海鞘附著相關微生物膜中細菌原核群落結構解析

劉倩倩 史宏偉 郭長祿 張治洲

（1.哈爾濱工業大學（威海）海洋科學與技術學院，威海 264209；2.山東省海洋船舶防污工程技術研究中心，威海 264209）

海鞘屬于重要的海洋污損生物［1］。在全球范圍內很多海域，海鞘可以占據污損生物總量的30%-70%。但是與藤壺、貽貝及管蟲相比，針對海鞘的防污研究要少得多。通常情況下在清除船艦表面的藤壺和管蟲時，不損傷船艦涂層幾乎是不可能的；而海鞘可以很容易使用高壓水槍清洗干凈，且幾乎對船艦表面涂層沒有明顯的損傷。這也是針對海鞘的防污技術研究較少的原因之一。可是海鞘在污損生物量中的占比經常非常大，給船艦航行增加的能耗不容小覷，且清除它們仍然要耗費大量的人力物力。所以海鞘的附著生長控制技術在防污領域內應該加大研究力度。

在眾多不同的海洋防污技術研究領域，海洋微生物膜與污損生物幼蟲附著過程之間的關系研究一直很受重視［2-4］。這里涉及幾個重要的問題，一是不同的污損生物幼蟲擁有不同的附著器官［5-7］，這些附著器官各自的附著機理需要很長時間才能研究清楚；二是海洋微生物種類繁多，在不同的附著表面形成具有不同組成結構和表面形貌的生物膜，且大部分海洋微生物目前都是不可培養的；生物膜內成百上千的細菌、真核微生物和其他微小生物存在著復雜的相互作用［8-9］。所以污損生物幼蟲與海洋生物膜的相互作用機理也需要很多年才能逐一得到闡明。但是有一點理論上基本可以肯定，不同的污損生物幼蟲會與海洋生物膜上特定的位置更容易產生互動。

海洋微生物膜與海鞘幼蟲附著過程之間的關系研究已經積累了少量文獻［10-15］，它們都是直接的實驗觀察結果。Wieczorek等［12］發現海水自然形成的生物膜對苔蟲幼蟲和海鞘幼蟲的附著有截然不同的作用，1-12 d內形成的海水生物膜對苔蟲附著有抑制作用，但對海鞘起促進作用，且越老的生物膜效果越好。張朝霞等［14］從幾種海鞘的被囊表面及其附著基附近分離到9株細菌制備成細菌黏膜，發現不同細菌黏膜對冠瘤海鞘幼體的附著和變態所起的作用差別很大，甚至發現一種弧菌可以明顯地促進附著卻強烈抑制海鞘幼體變態。Zardus等［15］測試了不同天數形成的天然海水生物膜對次口海鞘、華美盤管蟲、紋藤壺和總合草苔蟲幼蟲的附著強度；與光滑玻璃對照相比發現，生物膜的存在可以讓海鞘幼蟲的附著強度增加近一半。上述研究表明生物膜與海鞘幼蟲的附著關系密切，但是具體與生物膜中哪些微生物關系密切需要更多的觀察和研究。

本研究通過在兩類不同的商用底漆中，分別添加4種防污性能不同的納米材料，制備了8種不同的涂層。實海測試發現它們的綜合防污打分比較接近［16］，但是在本研究中發現兩類涂層上的海鞘附著程度差異十分明顯。使用16S rRNA基因全長高通量測序分析兩類涂層表面早期生物膜原核菌群的組成差異，試圖初步從中找到與海鞘附著潛在密切相關的若干菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

使用3種碳納米管（Carbon nanotubes，CNTs，TimesNano）和一種納米鉑（Sigma）（添加量均為0.1%，W/V，表1）與兩種不同的常見商用底漆涂料制備復合涂層。底漆涂料選擇環氧鐵紅防銹漆（鐵紅）和丙烯酸樹脂成膜物（丙烯酸），均購自威海欽灝涂料有限公司。兩種底漆涂料分別與碳納米管充分混勻制備復合防污涂層，涂在鋼板一面；室溫固化72 h后涂制另外一面，在72 h后徹底風干固化后進行海洋實地掛板。實驗所用鋼板選擇Q235材質的常見船體鋼板，尺寸大小為500 mm×500 mm×3 mm，鋼板上部左右邊緣處各開一個直徑15 mm的圓孔，用以固定粗尼龍繩。先利用拋光機打磨平整光亮，使用去離子水沖洗鋼板表面，再用無水乙醇擦拭3次去除表面油污，自然風干后用鉛筆劃線均分為25塊10 cm×10 cm小格（圖1）。

