玉米鐵還原酶基因ZmFRO2的功能分析

喬孟欣 李素貞 陳景堂

（1.河北農業大學農學院 國家玉米改良中心河北分中心 河北省作物種質資源實驗室，保定 071000；2.中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

Fe元素是植物生長發育過程中最重要的微量元素之一。Fe在地殼中的含量很高，但在有氧環境下，Fe易與羥基結合形成不溶態而不能被植物直接吸收利用［1］。在長期的進化過程中，高等植物形成了吸收Fe的不同機理：即機理I和機理II，相應的植物稱為機理I植物和機理II植物［2］。機理I植物主要包括雙子葉植物和非禾本科單子葉植物，機理I植物吸收鐵分為3個步驟，首先H+-ATPase酸化土壤中的三價鐵離子，隨后FRO將土壤中的Fe3+還原成Fe2+，再由Fe2+轉運蛋白（Iron-regulated transporter，IRT1/IRT2）將Fe2+轉運至植物體內以供植物各部分生長發育［3］；機理II植物主要包括禾本科植物，機理II植物則通過向胞外分泌植物鐵載體（Phytoziderophore，PS）與土壤中的Fe3+螯合形成Fe3+-PS復合物，再由專一轉運蛋白如黃色條紋蛋白（Yellow stripe-like，YSL）將Fe3+-PS復合物轉運至植物根部細胞內［1］。

FRO基因是機理I植物吸收鐵過程中非常重要的組成部分，目前，已在多種植物中被發現與研究，如擬南芥［4］、番茄［5］、大豆［6］、花生［7］、蒺藜苜蓿［8］和水稻［9］。值得注意的是，水稻是機理II植物，但是許多研究證明水稻根系中存在具有機理I特征的基因FRO和IRT的表達［9-14］。此外，將機理I和機理II中的關鍵基因轉入水稻能顯著提高其產量，Masuda等［15］將大麥麥根酸合成基因IDS3、酵母鐵還原酶基因refre1/372和水稻鐵載體分泌基因IRO2三種基因共同轉入水稻得到轉基因水稻IRI，發現IRI的產量比野生型高9倍。近期，一項研究用同位素示蹤法揭示了水稻在鐵充足水培條件下采用機理I吸收和轉運鐵，在缺鐵田間條件下主要采用機理II［16］。以上關于水稻吸收轉運鐵機理的研究和發現在機理I與機理II之間架起了一座橋梁，也就是說，水稻可以采用兩種機理結合的方式吸收轉運鐵。另外Wairich等［17］發現這種方式不是水稻特有的，也存在于與水稻近緣的物種中，這為想要提高作物植株或種子鐵含量的育種家們打開了新視野。

玉米是全世界重要的糧食作物和飼用作物，玉米中微量元素的含量直接關系到人類的健康。然而，堿性土壤中，玉米極易受到缺鐵脅迫所帶來的危害。目前，科學家已經完成玉米全基因組測序，許多與機理I相關的基因或基因家族已經被分離并研究［18-19］。在轉基因擬南芥中，ZmIRT1 和ZmZIP3在不同部位發揮積累鋅鐵元素的生理功能，FRO基因也已在玉米中預測到［20-21］。本研究對玉米鐵還原酶基因ZmFRO2進行了生物信息學分析、表達模式分析、亞細胞定位分析、鐵還原酶活力和鋅鐵含量測定以初步了解ZmFRO2在玉米中的功能。

