成，影響著人體的營養、代謝和免疫功能。研究表明，腸道菌群與一些復雜的疾病有關，如肥胖、糖尿病和癌癥（Zitvogel et al.，2018a）而且還與精神類疾病有關，包括中風、癲癇、帕金森病、焦慮、抑郁癥、孤獨癥和精神分裂癥等疾病（Dan et al.，2020；Siopi et al.，2020；Tengeler et al.，2020；）。腸道菌群是宿主免疫穩態的中心調節因子（Levy et al.，2017；Zitvogel et al.，2018b），其失調可能參與了中樞（如多發性硬化）和外周（如類風濕關節炎）自身免疫性疾病的發?。℉indson，2017；Zhang et al.，2015）。這些研究表明，腸道菌群可通過腸-腦軸影響宿主行為（Mao et al.，2020）。MGB軸的交互作用途徑包括迷走神經、腸道菌群代謝物（如神經遞質和短鏈脂肪酸）和免疫系統等（Sherwin et al.，2016）。

1.1 迷走神經

迷走神經是人體主要的副交感神經，在調節心率、支氣管收縮和腸道運動等多種器官功能方面起著關鍵作用。刺激副交感神經通路具有抗炎作用，能夠引起促炎細胞因子的產生減少，減弱全身炎癥反應（Borovikova et al.，2000）。迷走神經并不直接與腸道菌群相互作用，而是通過腸道菌群的代謝產物和腸道菌群介導的腸道上皮細胞分泌物來感知菌群信號（Bonaz et al.，2018）。研究表明，蛋白質能夠通過迷走神經從腸道轉運到大腦。2016年12月，Timothy發表在頂級期刊Cell上的論文報道，腸道菌群及其代謝物可通過MGB軸途徑治療帕金森癥，這是帕金森癥治療的腸源性因果證據，為帕金森癥的生物活性靶向藥物研發指出了新的方向（Sampson et al.，2016）。小鼠的迷走神經完整，且編碼α-Syn基因存在的情況下，α-Syn蛋白才能擴散到大腦。研究者觀察到，α-Syn蛋白通過迷走神經擴散到大腦后，分泌多巴胺的神經元大量死亡，同時小鼠表現出類帕金森癥的認知、運動功能障礙和焦慮等癥狀。而切斷迷走神經，就可以預防上述癥狀出現。這項研究表明，α-Syn蛋白可以沿著迷走神經從小腸傳播到大腦，阻斷α-Syn傳播途徑可能是預防帕金森病的關鍵（Kim et al.，2019），α-Syn蛋白的迷走神經通路在腸-腦軸起重要作用。

1.2 腸道菌群代謝物

腸道菌群能夠產生大量代謝物，主要是神經遞質和短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）鹽，進而影響大腦的生理和行為。神經遞質主要包括去甲腎上腺素、多巴胺和γ-氨基丁酸（Taj et al.，2018）。自閉癥小鼠腸道菌群中的雙歧桿菌屬和布勞特氏菌屬細菌水平較低，伴隨著腸道色氨酸和膽汁酸分泌不足，二者都負責生成血清素這一神經遞質（Golubeva et al.，2017）。同樣腸道菌群失調的現象也在人體實驗中發現，自閉癥兒童體內的韋榮氏球菌、糞球菌和普雷沃菌水平均低于正常兒童（Kang et al.，2013）。短鏈脂肪酸代謝物（如丁酸鹽、丙酸鹽、乙酸鹽和戊酸鹽），可以通過其同源的游離脂肪酸受體（free fatty acid receptor，FFAR）調節各種生理功能。FFAR在迷走神經中有表達，部分介導SCFA的作用。研究發現，SCFA影響中樞生理過程，比如乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽的混合物能夠修復無菌小鼠中觀察到的小膠質細胞形態缺陷（Erny et al.，2015）。體外實驗發現，PC12細胞（分化為神經元樣細胞的大鼠成神經細胞）用丙酸和丁酸處理可增加酪氨酸羥化酶（去甲腎上腺素和多巴胺合成中的限速酶）的表達（Nankova et al.，2014）。需要特別指出的是，微生物代謝產物的半衰期很短（25 min至3 h），尚不清楚這些微生物代謝產物是否能夠調節體內神經傳遞。對腦部生理和行為影響的研究通常使用的外源性SCFA濃度遠遠超過微生物來源的濃度（MacFabe et al.，2011）。因此，需要實驗證據來確定腸道菌群產生的SCFA能夠到達大腦。