表1 納米材料信息

圖1 涂層設計示意圖

1.2 方法

1.2.1 涂層的表征 采用掃描電鏡（Scanning electron microscope，SEM，Zeiss MERLIN compact）對涂層進行表面形貌表征分析。以硅片為載體制作出對應納米復合涂層，完全固化后做噴金處理并立刻進行表征。利用接觸角測量儀（JGW-360B，承德市成惠試驗機有限公司）測試上述涂層在室溫條件下的靜態接觸角和表面潤濕性能，在涂層表面隨機取3個不同的位置測量并取平均值，測試液體使用的是純水和0.22 μm過濾海水。

1.2.2 實地海洋浸沒實驗、生物膜樣本采集、宏基因組提取 實海測試位置位于山東省威海市西港小石島海域（N37°31'51″，E121°58'19″）的觀景和科研觀測兩用平臺。海水深度在10-12 m，掛板深度為2.5 m。觀察取樣時間為2019年夏季，掛板周期為28 d，分別在7 d、14 d、21 d、28 d對鋼板各復合涂層表面生物膜取樣，觀察期間海鞘屬于生物量最大的污損生物。每次取樣時測量海水溫度、pH值、鹽度3種環境因子，5次取樣的平均海水溫度在18.7℃左右，pH值約為7.79，鹽度為32±0.7%。鋼板的A面涂覆鐵紅基質的涂層，包括鐵紅底漆分別添加4種納米材料制備的復合涂層及鐵紅底漆陰性對照；B面涂覆丙烯酸基質的涂層，包括丙烯酸底漆分別添加4種納米材料制備的復合涂層及丙烯酸底漆陰性對照；每種納米材料從上至下設置4個重復，以消除浸沒深度對菌群分布的影響。最下面一層涂覆陰性對照，不取樣（圖1）。圖中“鐵紅”表示鐵紅陰性涂層，“丙”表示M133丙烯酸樹脂成膜物陰性涂層。生物膜取樣和后續處理參照文獻［16-17］進行，每次共采集40個涂塊的生物膜樣本。采用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（B518251，上海生工）獲取生物膜宏基因組DNA。

1.2.3 16S rRNA基因全長高通量測序 將第28天提取的40個宏基因組樣本按照每4個相同涂塊等量混合成一個DNA樣本的方式得到10個生物膜DNA。鐵紅涂層的海鞘（主要是玻璃海鞘）附著量明顯多于丙烯酸涂層，后者在實驗期間幾乎未見明顯的海鞘附著和生長，而其他污損生物在兩類涂層上的附著程度差異遠小于海鞘，第28天的觀察結果見表2。所以本次掛板結果適合比較兩類涂層上與海鞘附著可能密切相關的生物膜菌群結構差異。為此，將表2中的10個宏基因組樣本作如下處理：鐵紅陰性對照記為S3，4個鐵紅納米涂層宏基因組進一步等量混合成S4，丙烯酸陰性對照記為S7，4個丙烯酸納米涂層宏基因組進一步等量混合成S8。

表2 第28天觀察結果

1.2.4 qPCR驗證Neptuniibacter菌含量課題組近期依據高通量測序結果為涂層中含量較高的Neptuniibacter屬成功設計了一對特異性引物，上游引物：5'-CGC GTA GGT GGA TTG GSC-3'，下游引物：5'-CCG TCA ATT CAT TTG AGT TTT AAC CTT-3'。利用實時熒光定量系統（ABI Stepone system）定量測定不同取樣點、不同涂層表面生物膜樣本中Neptuniibacter的相對含量，即測定樣本中Neptuniibacter屬16S rDNA總的拷貝數。通過獲取更全面的各涂層定量信息，以達到進一步考察Neptuniibacter與海鞘的潛在作用規律的目的。qPCR定量測試的樣本為4次取樣的10個涂層總計40個生物膜宏基因組樣本，使用標準PCR擴增產物連續稀釋10倍獲得10-1-10-5共5個濃度梯度作為定量標準制作標準曲線，用于制作標準曲線的標準樣本及待測樣本均重復3次［18］。PCR擴增體系為NPK62 2×buffer 6 μL，上下游引物各1.5 μL，Taq酶0.25 μL，基因組模板4.25 μL。擴增條件為94℃，4 min，（94℃，30 s；57℃，40 s；72℃，40 s）×42 個循環，72℃，2min。

2 結果

2.1 多樣性指數分析（Alpha-diversity）

表3數據顯示各組Coverage值均在0.96以上，可以較好地反映樣本生物膜中微生物的真實情況。環氧鐵紅組的alpha多樣性指數（Shannon和Simpson）低于丙烯酸樹脂組；環氧鐵紅陰性組的多樣性較添加CNTs組稍大，丙烯酸組與之相反。環氧鐵紅陰性組的observed_otus最高，添加CNTs后OTU數明顯減少，但在丙烯酸樹脂組添加CNTs前后差異卻非常小，暗示了納米材料對鐵紅涂層性質影響較大，而對丙烯酸涂層影響較小。