1 材料與方法

1.1 ZmFRO2的識別與生物信息學分析

在玉米全基因組數據庫（http：//maizesequence.org/index.html）中用Blast搜尋與AtFRO2（GenBank accession No.Y09581）氨基酸序列具有同源性的基因，結果發現，在玉米中，FRO家族目前只有一名成員ZmFRO2。通過Clustal X Version 2.0對來自擬南芥、番茄、大豆、花生、蒺藜苜蓿、水稻、玉米等的FRO進行氨基酸序列比對并用BOXSHADE（http：//www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html）進行染色。用TMHMM預測蛋白質跨膜序列。用MEGA version 4.0對這些來自不同物種的19個FRO蛋白進行系統進化樹分析。這些蛋白質的編號如下：Arabidopsis thaliana（AtFRO1：AEE27309.1，AtFRO2：AEE27308.1，AtFRO3：AEE30323.1，AtFRO4：AED93241.1，AtFRO5：AED93243.1，AtFRO6：AED95851.1，AtFRO7：AED95852.1，AtFRO8：AED95905.1）；Lycopersicum esculentu（LeFRO1：AAP46144.1）；Glycine max（GmFRO2：XP_003528841.1）；Oryza sativa（OsFRO1：BAD18962.1，OsFRO2：BAD18963.1）；Arachis hypogaea（AhFRO1：XP_025631421.1，AhFRO2：XP_025631421.1）；Medicago truncatula（MtFRO1：AAR15416.1，MtFRO2：XP_003594430.1，MtFRO4：XP_003592210.2，MtFRO5：ABN06137.1，MtFRO6：BAD18962.1）；Zea mays（ZmFRO2：ONM17159.1）。

1.2 ZmFRO2表達量的檢測

先把蛭石用Hoagland營養液浸透，將玉米自交系B73種子點播于育苗盤中，在溫室（14 h光照/10 h 黑暗，26℃）中培養，10 d幼苗長至2葉一心移入標準Hoagland（100 μmol/L Fe（III）-EDTA）營養液中生長5 d至三葉一心（每3 d換一次營養液），三葉一心的玉米幼苗在標準營養液和不加鐵的條件下處理0、6、12、24、48、96 h后，分別收取幼苗地上部和根，液氮速凍后于-80℃保存用于總RNA的提取。用RNA提取試劑盒（HuaYueYang，Beijing，China）提取總RNA，用反轉錄試劑盒（TaKaRa，Japan）合 成cDNA，將cDNA稀 釋20倍作為RT-PCR的模板，擴增引物為RTZmFRO2F 5'-AAACCAGCAAGCCTCCACTA-3' 和RTZmFRO2R 5'-ACATCGGTGATGATGCTCCT-3'，體 系 為20 μL，包括：5 μL cDNA，上下游引物各10 μmol/L和10 μL SYBR Green I（TaKaRa），在CFX-96 Real Time Thermal Cycler中擴增。參照基因選用ZmActin1（GenBank：J01238.1），擴 增 引 物 為ZmActin1F 5'-ATGTTTCCTGGGATTGCCGAT-3' 和 ZmActin1R 5'-CCAGTTTCGTCATACTCTCCCTTG-3'。選 用ΔΔCt法計算相對表達量，2次生物學重復，3次技術重復。

1.3 融合表達載體的構建

將上述合成的cDNA稀釋10倍作為擴增ZmFRO2 cDNA（去掉終止子）的模板，擴增引物為ZmFRO2GF 5'-CCCTCGAGCTTCCCGGGCCCCTAGA TTC-3' 和ZmFRO2GR 5'-GCTCTAGAGCTGTGGCTG TTGAAATGGAAG-3'，用KOD酶（TOYOBO）擴增，擴增程序為：94℃ 3 min；94℃ 15 s，58℃ 1 min，68℃ 2 min 30 s，35個循環；68℃延伸10 min。將目的基因跑膠回收后構建至pRTL2NGFP 載體，融合質粒純化后（1-2 μg/μL）用于轉化玉米葉肉原生質體。

