運動改善APP/PS1小鼠海馬白質的機制研究

閆清偉，李亞楠，趙 娜，徐亞濤，李百俠，夏 杰，徐 波

隨著人口平均壽命的增高，阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）日益成為威脅老年人群生存和健康的重要因素。AD于1901年被正式提出，至今已有100多年的歷史。在這百余年的歷程中，學術界對AD的研究不斷深入。然而至今仍未找到理想的治療辦法，關于AD病理機制及其關鍵作用靶點的認識仍不充分。合理的體育運動可增進身體機能，促進健康水平。近年來研究證實，運動在預防和改善AD病理進程中發(fā)揮了積極作用（Cui et al.，2018；Meng et al.，2020），但具體機制仍未探明。有研究證實，AD腦內存在明顯的白質損傷（Klosinski et al.，2015；Nasrabady et al.，2018）。白質受損會嚴重危害神經系統(tǒng)的信號傳導功能，這可能與AD病人海馬功能受損、認知功能下降密切相關。

對AD患者或模式動物腦（以下簡稱AD腦）內能量代謝方面的研究發(fā)現，在AD病理進程中，伴隨腦內葡萄糖代謝供能減退現象，同時伴隨著腦內酮體代謝供能水平增強（Brinton et al.，2015；Yao et al.，2011）。葡萄糖是健康大腦的主要能源物質，腦內葡萄糖源自血糖的跨血腦屏障轉運，葡萄糖轉運載體1和3（glucose transporters，GLUT1/3）是負責葡萄糖跨血腦屏障轉運的關鍵載體。在老齡大腦和AD腦內，葡萄糖轉運能力及代謝水平降低，酮體代償性供能水平增高（Tondo et al.，2020；Ding et al.，2013）。AD腦內酮體主要源自腦內髓鞘磷脂的分解代謝，而髓鞘磷脂的分解可造成腦白質結構破壞，這可能是AD腦白質損傷的重要原因。正常情況下，髓鞘磷脂不參與代謝供能，當腦內葡萄糖代謝供能不足時，髓鞘磷脂在多種因子的作用下參與代謝供能，如胞質磷脂酶A2（cytosolic phospholipases A2，cPLA2）可促進髓鞘磷脂代謝分解；羥烷基輔酶A脫氫酶（hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，HADHA）是線粒體三功能蛋白的關鍵亞基，負責長鏈脂肪的β-氧化，β-氧化產生的乙酰乙酸是磷脂代謝生成酮體的前體物質（Deng et al.，2020；Li et al.，2014；Schaeffer et al.，2010）；琥珀酰輔酶A：3酮酸輔酶A轉移酶（succinyl-CoA：3-ketoacid CoA transferase，SCOT）可催化酮體代謝的供能反應，酮體轉運載體蛋白1、2和4（monocarboxylic acid transporters，MCT1/2/4）負責酮體的跨膜轉運等（Al et al.2020；Zhang et al.，2018）。髓鞘磷脂的分解供能反應可導致髓鞘完整性破壞，而髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）是髓鞘的關鍵蛋白，其蛋白質表達水平可直接反映髓鞘完整性，常用于評價腦白質損傷情況（Ferrer et al.，2020）。研究證實，適當運動可對AD病理起到積極的預防效應，然而這一效應的內在機制是否與運動對AD海馬白質的改善有關，目前的研究尚不充分。近期有研究證實，適當運動對腦白質有積極影響。運動對血腦屏障破壞的幼齡大鼠和抑郁模型大鼠的腦白質均有積極的改善效應，同時可以提高大鼠的認知功能（Chen et al.2016；Lee et al.2017），對10月齡 APP/PS1小鼠研究證實，跑臺運動可抑制APP/PS1小鼠的腦白質體積萎縮，延緩白質毛細血管減少（Zhang et al.，2017），跑臺運動可改善10月齡APP/PS1小鼠認知功能，抑制腦白質有髓鞘神經纖維的脫髓鞘改變（Zhang et al.，2017）。另有研究證實，運動可改善10月齡APP/PS1小鼠空間記憶能力，抑制腦白質有髓鞘神經纖維長度和直徑的縮短（Zhou et al.，2018）。以上研究均提示，運動改善AD病理的機制可能與運動對腦白質的改善有關，但具體機制不明。然而，人體實驗研究顯示，6個月的有氧運動對健康老齡大腦全腦的腦白質影像學相關指標改善效應不顯著（Clark et al.，2019）。造成運動對上述AD腦白質和健康老齡腦白質不同影響的原因尚不清楚。分析認為，腦白質改變作為AD病理的一個早期特征，其最先變化可能表現在學習記憶關鍵腦區(qū)的海馬部位，早期階段全腦白質損傷程度可能尚不明顯；另外，老齡健康大腦和AD腦的認知功能存在差異，因此其腦白質結構的退變損傷可能也存在不同的時間變化規(guī)律。APP/PS1小鼠自3月齡開始認知功能逐漸下降，6月齡時表現出顯著的認知功能障礙。因此，為探討運動對AD腦白質的影響機制，本研究采用6月齡APP/PS1小鼠為研究對象，通過對小鼠學習記憶關鍵腦區(qū)海馬白質代謝相關指標的檢測，探討運動對APP/PS1小鼠海馬白質的影響機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及干預