表3 原核菌落多樣性參數

2.2 物種分類與豐度分析

16S測序結果表明，全部樣品中包含的OTU個數為778，涵蓋了26個門，40個綱，80個目，144個科，284個屬，350個種的菌類。圖2為4組生物膜樣本細菌在屬層面上的相對豐度比較，排名前9位的均隸屬于Proteobacteria（變形菌門）。其中，Cycloclasticus（解環菌屬）豐度最高，在兩種底漆基質豐度占約為19%-22%。其次是Rhodovulum（小紅卵菌屬），該屬在環氧鐵紅底漆中豐度（16.6%-17%）遠高于丙烯酸底漆（2%-3%），含有CNTs的生物膜組豐度略高于陰性對照組。Neptuniibacter屬隸屬于Oceanospirillaceae（海洋螺桿菌科）在環氧鐵紅底漆中相對豐度達到11.6%左右，然而在丙烯酸底漆中該菌屬含量幾乎為零；而海洋螺桿菌科的另一屬Neptunomonas的豐度狀況與Neptuniibacter恰好相反，在環氧鐵紅底漆中豐度極低，僅占1%左右。Sulfitobacter（亞硫酸桿菌）的豐度低于前幾種菌，丙烯酸底漆中豐度（6.3%）略高于鐵紅底漆（1.1%）。

圖2 屬分類水平的豐度比較

圖3為4組生物膜樣本細菌在種層面的豐度比較，除了占20%左右的未知菌種外，豐度排名最前的兩名依然是Cycloclasticus pugeti和Rhodovulum sp.KU27F。Cycloclasticus pugeti在各組生物膜中差異量不大；Rhodovulum sp.KU27F3在鐵紅底漆中豐度很高（約為18%），在丙烯酸底漆中豐度很小（僅為2%-3%），為鐵紅組的1/7左右。Neptuniibacter sp._CAR-SF在丙烯酸組中的豐度近乎為零（0-0.03%），而鐵紅組豐度在3%-5%之間，形成了極大的差異。Cellvibrionales unclassified菌也有類似情況，在鐵紅涂層（占比3%-5%）中含量遠高于丙烯酸涂層（0%）。Neptuniibacter_sp._CAR-SF和Cellvibrionales unclassified菌的含量在鐵紅涂層中含量均在4%左右，而在丙烯酸涂層中幾乎為零，對應的OTU序列讀數在兩類涂層中相差100倍以上。由于該兩種菌在兩種基質中含量構成的明顯差異，后續便使用qPCR定量實驗方法進一步驗證這一差異。

圖3 種分類水平的豐度比較

圖4-A為qPCR樣本的擴增產物融解曲線，各樣本的擴增產物呈現單一的融解峰，說明擴增產物特異性較好，定量結果可信。由圖4-B可以看出，丙烯酸涂層中Neptuniibacter屬的含量比鐵紅涂層要低幾倍到幾十倍，這與高通量測序的結果一致。另外，qPCR數據顯示，Neptuniibacter在鐵紅涂層較之于丙烯酸涂層中的含量優勢從第7-14-21-28天是逐漸增大的，但是鐵紅/DPt涂層的上述優勢一開始就很大，而該涂層表面海鞘的平均附著程度也是所有涂層中最大的（表2）。暗示Neptuniibacter屬的存在對海鞘的附著可能是因而不是果。

圖4 qPCR溶解曲線（A）涂層生物膜樣本中Neptuniibacter屬的qPCR測定結果（B）

2.3 PCA分析

PCA（Principal component analysis）分析即主成分分析，是一種對數據進行簡化分析的技術，這種方法可以有效的找出數據中最“主要”的元素和結構，可以用來對含有多參數變量的一組復雜樣本進行聚類分析。如圖5所示，S3與S4之間的差距大于S7與S8之間的差距，說明丙烯酸涂層添加納米材料前后的菌群結構變化相對較小，而鐵紅基質在添加納米材料前后其菌群結構發生很大的變化。另外，圖5橫坐標反映了92.7%的差異，而縱坐標只反映了6.09%的差異，說明兩種基質帶來的菌群結構差異遠大于納米材料在兩種基質中帶來的菌群結構差異。

2.4 表征結果

圖6為放大1 000倍后，兩種陰性涂層及其對應的共8種納米涂層的SEM圖片。可明顯觀察到兩種底漆的表面形貌有很大的差別，本研究所用的環氧鐵紅基質的5個涂層（a-e）均比較粗糙，丙烯酸基質的5個涂層（f-j）除表面除少量突起外，觀察窗口下表面較為光滑平整。鐵紅涂層表面與自身對照相比并沒有觀察到納米材料在表面形成任何規律性的形貌，說明盡管大部分納米材料被埋藏于表面以下，但是仍然對涂層表面性質產生了一定的影響，繼而改變了生物膜中菌群的多樣性特征；丙烯酸涂層與自身對照相比表面出現了較大的顆粒，可能暗示這些納米材料在基質中的聚集現象。