1.4 玉米葉肉原生質體的制備及轉化

將玉米自交系B73種子種植于用水浸透的蛭石中，置于28℃培養箱中，不提供光照。待玉米黃化苗生長至三葉一心時，取第二片葉子中間部分，用刀片切成0.5-1 mm的細絲；加入酶解液后置于水平搖床（30 r/min）上室溫遮光消化3-4 h；加入等體積的W5緩沖液混勻終止消化；過濾酶解液，100 g，離心1 min，沉淀原生質體；用預冷的 W5 緩沖液重懸沉淀，冰上放置30 min后計數；4℃，100×g，離心1 min，沉淀原生質體；加入MMg溶液至原生質體的終濃度約為106個/mL；向200 μL原生質體中加入20 μL已純化好的質粒，再加入220 μL 40%的PEG-Ca2+溶液，用手輕彈混勻，室溫放置30 min；加入880 μL緩沖液W5，用手輕彈混勻，室溫，100×g，離心1 min；吸棄上清，加入1 mL W5緩沖液，室溫黑暗孵育12-16 h，熒光顯微鏡觀察。

1.5 過表達載體的構建及轉基因玉米的獲得

將上述合成的cDNA稀釋10倍作為擴增ZmFRO2 cDNA（全長）的模板，擴增引物為35SZmFRO2F 5'-CCAGATCTCTTCCCGGGCCCCTAGA TTC-3' 和35SZmFRO2R 5'-GCGGTCACCTGAACCGA CCAAACGAGACG-3'，用KOD酶（TOYOBO）擴增，擴增程序為：94℃ 3 min；94℃ 15 s，58℃ 1 min，68℃ 2 min 30 s，35個循環；68℃延伸10 min。將目的基因跑膠回收后構建至pCAMBIA3301載體，融合質粒轉化農桿菌后用于侵染HiII玉米幼胚［22］。出苗后移至大田與鄭58雜交后再連續回交，收取BC2F1代種子進行表達量檢測后用于下一步試驗。

1.6 玉米根部鐵還原酶活力的測定

將轉基因與非轉基因玉米種子置于潤濕的濾紙上發芽，14 h光照/10 h黑暗，28℃培養室培養，待根長約為2-3 cm時，移入標準Hoagland營養液中生長至2葉一心，隨后對所有幼苗進行缺鐵處理，0、1、3、5、9 d后，檢測轉基因與非轉基因玉米幼苗根部的鐵還原酶活力。用檢測液（0.2 mmol/L CaSO4，5 mmol/L HEPES，pH5.5，0.1 mmol/L Fe（III）-EDTA，0.2 mmol/L BPDS）清洗幼苗根部；將幼苗根部浸沒于含有50 mL檢測液的錐形瓶中，于25℃黑暗條件下孵育1 h；將幼苗根部取出，搖晃混勻，于535 nm下讀取溶液的吸光值A，檢測液作為空白對照；用吸水紙除去幼苗根部殘余溶液，稱量幼苗根部鮮重FW；用消光系數28.6 mM-1cm-1計算Fe（II）-BPDS濃度，根據比爾定律計算：鐵還原酶活力（nmol/g FW/h）=5A/（28.6×FW）×104。本試驗共測定2個轉基因事件（OX-1和OX-2），每個事件3次重復，每次重復包含1株幼苗，選擇分離出的陰性植株作為對照。

1.7 玉米鋅鐵含量的測定

將轉基因與非轉基因玉米種子分別點播于用水浸透的蛭石和盆栽堿性土壤中，14 h光照/10 h黑暗，28℃培養，分別收取三葉一心期幼苗地上部與根部，吐絲期授鄭58花粉，成熟后收取棒三葉與籽粒，將材料洗凈，烘干用于測定鋅鐵含量。將烘干后的材料粉碎后稱取幼苗地上部，棒三葉各0.3 g，籽粒0.4 g，幼苗根部0.1 g；將稱量好的樣品倒入消解罐底部，向其中加入7 mL硝酸，過夜消化；加入1 mL H2O2微波消解，徹底消化；將溶液小心轉移至容量瓶中（幼苗根部及籽粒溶液轉移至25 mL容量瓶，幼苗地上部及棒三葉溶液轉移至50 mL容量瓶），用超純水定容，搖勻后過濾，濾出液4℃保存待測；用原子吸收光譜儀測定各樣品鋅鐵含量；計算：根/籽粒鋅鐵濃度（μg/g）=機器測定濃度（μg/mL）×25 mL/樣品干重（g）；幼葉/棒三葉鋅鐵濃度（μg/g）=機器測定濃度（μg/mL）×50 mL/樣品干重（g）。共測定2個轉基因事件（OX-1和OX-2），每個事件3次重復，每次重復3株混收，籽粒每株2粒，共6粒，選擇分離出的陰性植株作為對照。

