嗜水氣單胞菌acrA缺失菌株的構建及其生理功能的測定

李小艷 李澤琦 汪玉倩 于晶 林鎮平 林向民

（1.福建農林大學生命科學學院，福州350002；2.福建農林大學福建省農業生態過程與安全監控重點實驗室，福州 350002）

AcrA蛋白是革蘭氏陰性菌中的一種含有398個氨基酸序列的內膜蛋白，由α-螺旋發夾結構域、脂肪結構域、β-桶狀結構域和膜近端結構域等4個結構域組成，通常具有藥物外排泵的功能［1］。其中α-螺旋發夾結構域與TolC相互作用，膜近端結構域和物外排結構域則參與了與AcrB的相互作用［2］。AcrA在組裝為外排泵時常常作為二聚體組裝，通過將內外膜組件結合在一起來完成泵的組裝。其通常與外膜蛋白和周質空間蛋白組成三聯體復合物行使蛋白功能，將多肽、蛋白質、碳水化合物或藥物等泵出到革蘭氏陰性細菌的胞外，在革蘭氏陰性細菌的物質轉運過程中起重要的作用［3-4］。例如，大腸桿菌的AcrAB-TolC系統中，AcrA蛋白將周質空間蛋白AcrB與外膜蛋白TolC連接形成復合物，從而起到藥物泵的作用，可以促進氯霉素、四環素、紅霉素和溶劑的外排［5-6］；這種外排泵的過度表達還增加了大腸桿菌對異丁醇的耐受性及環丙沙星的耐藥性［7］。此外，Yutaka等研究發現，acrA的缺失或突變會導致細菌對多種抗生素（左氧氟沙星、林可霉素、米諾環素、頭孢他啶和頭孢呋辛等）、染料（吖啶黃素等）及去污劑（SDS和Triton等）的敏感性增加，還會顯著增強細菌對膽鹽和癸酸（一種脂肪酸）的敏感性［8-9］。還有研究者提出，AcrA蛋白質中具有較高保守性的氨基酸殘基是不同種屬菌株進化的關鍵位點，當細菌在外在環境發生變化時（如不同種類、濃度的抗菌藥物等），菌株為了適應新的生長條件，在選擇性壓力下產生氨基酸殘基的突變，如第51-60位、141-150位等氨基酸殘基的突變；從而能更加有效的泵出抗菌藥物，使其能耐受極端的環境［10］。由于AcrA蛋白質在膜轉運過程中的重要作用，當前關于該蛋白的研究大多數集中于AcrA在藥物泵中的功能，而對其在細菌其他生理功能的研究較少。嗜水氣單胞菌是廣泛存在的一類條件性致病菌，對魚類、禽類、兩棲動物和哺乳動物等有較強的感染力。此外，該菌對人類公共衛生與食品安全造成了嚴重的威脅［11］。因此，研究該菌的各項生理功能對其防治具有深遠的意義。本實驗以水產病原菌嗜水氣單胞菌為研究對象，成功構建acrA敲除菌株ΔacrA，探究acrA在嗜水氣單胞菌中的生理功能，豐富與補充了對該基因功能的認識。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株該實驗所用到的菌株，自殺載體pRE112，嗜水氣單胞菌ATCC 7966均為本實驗室保存。