1.3 免疫系統

免疫系統在MGB軸交互中起重要的作用。腸道菌群可能在派伊爾氏淋巴結（小腸中的可監測胃腸道菌群的淋巴結節）或腸系膜淋巴結等部位影響免疫系統。腸道菌群釋放多種免疫激動劑，例如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和肽聚糖（peptidoglycan，PGN），進入血液循環，通過血腦屏障進入大腦（Arentsen et al.，2017）。無菌小鼠和經抗生素處理的小鼠都發現紋狀體PGN受體的表達減少，表明大腦的蛋白表達可能對微生物很敏感。此外，這些PGN感應受體之一PGLYRP2（PGN識別蛋白2）的敲除會導致小鼠的社交能力增強，表明PGN會導致宿主的行為發生變化（Arentsen et al.，2017）。腸道菌群也可能影響免疫系統。無菌小鼠小膠質細胞對細菌LPS刺激的應答減少，同時促炎性細胞因子的產生水平降低（Erny et al.，2015）。給小鼠施用抗生素后，能重復這一結果，并在補充SCFA后恢復小膠質細胞的功能，證實了腸道菌群在免疫應答系統中起作用（Erny et al.，2015）。已經證明，干擾小膠質細胞-神經元的溝通（Zhan et al.，2014）和小膠質細胞的耗竭（Nelson et al.，2017）均會損害小鼠和大鼠的社交行為。要指出的是，小膠質細胞在神經行為中發揮的作用，尚不為人所知。

2 運動與腸道菌群--腸--腦軸

2.1 常見菌群研究因果推斷的方法

隨機雙盲對照試驗和基于科赫法則的多重確證試驗是微生物研究常見的因果推斷研究方法。

隨機雙盲對照試驗已被國際上公認為臨床防治性研究方法的金標準，通過隨機化控制變量X，實現對變量Y進行因果推斷。隨機雙盲對照試驗是一種衡量時間序列之間影響，對統計指標方差變化比較進行因果推斷的方法。這一點與經濟學領域的格蘭杰（2003年諾貝爾經濟學獎得主）因果關系檢驗方法類似（潘朝順等，2004）?？坪辗▌t由德國微生物學家羅伯特·科赫提出，其主要內容是：1）在每一病例中都出現相同的微生物，且在健康者體內不存在；2）從宿主分離出這樣的微生物，并在培養基中得到純培養；3）用這種微生物的純培養接種健康而敏感的宿主，同樣的疾病會重復發生；4）從試驗發病的宿主中能夠再度分離培養出這種微生物。如果進行了上述4個步驟，并得到了確實的證明，就可以確認該生物即為該病害的病原物（Finlay，2020）。科赫法則是確認特定的病原菌與疾病因果關系的重要評判標準。