2 結果

2.1 氨基酸序列比對

為了找到玉米中的鐵還原酶基因家族，本研究利用已經報道的AtFRO2的氨基酸序列在玉米基因組數據庫中進行BLAST，僅有一個FRO基因被找到，即ZmFRO2。ZmFRO2基 因 全 長4 590 bp，cDNA序列長2 585 bp，該基因編碼的蛋白質具有759個氨基酸，10個跨膜區域，1個FAD結合區，一個NADPH結合區，在V和VII跨膜區域上有兩對組氨酸殘基構成的亞鐵血紅素結合區，在VIII跨膜區域內存在氧化還原標志序列（圖1）。這些特征在各物種中的FRO之間高度保守。說明ZmFRO2具有發揮鐵還原酶功能的結構基礎。

2.2 系統進化樹分析

ZmFRO2與AtFRO1、AtFRO2、AtFRO3、AtFRO4、AtFRO5、AtFRO6、AtFRO7、AtFRO8、LeFRO1、GmFRO2、AhFRO1、MtFRO1、MtFRO2、MtFRO4、MtFRO5、MtFRO6、OsFRO1、OsFRO2等18種FRO蛋白之間的進化樹分析表明 ZmFRO2與OsFRO1 處于同一分支，且兩者與MtFRO2、AtFRO6 和 AtFRO7聯系緊密并處于同一分支簇中（圖2）。推測ZmFRO2在玉米植株中的特性與功能與OsFRO1在水稻中，MtFRO2在蒺藜苜蓿中以及AtFRO6 和 AtFRO7在擬南芥中的特性與功能類似。

2.3 ZmFRO2田間表達模式分析

為了在整體上了解玉米中ZmFRO2的表達模式，在田間正常生長的玉米植株上進行取樣，取樣部位分別為冠根（C-root）、側根（L-root、）、莖（Stem）、葉（Leaf）、葉鞘（Sheath）、雄穗（Tassel）、花藥（Anther）、穗軸（Cob）、花絲（Silk）、種皮（Husk）、授粉后10 d的種子（10 seed）、授粉后15 d的胚（15 E）、授粉后15 d的胚乳（15 En）、授粉后20 d的胚（20 E）、授粉后20 d 的胚乳（15 En），對這15個樣品進行RT-PCR以得到ZmFRO2在這些部位中的相對表達量，結果（圖3）表明，ZmFRO2在葉片中的表達量遠遠高于在其他部位中的表達量，其次是在葉鞘中的表達量較高。說明在田間正常條件下，玉米中的ZmFRO2主要在葉片中表達。

2.4 ZmFRO2缺鐵處理表達模式分析

為了解玉米在缺鐵條件下ZmFRO2的表達模式，在缺鐵處理后不同時刻（0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、96 h）分別收取玉米幼苗地上部全部葉片及地下部所有根系進行RT-PCR。結果顯示，在缺鐵處理24 h時，玉米葉片中ZmFRO2的表達量顯著高于對照，而24 h后，顯著低于對照（圖4-A）；在缺鐵處理6 h時，玉米根部ZmFRO2的表達量顯著高于對照，而6 h后，顯著低于對照（圖4-B）。從試驗結果可以看出，缺鐵條件對玉米葉片和根部ZmFRO2表達的調控均具有暫時性，葉片在缺鐵處理24 h之后，根部在缺鐵處理6 h之后，仍受到缺鐵條件的脅迫，甚至ZmFRO2的表達量比對照組還低，說明缺鐵條件在某一特定時間誘導，之后則抑制ZmFRO2的表達。根部對缺鐵脅迫更為敏感。