1.1.2 試劑和引物LB培養基胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，蔗糖購買于廣州賽國生物科技有限公司；抗生素氨芐青霉素（Amp）100 μg/mL，氯霉素（Cm）30 μg/mL 均購買于上海拜力生物科技有限公司，綿羊血和脫脂牛奶均購買于索萊寶生物科技有限公司。膠回收和質粒提取試劑盒購買于 Omega；總DNA提取試劑盒購買于北京康為世紀生物技術公司；常用的Xba I和Sac I限制性內切酶購買于Thermo FisherScientific；ClonExoress Multis?One Step Cloning Kit C113多克隆片段連接酶購買于南京諾唯贊生物科技有限公司，引物由福州博尚生物公司合成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 acrA敲除菌的構建 根據acrA基因序列設計目的基因上下游同源臂，以嗜水氣單胞菌ATCC 7966總基因組為模板進行PCR擴增，得到目的基因上下游各500 bp左右的兩條同源臂，將上下游兩條同源臂用多克隆片段連接酶與經過（Xba I和Sac I）雙酶切的pRE112進行連接得到重組質粒。將重組質粒轉化至MC1061感受態細胞中，提取陽性克隆的質粒，轉入S17感受態細胞；將攜帶兩條同源臂的pRE112載體的S17菌與嗜水氣單胞菌按1∶4的比例在濾紙片上結合培養16-18 h，進行第一次同源重組，然后將無菌LB培養液洗滌下來的混合菌液涂于雙抗板上（氨芐青霉素和氯霉素），挑取陽性克隆；將該陽性克隆的過夜菌涂布于含有20% 蔗糖的LB平板上，然后挑取單克隆，分別點在氯霉素和正常LB平板上。最后選取在氯霉素板上不長的陽性克隆用P5P6及P7P8進行菌液PCR驗證，P7P8 PCR得到的1 000 bp左右的片段進行測序驗證，獲得ΔacrA敲除菌株，穩定遺傳20代后，-80℃保菌。以上步驟根據表1設計對應引物進行菌液PCR驗證并測序，PCR體系（20 μL：DNA模板3 μL，2×Hieff?PCR Master Mix（With Dye）10 μL上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，ddH2O 15 μL，PCR程序：94℃ 5 min，94℃ 30 s，X℃ 30 s，72℃ Y s，72℃ 10 min，30個循環。

1.2.2 培養基配置 LB 液體培養基（固體培養基加入1.5%瓊脂），抗性培養基為在 LB 培養基滅菌溫度降至60℃后，按相應比例加入Amp（終濃度為100 mg/L），Cm（終濃度為30 mg/L）。0.7%綿羊血瓊脂平板，按0.7%（V/V）將無菌綿羊血與無菌固體LB培養基均勻混合，倒無菌0.7%綿羊血瓊脂平板；1.0% 牛奶瓊脂平板，10%的液體牛奶115℃，20 min滅菌溫度降至60℃按1.0%（V/V）將牛奶與固體無菌LB培養基均勻混合，倒無菌1.0% 牛奶瓊脂平板。

表1 嗜水氣單胞菌acrA基因缺失以及驗證引物列表

1.2.3 溶血性的測定 將過夜的野生菌株和敲除菌株按1%（V/V）轉接至新鮮LB中，30℃，200 r/min培養至OD600nm為1.0后，將上述菌液各取5 μL 點于挖好孔的1.0%綿羊血瓊脂平板上，30℃正置培養16 h，觀察并測量溶血斑直徑。上述實驗皆重復3次，并用Graph Pad Prism 5進行數據分析。

1.2.4 胞外蛋白酶活的測定 將過夜的野生菌株和敲除菌株按1%（V/V）轉接至新鮮LB中，30℃，200 r/min培養至OD600nm為1.0后，將上述菌液各取5 μL 點于挖好孔的1.0%牛奶瓊脂平板上，30℃正置培養16 h，觀察并測量牛奶斑直徑。上述實驗皆重復3次，并用Graph Pad Prism 5進行數據分析。

1.2.5 ΔacrA 對抗生素及染料的敏感性測定 將過夜16 h的野生菌株和敲除菌株按1%（V/V）轉接至新鮮LB，30℃，200 r/min至OD600nm為1.0，將10 μL菌液接入到1 mL新鮮LB中，然后進行梯度稀釋（10-2-10-8），每個梯度取2 μL菌液點在含抗生素或染料的瓊脂平板上，30℃培養16 h，拍照，重復3次。1.2.6 生長曲線的測定 分別挑取野生菌和敲除菌的單克隆于液體LB培養基中，30℃或42℃，200 r/min培養16 h；將上述菌液以1∶100（V/V）轉接培養至OD600nm約為1.0 然后按 1∶100 稀釋，將稀釋后的菌液加入生長曲線板的孔隙中，每孔加入300 μL，每個菌做3次重復，隨后將生長曲線板置于全自動生長曲線分析儀（Bioscreen）中培養16 h。最后用GraphPad Prism 5對數據進行分析。