采用3月齡APP/PS1小鼠為研究對象，將小鼠隨機分為安靜對照組（ADC組，n=18）和運動干預組（ADE組，n=18）。各組小鼠正常飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件同文獻（閆清偉等，2019）。于正式實驗開始前1周，將所有小鼠置入實驗環(huán)境使其適應，為期1周。適應期運動干預方案為：每天18：00－20：00將ADE組小鼠置入小鼠專用跑臺進行跑臺運動適應，每天起始速度5 m/min，逐級遞增至12 m/min，適應期第1～2天運動時間15 min，之后每天增加10 min逐級遞增，至適應期結束（適應期1周訓練5天，休息2天，周四和周日為休息日），單次運動時間增加至45 min之后進入正式實驗階段。正式實驗階段每天按同樣的運動方案干預，即每天運動1次，時間45 min，起始速度5 m/min，逐級遞增至12 m/min，干預周期為12周，其他條件均與適應期相同。為降低兩組之間的環(huán)境因素差異，ADC組小鼠在適應期和正式干預期每天相同時間段內，置入靜止跑臺中進行適應，每天置入跑臺的時間與運動組時間相同。

1.2 核磁共振彌散張量成像實驗

分別從ADC組和ADE組隨機取6只小鼠，置于核磁共振儀內（德國Bruker公司，型號：Biospec70/20USR，7.0T）進行彌散張量成像（diffusion tensor imaging，DTI）實驗測試，檢測小鼠海馬各向異性分數（fractional anisotropy，FA）。FA用于評價各組小鼠海馬白質完整性，FA降低可反映白質損傷，白質完整性下降。檢測過程：小鼠禁食10 h，吸入異氟烷（isoflurane，瑞沃德生命科技，217160701；2% isoflurane：98% O2）麻醉后置入核磁共振儀檢測裝置（裝置內維持1.5% isoflurane：98.5% O2的麻醉環(huán)境）開始實驗，整個測試開啟儀器水循環(huán)加熱裝置，使小鼠體溫保持37℃，實驗參數：SI：0.60/0.60 mm、FOV：1.92 cm、TR：4 000.0 ms、TE：26.0 ms、NXS：4。方法參考周津如等（2017）研究。

1.3 免疫熒光學實驗

分別從ADC組和ADE組隨機取6只小鼠，取海馬組織，經石蠟包埋、制片、脫水、抗原修復、抗體孵育（一抗：MBP，1：5 000，ab218011；二 抗 ：羊 抗 兔 ，1：5 000，ab205718）、細胞核復染、封片、拍照等步驟進行免疫組織熒光學實驗（趙娜等，2019），采用Image-Pro Plus 6.0采集兩組小鼠海馬MBP的積分光密度值（integrated optical density，IOD）進行統(tǒng)計處理。