2.2 運動與腸道菌群互相作用的因果證據

運動是良醫，適宜運動能夠有效防治多種慢性疾病的發生，包括肥胖、高血壓、抑郁癥、糖尿病、呼吸系統疾病、心血管疾病等，這些慢性疾病大部分被發現與腸道菌群紊亂有關。這讓人猜測，運動是否與腸道菌群存在關聯。通過檢索，相關關系的研究較多，但因果關系的證據只有2項。2019年6月，Nature Medicine上的報道證實了腸道菌群與耐力運動能力之間的因果關系。最初的相關性證據來自對馬拉松運動員糞便進行16S rDNA基因測序，發現運動后被試腸道中韋榮球菌屬細菌相對豐度明顯增加。因果關系證據來自將該菌分離，并接種到大鼠腸道中，可顯著延長大鼠的跑步力竭時間?？赡艿耐吠緩绞琼f榮球菌豐度的增加，促進乳酸代謝，延長了大鼠力竭跑步時間。證實了因果關系后，再對腸道菌群代謝通路進行研究。對87名優秀運動員的糞便進行宏基因組測定，結果發現，運動后韋榮球菌將乳酸代謝為丙酸的甲基丙二酰輔酶A通路基因豐度上升。用同位素標記乳酸鹽進行代謝動力學途徑驗證，發現血清中的乳酸鹽可以穿過上皮屏障進入腸腔，進而腸道菌群分解乳酸，表明運動后血液中積累的乳酸可以運輸到腸道。血清乳酸可跨越腸上皮屏障進入腸道，對結腸內灌注丙酸也可延長大鼠力竭跑步時間，表明韋榮球菌通過將運動生成的乳酸代謝為丙酸，實現運動能力的增強（Scheiman et al.，2019）。這項歷時3年多的實驗，從相關性出發尋找因果證據，步步深入，最后證實了對耐力運動起作用的韋榮球菌及其作用的代謝途徑。另一項因果證據顯示，運動是治療糖尿病的重要手段，但不同患者對運動的反應差異由腸道菌群造成。2019年12月，Cell Metabolism在線發表了香港大學徐愛民團隊的研究，其論證過程也是先進行相關性證明。12周的一對一運動訓練干預對70%被試（前驅糖尿病患者）的糖穩態和胰島素敏感性的改善具有作用，這種改善作用與腸道菌群及其代謝變化密切相關，這些人被稱為運動響應者，余下的30%被試糖穩態和胰島素敏感性變化較少，被稱為非響應者。12周運動訓練后，運動響應者和非響應者的腸道菌群組成和功能變化存在顯著性差異。其因果證據來自將兩者糞便分別移植肥胖小鼠模型，運動響應者移植小鼠胰島素敏感性提高，而非響應者卻沒有變化，并出現了胰島素抵抗，額外補充短鏈脂肪酸，糖代謝紊亂狀態得到逆轉（Liu et al.，2020）。這兩項來自頂級期刊的因果證據表明，運動具有調節腸道菌群達到調節生命活動的作用。

2.3 運動與腸道菌群-腸-腦軸

運動與腸道菌群-腸-腦軸的隨機對照實驗證據并不多。如表1所示，Kang等（2014）將小鼠隨機分為運動組（n=10）和對照組（n=10），進行2周的訓練適應期，運動方案為速度從3 m/min的跑步逐漸增加到7 m/min，運動時間從每天持續時間6 min增加到60 min。小鼠適應運動方案之后，將運動組放置在車輪中60 min（7 m/min），持續5天/周，共運動16周。結果，運動使小鼠腸道菌群中硬壁菌門豐富度增加，擬桿菌門豐富度減少，這些變化進而改善了小鼠的焦慮狀況，且小鼠記憶力得到了提升。Johannesson等（2011）對102名腸易激綜合征患者制訂了運動方案，每周進行3～5天的中強度到高強度體力活動，共12周。研究發現，腸易激綜合征患者的胃腸道癥狀得到改善，抑郁、嗜睡狀況得到好轉，且患者壓力也得到了緩解。Dong等（2020）也發現，食用富含雙歧桿菌BB-12的酸奶能通過調節腸道菌群乳酸菌和雙歧桿菌的豐度，進而降低跳水運動員“Choking”現象。這些研究表明，運動通過MGB軸參與機體功能改善的調節。

從表1隨機對照實驗的結果來看，運動對腸道菌群-腸-腦軸的影響是一種因果效應。目前，腸道菌群-腸-腦軸直接影響運動的研究較少，在實踐中可以通過服用功能性食品（如益生元、益生菌等）對菌群調節得到一些間接性的實驗證據。若要證實腸道菌群-腸-腦軸對運動的影響，要按照隨機對照實驗進行實驗設計，控制無關變量，再對腸道菌群-腸-腦軸進行干預，觀察與運動相關的結局指標。目前，這方面的研究較少，開展實行的難度也較大。