1.2.7 生物膜的測定將培養16 h的野生菌株和敲除菌株按 1%（V/V）轉接至新鮮LB，30℃或42℃，200 r/min培 養 至OD600nm為1.0，再按1%（V/V）轉接至96孔微量板中30℃靜置培養24 h；用SpectraMax? i3多功能酶標儀（Molecular devices）檢測其OD600nm波長下的吸光值；棄去菌液，用雙蒸水緩慢洗滌3次后晾干；每孔中加入 250 μL的0.01%（W/V）結晶紫溶液，室溫靜置染色30 min；棄去結晶紫染液，再用雙蒸水緩慢洗滌3次晾干；最后每孔加入300 μL的 95%（V/V）的乙醇溶液，用SpectraMax?i3多功能酶標儀檢測其OD595nm波長下的吸光值，每個樣品做8孔重復，并做3次生物學重復。最后將數據用GraphPad Prism 5進行分析。

2 結果

2.1 acrA敲除菌構建的結果

利用同源重組原理，通過目的基因的驗證引物P5P6及同源臂外側引物P7P8對獲得的敲除菌株進行PCR驗證，結果如圖1所示：泳道1和2分別是P5P6對敲除菌株及野生菌株進行PCR驗證的結果，泳道3和4分別是P7P8對敲除菌株及野生菌株進行PCR驗證的結果。

圖1 acrA敲除菌株PCR驗證

2.2 溶血性測定的結果

實驗中為測定野生菌株和敲除菌株的溶血性，在0.7%綿羊血瓊脂平板的孔隙中培養敲除菌和野生菌16 h，對溶血斑的大小進行觀察并用GraphPad Prism 5對溶血斑直徑的數據進行統計分析，得到如圖2所示的實驗結果。

圖2 野生菌株與敲除菌株溶血性測定

2.3 胞外蛋白酶活測定的結果

研究中為測定野生菌株和敲除菌株的胞外蛋白酶活，將野生菌和敲除菌在1.0% 牛奶瓊脂平板的孔隙中培養16 h，對牛奶水解圈的的大小進行觀察并用GraphPad Prism 5對牛奶水解圈的直徑數據進行統計分析，得到如圖3所示的實驗結果。

圖3 野生菌株與敲除菌株胞外蛋白酶活測定

2.4 ΔacrA對抗生素及染料的敏感性測定結果

為了探究 acrA缺失后，嗜水氣單胞菌對抗生素及染料敏感性的變化，將野生菌株和敲除菌株分別在含有卡那霉素（Kanamycin 6.25 μg/μL）、羅紅霉素（Erythromycin 32 μg/μL）、巴洛沙星（Balofloxacin 0.05 μg/μL）抗生素及吖啶黃素染料（Acriflavinium chloride 10 μg/μL）的瓊脂平板上的進行稀釋點板，得到如圖4所示的實驗結果。

2.5 生長曲線測定的結果

為了探究acrA缺失后對嗜水氣單胞菌生長及高溫脅迫性的影響，利用全自動生長曲線分析儀（Bioscreen）在30℃和42℃下分別測定野生菌與敲除菌16 h的生長趨勢，通過GraphPad Prism 5對實驗的數據結果進行統計分析，得到如圖5所示的實驗結果。

圖4 野生菌株與敲除菌株對Kanamycin、Erythromycin、Balofloxacin抗生素及Acriflavinium chloride染料敏感性的測定

圖5 野生菌株與敲除菌株生長趨勢測定

2.6 生物膜測定的結果

將野生菌株和敲除菌株分別培養16 h，再利用結晶紫染色法測定野生菌株和敲除菌株在30℃和42℃條件下生物膜的形成能力，通過GraphPad Prism 5對實驗的數據結果進行統計分析，得到如圖6所示的實驗結果。