2.5 ZmFRO2的亞細胞定位

亞細胞定位能夠實現目標蛋白在細胞內的精確定位，有助于在細胞水平上理解目的基因的表達特性。本試驗構建了pRTL2NGFP-ZmFRO2融合表達載體并轉化玉米葉肉原生質體，熒光顯微鏡下分別開啟綠色激發光、紅色激發光、綠色和紅色激發光和明場觀察發現，ZmFRO2融合蛋白定位于質膜與胞質（圖5），跟與其親緣關系較近的OsFRO1在水稻中、AtFRO6和AtFRO7在擬南芥中的定位均有所不同，ZmFRO2在玉米中的亞細胞定位有其獨特性。

圖1 ZmFRO2與其他FRO的氨基酸序列比對

圖2 ZmFRO2與其他FRO的系統進化樹分析

圖3 土壤條件下ZmFRO2在玉米各部位的表達模式

2.6 轉基因玉米ZmFRO2表達量檢測

利用農桿菌介導法將pCAMBIA3301-ZmFRO2過表達載體（圖6-A）轉化玉米，為確認ZmFRO2基因在玉米植株中是否過表達，取轉基因與非轉基因玉米植株（BC2F1）葉片提取總RNA，進行Realtime PCR擴增檢測目的基因相對表達量，鄭58作為對照。結果顯示，過表達玉米植株中ZmFRO2基因的相對表達量顯著高于非轉基因玉米植株，是非轉基因植株的10-15倍（圖6-B），說明在回交轉育材料中ZmFRO2基因確實過量表達，該批回交轉育材料可作為試驗材料進行以下試驗。

圖4 不同供鐵條件下ZmFRO2在玉米幼苗葉片和根部的表達模式

圖5 ZmFRO2在玉米葉肉原生質體中的定位

2.7 轉基因玉米根部鐵還原酶活力的測定

為了解ZmFRO2在玉米中的生理活性，本試驗測定了在缺鐵處理0、1、3、5和9 d時轉基因和野生型玉米幼苗根部的鐵還原酶活力，野生型作為對照。結果（圖7）顯示，在缺鐵處理0、1、3和5 d時轉基因和野生型玉米幼苗根部的鐵還原酶活力均維持在較低水平，最高不超過205.57 nmol/g FW/h，而且在缺鐵處理3 d時，轉基因和野生型玉米幼苗根部受到的缺鐵脅迫最為嚴重，兩者根部的鐵還原酶活力均出現最低值，最低為14.51 nmol/g FW/h。此后，轉基因玉米幼苗根部的鐵還原酶活力逐漸增加，到缺鐵處理9 d時，事件OX-2玉米幼苗根部鐵還原酶活力極顯著高于野生型玉米幼苗8.35倍，為631.08 nmol/g FW/h，而事件OX-1玉米幼苗根部鐵還原酶活力還未表現出顯著差異。由此可以看出，在缺鐵條件下，過表達ZmFRO2基因能夠提高玉米幼苗根部的鐵還原酶活力，該基因所編碼的蛋白可能具有鐵還原酶功能。

圖6 ZmFRO2在轉基因玉米中的表達

2.8 轉基因玉米鋅鐵含量的測定

為了解過表達ZmFRO2基因對于玉米幼苗或植株鋅鐵含量的影響，本試驗測定了轉基因和野生型玉米幼葉、幼根、成熟葉及籽粒的鋅鐵含量，野生型作為對照。結果顯示，轉基因玉米幼苗根部的鐵含量顯著高于野生型玉米幼苗6.84-11.82倍，同時轉基因玉米幼苗根部的鋅含量顯著高于野生型玉米幼苗8.44-9.40倍（圖8-B），說明過表達ZmFRO2基因不僅能夠增加玉米幼苗根部的鐵含量，而且也能夠間接促進Zn在玉米幼苗根部的積累。另外轉基因玉米幼葉、成熟葉和籽粒中的Fe含量均近于或顯著高于野生型玉米植株，事件OX-2幼葉中的鐵含量比野生型增加23.43%（圖8-A），成熟葉增加42.53%（圖8-C），籽粒增加17.11%（圖8-D），所以過表達ZmFRO2基因能夠不同程度增加玉米幼葉、根部、成熟葉以及籽粒中的鐵含量。