3 腸道菌群因果推斷研究方法

3.1 無菌動物、偽無菌動物模型和糞菌移植

2006年，Jeffrey Gordon團隊將肥胖病人的菌群移植給無菌小鼠，無菌小鼠出現了肥胖（Turnbaugh et al.，2006）。隨后他們設計了一項符合科赫法則和病因研究模式的實驗，來證實肥胖與腸道菌群之間的因果關系，具體方法是將一對胖瘦體型差異較大的同卵雙胞胎姐妹的糞便，分別轉移到無菌小鼠體內，正常飲食，不久小鼠分別出現與糞便來源相同胖或瘦的體型。這項研究表明，腸道菌群攜帶了肥胖宿主的某些特征菌群，能夠導致小鼠出現肥胖（Ridaura et al.，2013）。無菌動物最重要的作用是把病因和結果做了直接聯系。無菌動物制備并不簡單，是該研究的關鍵限制性因素。無菌環境下，提前一天無菌剖腹產獲得無菌的仔鼠，構建無菌小鼠。正因為制備無菌小鼠的條件非?？量?，限制了它的應用。因此，用廣譜的抗生素處理制備偽無菌小鼠模型就有了市場。Piewngam等（2018）發表于Nature期刊的糞菌移植和偽無菌小鼠構建方法值得我們借鑒。

表1 運動與腸道菌群--腸--腦軸的實驗證據Table 1 Experimental Evidence of Exercise and MGBAxis

近年來，FMT在臨床上主要是治療由腸道菌群失調引起的各種腸道疾病，該方法可以使患者的病情得到極大緩 解 或 治愈（Davidovics et al.，2019；Hibbard et al.，2019；Hvas et al.，2019；Kim et al.，2019）。一般分為人對人、人對動物和動物對動物的FMT。

動物對動物的FMT是在糞菌移植前，首先制備糞菌移植菌液。選取健康適齡小鼠作為供體，收取新鮮排出的小鼠糞便，對新鮮糞便進行稱重，再用生理鹽水等溶液對其稀釋，研磨后過濾糞便殘渣，將所得新鮮糞菌液混合，冷凍保存用于糞菌的移植。移植時需將每只小鼠分別轉移到單獨的籠中，用灌胃針吸取過濾后新鮮菌液，以灌胃的方式注入小鼠胃內，每只小鼠灌入實驗所需量的新鮮菌液，灌胃后觀察一定時間，再將實驗小鼠合籠飼養（楊沫，2017）。

《新英格蘭醫學雜志》以Brief Report形式報道，在人對人的FMT中，兩例患者出現了嚴重的菌血癥，其中一例死亡病例（Defilipp et al.，2019）。從此以后，人對人的FMT被美國食品和藥物管理局叫停。盡管FMT治療取得了一定的臨床療效，但其中哪些菌群起有效作用尚不清楚。亟待開發更有針對性的FMT，提高療效降低風險。要指出的是，無菌動物、偽無菌動物模型和人對動物的糞菌移植，都是基于科赫法則的因果推斷方法。