圖6 野生菌株與敲除菌株生物膜形成能力測定

3 討論

AcrA蛋白一般通過與AcrB和TolC的相互作用形成AcrAB-TolC多藥泵系統，從而排出如氯霉素、四環素、紅霉素等多種抗生素，在細菌的藥物外排中起著至關重要的作用［12-14］。有研究結果表明AcrA在一些染料試劑的滲透過程中也有關鍵作用［15-17］，acrA基因的突變或缺失會提高細菌對許多抗生素和染料試劑的敏感性。曾有文獻報道嗜水氣單胞菌中的acrA基因也有這樣的功能，把嗜水氣單胞菌中的acrA基因在大腸桿菌中高表達發現，acrA增加了大腸桿菌對奎諾酮類藥物的外排作用［18］，這與本實驗結果相符。迄今為止acrA基因的研究幾乎都是與藥物外排及膜的通透性相關［19］，而關于該基因在細菌中其他生理方面的功能知之甚少。為了充分了解該基因在細菌生長中所起的作用，本實驗首先成功敲除了嗜水氣單胞菌中的acrA基因，如圖1實驗結果所示，通過P5P6及P7P8分別對敲除菌株和野生菌株進行PCR驗證，得到的實驗結果與同源重組技術的理論結果一致。本文還研究了嗜水氣單胞菌中acrA基因在溶血性、胞外毒理性、抗生素和染料的敏感性、生物膜形成及高溫耐受性等方面的功能。

本研究通過對圖2和圖3的實驗結果進行分析得到溶血斑及牛奶水解圈的直徑幾乎沒有差別，這表明了acrA基因可能與細菌中的毒理因子無關。但是由圖4的實驗結果分析發現acrA基因的缺失可以提高嗜水氣單胞菌對卡那霉素，羅紅霉素，巴洛沙星及吖啶黃素的敏感性。隨后圖5生長曲線測定的結果說明：30℃條件下野生菌株與敲除菌株的生長趨勢沒有差別，但是在42℃條件下野生菌株的生長趨勢明顯比敲除菌株的好，表明acrA基因的缺失本身不會影響嗜水氣單胞菌的生長，但會降低嗜水氣單胞菌的高溫耐受性，提示acrA基因與高溫耐受性有關；同時圖6的實驗結果表明在30℃條件下野生菌株生物膜的形成能力明顯比敲除菌的能力弱，而在42℃下野生菌生物膜的形成能力明顯強于敲除菌，這說明在高溫刺激下野生菌生物膜形成能力也比敲除菌株的強，與高溫環境下野生菌株和敲除菌株的生長趨勢一致，暗示著嗜水氣單胞菌中acrA基因可能通過影響嗜水氣單胞菌的高溫耐受性，從而影響該菌生物膜的形成，研究者已經證明在42℃高溫下培養嗜肺乳桿菌菌株和肺炎鏈球菌菌株，其生物膜的形成能力能夠得到顯著的提高［20］。但是在嗜水氣單胞菌中acrA基因是如何通過影響高溫耐受性進而調節生物膜的形成還有待進一步研究。除此之外，我們還在正常溫度下對野生菌和敲除菌株的生物膜形成能力進行測定，發現在正常溫度下野生菌株的生物膜形成能力明顯弱于敲除菌株，因此推測在嗜水氣單胞菌中acrA基因對生物膜的形成有負調控的功能。曾有研究表明適宜溫度下分別缺失沙門氏菌中的tolC、acrE和acrF基因都會產生沙門氏菌的csgB基因表達下調，減少curli菌毛產生，影響細菌形成成熟生物膜的現象，但是并未發現acrA基因的缺失會對細菌生物膜的形成產生影響［21］。而本研究發現在嗜水氣單胞菌中acrA的缺失會顯著增強生物膜形成能力，說明在不同細菌中可能存在多個調控因子影響其對生物膜形成的作用。

4 結論

本研究成功構建了acrA基因的敲除菌株，通過溶血性、胞外蛋白酶活性、抗生素及染料的敏感性、生長趨勢和生物膜形成的檢測發現，嗜水氣單胞菌中acrA基因與毒理能力無關，但在抗生素外排中可能起一定的調節作用。而且研究還發現acrA基因起著熱脅迫抗逆性的功能，并參與調控細菌的生物膜形成。這一發現豐富了我們對acrA基因功能的認識，為進一步探究AcrA蛋白在細菌中高溫耐受性及對生物膜形成的調控機制奠定基礎。