1.4 蛋白質印跡實驗

各組隨機取6只小鼠，取海馬組織，制備總蛋白質組織液，進行蛋白質印跡實驗，檢測髓鞘磷脂代謝和葡萄糖轉運相關蛋白質的表達情況。蛋白印跡實驗總體流程為：取海馬組織，制備總蛋白樣本，經電泳、轉膜、封閉、抗體孵育、顯影成像等步驟，獲取各組目標蛋白條帶，運用AlphaEaseFC蛋白成像系統(tǒng)軟件進行圖像處理，采集蛋白表達數據，之后進行統(tǒng)計分析。所用抗體：一抗為MBP，1/1 000，ab218011；c-PLA2，1/1 000，AF6329；HADHA，1/1 000，ab203114；SCOT，1/10 000，ab241125；MCT1，1/1 000，ab90582；MCT2，1/1 000，DF9633；MCT4，1/1 000，ab234728；GLUT1，1/100 000，ab115730；GLUT3，1/2 000，ab191071；β-actin，1/3 000，T0022。 二 抗 為 羊 抗 兔 ，1/5 000，ab205718；羊抗鼠，1/5 000，ab205719。

1.5 正電子發(fā)射斷層掃描/計算機斷層掃描實驗

將各組進行彌散張量成像實驗的小鼠恢復1周后進行正電子發(fā)射斷層掃描/計算機斷層掃描實驗（positron emission tomography/computed tomography，PET/CT），先將小鼠禁食10 h以上，尾靜脈注射氟代脫氧葡萄糖（2-氟-2-脫氧-D-葡萄糖，即18F-FDG，劑量：47.56±9.35 MBq/kg）后，小鼠靜置于一安靜、潔凈鼠籠40 min。之后使小鼠吸入異氟烷（2% isoflurane/98% O2混合）麻醉，將小鼠置入PET/CT儀器內進行測試，同時以1.5% isoflurane/98.5% O2混合氣體維持其麻醉狀態(tài)，水加熱系統(tǒng)維持小鼠體溫37℃，每只小鼠CT定位掃描7 min，PET掃描18 min，空間分辨率1.35 mm，視野（FOV）12.7 cm。之后進行圖像處理并采集數據，計算海馬區(qū)對18F-FDG的相對攝取水平（relative Standard Uptake Value，SUVr）進行統(tǒng)計分析。

1.6 統(tǒng)計學方法

利用Graphpad Prism 7.0軟件對實驗數據進行處理，各指標以Mean±SEM進行數據呈現，采用獨立樣本t檢驗進行數理統(tǒng)計，兩組間數據以P＜0.05和P＜0.01分別表示差異達顯著性水平和極顯著性水平。

2 結果

2.1 跑臺運動上調小鼠海馬FA值和MBP蛋白質表達

實驗結果顯示，與ADC組相比，ADE組小鼠海馬FA值顯著增高（P＜0.05，圖1A），免疫組織熒光學實驗中MBP蛋白質表達水平顯著上調（P＜0.01，圖1B，圖1C）。蛋白質印跡實驗同樣證實，ADE組小鼠海馬MBP表達量較ADC組小鼠顯著增高（P＜0.01，圖1D）。

圖1 各組小鼠海馬FA值及MBP蛋白表達Figure 1.FAValue and MBPProtein Expression in Hippocampus of Mice in Each Group

2.2 跑臺運動抑制磷脂蛋白降解相關基因的蛋白質表達

與ADC組相比，ADE組小鼠海馬cPLA2蛋白質表達顯著降低（P＜0.01，圖2A），HADHA蛋白質表達顯著降低（P＜0.01，圖2B），SCOT蛋白質表達顯著降低（P＜0.01，圖2C）。

2.3 跑臺運動抑制小鼠海馬酮體轉運載體的蛋白質表達

與ADC組相比，ADE組小鼠海馬酮體轉運載體MCT1、MCT2、MCT4的蛋白質表達均降低（P＜0.05，圖3A、3B、3C）。

2.4 跑臺運動上調海馬葡萄糖攝取水平和GLUT1、GLLUT3蛋白質表達

實驗結果顯示，與ADC組相比，ADE組小鼠海馬葡萄糖相對標準攝取水平顯著增高（P＜0.01，圖4A），葡萄糖轉運載體GLUT1和GLUT3蛋白質表達量均顯著增高（P＜0.01，圖4B、4C）。

圖2 各組小鼠海馬磷脂蛋白降解基因cPLA2、HADHA、SCOT蛋白質表達Figure 2.Protein Expression of Phospholipid Degradation Genes cPLA2，HADHAand SCOT in Hippocampus of Mice in Each Group

圖3 各組小鼠海馬酮體轉運載體基因MCT1、MCT2、MCT4蛋白質表達Figure 3.Protein Expression of MCT1，MCT2 and MCT4 in Hippocampus of Mice in Each Group