3.2 孟德爾隨機化

孟德爾隨機化（mendelian randomization，MR）是遵循孟德爾遺傳定律——親代等位基因隨機分配給子代，以遺傳變異作為工具變量，以此推斷觀察性研究中暴露因素與研究結局的因果關聯。該方法是因果推斷的有力工具（Emdin et al.，2017）。腸道菌群研究領域最具影響力的研究是證明了腸道菌群與糖尿病之間存在因果關系。Cisca Wijmenga和Mark McCarthyl對大樣本被試進行多組學測定，再進行雙向孟德爾隨機化分析，發現腸道菌群和特定代謝產物與人體糖尿病有因果關系。她們采用反方差加權檢驗來確定245個微生物組特征和17個感興趣的性狀之間的因果關系，采用雙樣本雙向MR分析，用全基因組關聯分析分別對來自微生物組特征和來自代謝/人體測量性狀進行匯總分析。在主成分分析和聚類分析的基礎上進行微生物組學、代謝組學和人體測量，顯著性水平采用保守的多重檢驗調整P＜1.3×10-4。最后，在英國生物銀行（UK Biobank）驗證這些因果關系。該研究方法和結果對腸道菌群與宿主疾病之間的研究具有重要的參考價值（Sanna et al.，2019）。該研究首次發現，腸道細菌與人類胰島素抵抗和2型糖尿病之間的因果關系。做為一種因果推斷方法，孟德爾隨機化也在與時俱進。2020年5月25日，Nature Genetics報道，美國芝加哥大學賀信團隊和統計遺傳學家Matthew Stephens合作，極大地降低了孟德爾隨機化假陽性率（Morrison et al.，2020）。

4 結論與展望

4.1 運動與腸道菌群-腸-腦軸研究亟需多學科結合應用和腸道菌群結構深入分析的突破

腸道菌群作為一個復雜系統，MGB軸是外周與中樞的交互雙向交流，需要利用多組學、納米技術、成像學、人工智能等復雜系統科學的諸多前沿方法結合開展研究。比如活體腦成像技術可用于研究腦、腸和腸道菌群之間的相互作用；正電子發射斷層成像、核磁共振成像等技術的發展加深了對腦區和腦網絡結構、功能和代謝特點的認識（Mayer et al.，2019）。楊朝勇和譚蔚泓研發出一種新腸道菌群活體成像方法，對于腸道菌群測定有了實時性的突破。基于近紅外光譜的代謝標記方法為觀察體內深部組織中的微生物提供了一條途徑（Wang et al.，2020）。另外，也要深入研究腸道菌群的結構變化與人體健康之間的關系。以色列魏茨曼科學研究所科學家發現，腸道菌群結構的變化與宿主的健康有關，同一菌株之間的一些關鍵表型變化可能是由某些基因的差異引起的。他們提出并鑒定了微生物基因組結構變異（structural variants，SVs）這一概念，發現SVs存在于人類的腸道菌群的門級水平。同時發現SVs與宿主疾病之間存在聯系（Zeevi et al.，2019）。這項研究為將來的運動與MGB軸研究從相關到因果關系提供了新的方向。

4.2 運動與腸道菌群-腸-腦軸的因果性研究亟需因果推斷方法學的突破

運動與MGB軸因果論證離不開人類科研方法學的突破。目前這個研究領域已經具有因果推斷能力的方法分別是基于時間的隨機對照試驗、橫斷面研究的孟德爾隨機化和基于科赫法則的（偽）無菌動物和FMT因果推斷。具有因果推斷科研方法的突破最有可能的領域是人工智能領域。Pearl等（2018）認為，人工智能從誕生伊始，只是進行概率推理的研究方向，而因果推理將對人工智能產生革命性的躍遷。話音剛落，2019年10月，華裔科學家李飛飛首次實現了人工智能領域的因果推斷（Nair et al.，2019）。人工智能方法已經深入菌群研究，比如2020年2月20日，頂級期刊Cell封面報道，用人工智能迅速挖掘出了一個全新的抗生素，短短幾天內從超過1億個分子的庫中篩選出強大的新型抗生素（以前需要十幾年）（Stokes et al.，2020）。不久，2020年5月28日，Cell又封面報道，利用縱向多組學（血代謝組、脂質組、免疫組、蛋白質組、轉錄組和腸道微生物組）對急性運動分析，通過機器學習構建了對最大攝氧量預測的人工智能模型。其中預測模型指標包括丁酸弧菌屬（Butyricimonas）（屬級水平的腸道細菌）（Contrepois et al.，2020）。基于這些研究，人工智能領域的因果推斷這一重大突破，可能將在未來為運動與MGB軸的研究提供因果方法學的新工具。