圖7 ZmFRO2過表達玉米根部鐵還原酶活力

3 討論

截至目前，FRO家族基因已經在多種高等植物中被發現與研究，如擬南芥、番茄、大豆、水稻、花生、蒺藜苜蓿等。但在玉米中還鮮有報道，那么玉米中的FRO是否與上述高等植物中的FRO一樣具有還原鐵的功能呢？本研究中，利用擬南芥AtFRO2的氨基酸序列在玉米基因組數據庫中搜尋到ZmFRO2基因，為了解ZmFRO2與其他植物FRO的結構相似性和進化關系，在ZmFRO2和上述植物中已報道的FRO之間進行了氨基酸序列比對和系統進化樹分析。結果表明，ZmFRO2同樣具有10個跨膜結構域，有富含組氨酸的金屬離子結合區和氧化還原特征區域，具有鐵還原酶的結構基礎，推測ZmFRO2可能具有還原鐵的能力；與OsFRO1、MtFRO2、AtFRO6和AtFRO7親緣關系較近，其中與OsFRO1的親緣關系最近，推測ZmFRO2可能與OsFRO1來自同一祖先，與OsFRO1、MtFRO2、AtFRO6和AtFRO7的特性相似。

圖8 ZmFRO2過表達玉米各部位鋅鐵含量

FRO家族基因的主要表達部位以及缺鐵條件下的表達模式已經被廣泛研究。總體來說，各FRO基因的表達部位不盡相同，但大部分FRO基因的表達量會因缺鐵誘導而升高。AtFRO2主要在擬南芥根部表達并受缺鐵誘導［23］，AtFRO6和AtFRO7主要在擬南芥地上部表達，表達水平穩定，不受缺鐵誘導［24-25］，AtFRO3和AtFRO8主要在擬南芥維管系統中表達并受缺鐵誘導［26］，LeFRO1在番茄植株各部位均有表達，在根中的表達受缺鐵誘導［27］，GmFRO2主要在大豆地上部表達并受缺鐵誘導［6］，OsFRO1和OsFRO2在水稻葉片中表達，OsFRO2的表達可由鐵過量或持續性缺鐵誘導［10-11］，MtFRO1、MtFRO3-6在蒺藜苜蓿地上部表達并受缺鐵誘導［8］。本研究中，ZmFRO2主要在玉米葉片表達，跟與其親緣關系較近的OsFRO1、AtFRO6和AtFRO7相似；在缺鐵處理的幼苗中，ZmFRO2在葉片和根部的表達量均出現先升高后降低的趨勢，葉片和根部分別在缺鐵處理24 h時和6 h時表達量升高，之后降低，推測缺鐵條件對ZmFRO2的表達先誘導后抑制。

前人研究發現，AtFRO2定位于質膜，具有還原Fe3+的功能［28］；AtFRO6和AtFRO7的亞細胞定位分別為質膜和葉綠體，AtFRO6具有在葉片質膜上還原Fe3+的功能［29］，AtFRO7可能在類囊體薄膜上參與Fe3+的還原，進而促進細胞色素等的合成；AtFRO3和AtFRO8定位在線粒體［25］，與線粒體鐵轉運蛋白MIT1和MIT2協同作用維持線粒體與胞質之間的鐵平衡［30］；OsFRO1定位在液泡膜，參與維持液泡與胞質之間的鐵平衡［31］；LeFRO1定位在細胞膜，具有鐵還原酶功能［32］。本研究中，玉米葉肉原生質體的制備及轉化試驗結果顯示，ZmFRO2定位在質膜與胞質，推測ZmFRO2在質膜上和胞質中發揮還原Fe3+的功能，既能還原胞外Fe3+，又能還原胞內Fe3+。