圖4 各組小鼠海馬葡萄糖相對攝取量及葡萄糖載體GLUT1、GLUT3蛋白質表達Figure 4.Relative Uptake of Glucose and Expression of GLUT1/3 Protein in Hippocampus of Mice in Each Group

3 討論與分析

海馬是負責學習記憶功能的重要腦區(qū)，海馬受損可導致學習記憶能力下降，誘發(fā)AD病理。白質是中樞神經系統(tǒng)重要的組成部分，對神經信號的傳導過程發(fā)揮重要作用，白質結構受損，可導致認知功能障礙。近期研究顯示，AD患者海馬白質存在不同的損傷，且損傷程度隨著AD病理臨床分級的增高而加劇，DTI結果表現為FA值降低（Kantarci et al.，2017）。FA值是核磁共振彌散張量成像實驗評價白質完整性的一個重要指標，代表擴散各向異性和整體擴散的比值，FA值介于0～1，FA值越趨向1代表整個彌散運動越趨向各向異性，FA值越趨向0則彌散運動越趨向各向同性，FA值越高，則白質完整性越高。對AD經典動物模型APP/PS1小鼠的研究證實，6月齡APP/PS1小鼠海馬FA值比對照組小鼠顯著降低，白質完整性下降（Liu et al.，2020）。本研究結果證實，ADE組小鼠海馬FA值顯著高于ADC組，提示12周跑臺運動干預可抑制6月齡APP/PS1小鼠海馬白質損傷，改善白質完整性。白質損傷在組織病理上表現為髓鞘的變化（Erten-Lyons et al.，2013）。MBP是評價髓鞘變化及完整性的生物學指標（Silva et al.，2019；Zhao et al.，2019）。為進一步驗證FA值結論，檢測APP/PS1小鼠海馬白質狀態(tài)，本研究進一步對APP/PS1小鼠海馬白質關鍵指標進行了免疫組織熒光實驗和蛋白質印跡實驗檢測。結果均證實，ADE組小鼠海馬MBP蛋白質表達增高，與前人8月齡APP/PS1小鼠研究結果一致，MBP表達降低的結果與本研究中FA值降低的結果相互印證，進一步提示，12周跑臺運動可以改善APP/PS1小鼠海馬白質完整性。

髓鞘磷脂的分解代謝是腦白質損傷的重要形式，為探討運動抑制6月齡APP/PS1小鼠海馬白質損傷的機制，本研究對海馬髓鞘磷脂代謝關鍵指標做了進一步檢測。cPLA2是髓鞘磷脂代謝過程中的關鍵酶，常作為評價髓鞘損傷的關鍵指標，cPLA2表達量增高可提示髓鞘的損傷。近期研究證實，AD腦內cPLA2表達量增高（Klosinski et al.，2015），這可能是AD腦內白質下降的重要原因。本研究顯示，ADE組小鼠海馬cPLA2蛋白質表達量顯著低于ADC組，提示12周跑臺運動可通過抑制cPLA2蛋白表達，抑制海馬髓鞘磷脂代謝降解。這可能是12周跑臺運動改善APP/PS1小鼠海馬白質完整性的一個重要原因。HADHA是線粒體三功能蛋白的關鍵亞基，負責長鏈脂肪的β-氧化，β-氧化是磷脂代謝生成酮體的關鍵反應。SCOT是酮體代謝的關鍵酶，其表達量的增高可反映酮體代謝水平的增高。近期有研究顯示，髓鞘磷脂降解的生酮效應是白質損傷的原因（Yao et al.，2010）。本研究結果顯示，ADE組小鼠HADHA和SCOT的蛋白質表達均低于ADC組，與cPLA2的結果相互印證。進一步提示，APP/PS1小鼠海馬髓鞘磷脂降解作用增強，而12周跑臺運動可抑制APP/PS1小鼠海馬磷脂代謝，降低酮體代謝水平。MCT是酮體轉運的關鍵載體，其表達增高反映酮體轉運通量的增強。本研究結果顯示，ADE組小鼠海馬MCT1、MCT2、MCT4蛋白質表達量均低于ADC組，提示12周跑臺運動可抑制APP/PS1小鼠海馬酮體的生成與轉運，與上述結果相互印證。綜上結果提示，12周跑臺運動可抑制APP/PS1小鼠海馬髓鞘磷脂代謝，繼而改善小鼠海馬白質完整性。然而對于運動抑制APP/PS1小鼠海馬髓鞘磷脂代謝，改善海馬白質結構的具體機制仍不清楚。