圖5 復雜菌群組成差異的PCA分析

表4為10個涂層的靜態接觸角測試結果。每種基質在添加納米材料前后表面接觸角數值非常接近。無論浸潤液體為純水還是海水中，兩種涂層均表現出親水性（接觸角＜90°），在海水環境中，丙烯酸基質涂層疏水性略大于鐵紅基質涂層，兩種涂層的浸潤性能差別不大。

3 討論

本研究以鐵紅防銹漆和丙烯酸樹脂成膜物為基質，混合4種CNTs制備了兩類涂層。經過實地海洋掛板，發現兩類涂層上海鞘的附著程度有很大差異。采集了涂層表面生物膜并提取宏基因組DNA進行16S rRNA全長高通量測序，分析了原核微生物在兩類不同基質中的菌落組成、多樣性分析及物種豐度，以及添加納米材料對涂層表面菌群結構的影響。

全長測序表明涂層表面的原核菌群以變形菌門為主，在兩種基質占比達80%以上，這與非全長測序結果一致［19］。屬層面豐度最高的Cycloclasticus菌是一種嗜油類微生物，在我國海域分布較廣。Rhodovulum、Neptuniibacter兩種菌在不同基質中形成了十分明顯的差異，鐵紅基質有大量的分布，而丙烯酸基質分布極少，尤其是Neptuniibacter菌豐度近乎為零。文獻表明前一種菌的部分菌株能適應較寬的CO2濃度范圍，在海岸線、內陸環境中高效同化CO2，對緩解全球變暖具有重要意義［20］。Neptunomonas與Neptuniibacter同屬一科，豐度分布規律則恰恰相反，同一種常見的海水養殖中后期優勢菌（Sulfitobacter）［21］在丙烯酸涂層中大量分布，而在鐵紅基質中僅占比1%左右。全長測序能在種層面提供較為全面的信息，本研究初步發現的兩個菌株Neptuniibacter sp.CAR-SF和Cellvibrionales unclassified與海鞘存在積極的作用關系，但目前還沒有任何與海鞘幼蟲附著相關的生物學報道。其中海洋細菌Neptuniibacter sp.CAR-SF被發現可以降解咔唑［22-23］，而Cellvibrionales unclassified尚未完成基本的命名，需要在后續的研究中進一步確認并加強功能研究。

圖6 涂層的SEM表征結果

關于納米材料對生物膜菌群組成的影響，所觀察到的結果比較出人意料。在兩類基質的涂層中，幾種納米材料對生物膜菌群的組成影響較小。通過SEM表征發現100 μm的觀察窗口下鐵紅涂層表面比較粗糙，且表面局部形貌的形狀不規則，而丙烯酸樹脂成膜物涂層表面相對光滑，有少量細小顆粒狀突起。本研究所用的納米材料除納米鉑以外長度都在10 μm以上，添加納米材料之后表面的無規則凸起數量也有增多，但在2-10 μm的觀察窗口下并不明顯，納米材料對表面結構未產生大的影響。肉眼對涂層進行觀察時發現添加了CNTs的涂層顏色偏暗，丙烯酸的透明基質中能發現分布較為均勻的黑色小顆粒，或為部分CNTs聚集所致，這一現象可以更有力的說明納米材料不是浮于表面而發揮防污作用，而是懸浮或沉積于底部，但仍然在一定程度上改變了涂層的表面性質［16，24-25］。這一點需要后續研究中設法消除納米材料的聚集并實施更細致的形貌分析（如原子力顯微鏡）和理化參數分析。

表4 全部涂層的靜態接觸角

基于丙烯酸酯及其衍生物作為基質的涂層具有優越的防污性能［26］，若想研制出具備更高環保性質的防污涂層則離不開對污損生物幼蟲附著機制的研究，且這類機制的研究與涂層表面生物膜關系是密不可分的。

4 結論

本研究發現丙烯酸基質的原核菌群多樣性略高于鐵紅基質，納米材料的添加對兩類涂層上菌群結構的改變程度都比較有限，但是兩類涂層中個別菌種的含量差異非常巨大。差異最大的兩個種分別是Neptuniibacter sp.CAR-SF和Cellvibrionales unclassified，兩者在鐵紅涂層中含量均在4%左右，而在丙烯酸涂層中幾乎為零，對應的OTU序列讀數在兩類涂層中相差100倍以上，構成的差異十分明顯。而qPCR結果進一步證實了Neptuniibacter屬在兩類涂層中含量相差確實很大，暗示了該菌的存在對玻璃海鞘的附著可能具有誘導作用。目前尚未發現關于該兩種菌與海鞘附著相互作用關系的文獻，上述研究結果的進一步確認需要將來更細致的探索。