因為ZmFRO2基因所編碼的蛋白是玉米鐵還原酶，所以想要了解ZmFRO2基因的生理功能，必不可少的就是檢測轉基因玉米的鐵還原酶活力。Paolacci等［33］發現缺鐵條件能夠顯著提高番茄根部的鐵還原酶活力。Andaluz等［34］發現在缺鐵處理5 d后，蒺藜苜蓿根部的鐵還原酶活力顯著增強。Masuda等［35］將酵母的鐵還原酶基因refre1/372轉入水稻中發現在缺鐵處理3 d后水稻根部鐵還原酶活力升高，表明酵母鐵還原酶基因具有鐵還原酶功能。本研究中，對轉基因和非轉基因玉米幼苗進行缺鐵處理，缺鐵處理0、1、3、5、9 d時檢測根部鐵還原酶活力，結果顯示，在缺鐵處理9 d后，轉基因玉米幼苗根部的鐵還原酶活力出現顯著升高，約為非轉基因玉米幼苗的10倍，推測ZmFRO2基因所編碼的蛋白具有鐵還原酶活性。事件OX-1沒有表現出鐵還原酶活力的顯著升高，可能原因一是缺鐵處理天數不足，可能會在后期出現顯著升高；二是本試驗中收取單株檢測，并沒有混收，存在因單株基因型不同導致的表型差異問題。

鐵還原酶活性的增強有利于植株對鐵的吸收、轉運和積累。轉refre1/372基因水稻由于根部鐵還原酶活力提高，植株及籽粒中的鐵含量均顯著增加［35］。本研究對轉基因玉米幼苗、植株或種子進行了鋅鐵含量的測定，分別混合收取三葉期幼苗葉和根，成熟后的棒三葉和籽粒（BC3F1）烘干磨碎消解后用原子吸收分光光度計測定鋅鐵含量。結果顯示，幼苗根部Fe和Zn的含量均顯著增加，表明ZmFRO2基因能夠促進Fe在幼苗根部的積累，同時能夠間接促進幼苗根部對Zn的吸收，這與Vasconcelos等［28］對AtFRO2的研究結果一致：AtFRO2不僅可以提高Fe的轉運效率，也可間接促進Zn、Cu、Mn、K、Ni等其他離子的轉運；幼苗葉片、棒三葉、籽粒中的Fe含量也出現顯著增加，推測ZmFRO2基因能夠還原更多的Fe到幼苗根部，再次還原更多的Fe到葉片，最終增加籽粒中的Fe含量。事件OX-1成熟葉片中的Fe含量增加不顯著可能是在成熟過程中葉片中的Fe向繁殖器官大量轉移的原因。

基于目前研究結果，在下一步試驗中，本研究將會深入進行對該基因的功能驗證，包括ZmFRO2對玉米表型的貢獻、對產量相關性狀的影響，調控因素和調控機理等，為玉米品質育種提供新的功能基因和基礎材料，為提高玉米鋅鐵含量提供新的途徑。

4 結論

搜尋到預測基因ZmFRO2，該基因為玉米FRO基因家族唯一成員，ZmFRO2具有其他植物FRO蛋白所具有的10個跨膜區域，FAD結合區，NADPH結合區，亞鐵血紅素結合區和氧化還原標志序列；ZmFRO2與OsFRO1、MtFRO2、AtFRO6 和 AtFRO7親緣關系較近。ZmFRO2是鐵還原酶。

ZmFRO2主要在玉米葉片中表達，缺鐵處理0 h-96 h內，幼苗葉片及根部ZmFRO2的表達分別在24 h和6 h被誘導，之后則被抑制，推測ZmFRO2在葉片和根參與Fe3+的還原。亞細胞定位分析表明ZmFRO2定位在質膜和胞質，推測ZmFRO2在質膜上和胞質內參與Fe3+的還原，既能還原胞外Fe3+，又能還原胞內Fe3+。

缺鐵條件下，過表達ZmFRO2能夠提高鐵還原酶活力、增加植株及籽粒的鐵含量，推測ZmFRO2具有鐵還原酶活性及功能。