血液葡萄糖是正常腦的主要能源物質，大腦葡萄糖攝取和供應不足，會導致腦能量缺乏，影響大腦正常的生理功能。研究表明，AD大腦葡萄糖代謝供能水平下降（Takahashi et al.，2017；Thientunyakit et al.，2020）。提示腦葡萄糖代謝水平下降與AD病理密切相關。氧化分解代謝方式是葡萄糖為大腦提供能源物質ATP的主要方式。然而近年來的乳酸穿梭學說認為，葡萄糖也可先在星形膠質細胞內發(fā)生糖酵解，生成的乳酸可再穿梭轉運至神經元細胞內進行氧化供能，并認為乳酸穿梭與腦的認知功能有關（Jakoby et al.，2013；Mason，2017）。研究顯示，AD腦內葡萄糖代謝存在類似癌細胞中的瓦博格效應（warburg effect），即在AD腦內，葡萄糖即使在有氧條件下仍以糖酵解供能為主，并認為糖酵解所產生的乳酸對Aβ沉積有一定的抑制效應（Atlante et al.，2017），但機制尚不明確。提示乳酸可能是大腦對抗AD病理的一種應激性中介物質，AD病理進程中表現的葡萄糖代謝水平下降，可抑制乳酸生成，加劇AD病理進程。研究證實，3月齡APP/PS1小鼠海馬和皮層乳酸含量均低于同齡野生對照組小鼠，且海馬Aβ水平增高，MBP表達顯著降低（Zhang et al.，2018）。提示葡萄糖代謝水平下降，乳酸生成降低可能與AD腦白質損傷有關。4周的姜黃素干預可提高4.5月齡APP/PS1小鼠海馬和大腦皮層的乳酸水平，提高小鼠認知功能（Lu et al.，2019）。提示改善AD腦內能量代謝狀態(tài)，可改善AD病理。綜上研究提示，AD腦內葡萄糖代謝水平下降，乳酸含量不足，可導致腦內能量供應不足，加劇AD病理。為滿足大腦的高能量需求，AD腦內開始進行其他方式的能量代償，這可能是AD腦內髓鞘磷脂代謝增強，造成白質損傷的重要原因。為進一步探討12周跑臺運動抑制海馬磷脂代謝的機制，本研究進一步檢測了APP/PS1小鼠海馬葡萄糖代謝的關鍵指標。結果顯示，ADE組小鼠海馬的葡萄糖相對攝取量高于ADC組，且ADE組小鼠海馬葡萄糖轉運載體GLIUT1和GLUT3蛋白表達增高。結果表明，6月齡APP/PS1小鼠海馬葡萄糖攝取水平降低，其原因可能和葡萄糖轉運載體表達降低有關，海馬葡萄糖代謝水平下降，則可引起乳酸水平下降，神經元能量供應不足，為滿足海馬內的較高能耗，腦內進行了白質代謝，繼而對腦內的能量不足進行代償；而12周跑臺運動促進了APP/PS1小鼠海馬葡萄糖的攝取，改善了小鼠海馬能量代謝狀態(tài)，繼而降低了白質代謝供能水平，最終抑制海馬白質的損傷。而運動增強APP/PS1小鼠海馬葡萄糖攝取水平的機制可能和運動上調葡萄糖轉運載體的蛋白質表達有關。綜上提示，海馬葡萄糖代謝水平降低可能是導致6月齡APP/PS1小鼠海馬白質損傷的重要原因，而12周跑臺運動可通過改善APP/PS1小鼠海馬葡萄糖代謝水平，抑制海馬酮體的代償性供能水平，繼而抑制髓鞘磷脂的代謝生酮作用，最終發(fā)揮對海馬白質的保護效應。

4 結論

12周跑臺運動可改善APP/PS1小鼠海馬白質髓鞘完整性，抑制白質損傷。運動改善APP/PS1小鼠海馬白質的機制可能與運動上調APP/PS1小鼠海馬葡萄糖代謝，促進能量代謝穩(wěn)態(tài)，繼而抑制髓鞘磷脂代謝有關。