釀酒酵母關聯多藥耐受性轉錄因子Yrr1p的研究進展

曹文妍 王心凝 沈煜 李在祿 鮑曉明，

（1.齊魯工業大學生物工程學院 生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室 山東省微生物工程重點實驗室，濟南 250353；2.山東大學微生物技術研究院 微生物技術國家重點實驗室，青島 266237）

環境脅迫是對生物生存與生長不利的各種環境因素的總稱，是顯著偏離生物適宜生長范圍環境因素（如高溫、高鹽、營養饑餓、抑制物等）的水平。生物體對環境脅迫產生應答反應，并最終形成耐受性的過程，稱為環境脅迫反應（Environmental stress response，ESR）［1］。一般地，細胞可利用脅迫響應轉錄因子來激活特定基因的表達，以應對各種環境脅迫［2-5］。在以木質纖維素為原料的二代燃料乙醇生產工藝中，秸稈類原料的預處理不可避免地產生多種對微生物生長不利的抑制物，其中香草醛是酚類抑制物的典型代表化合物，形成環境脅迫，明顯干擾微生物生長及乙醇發酵過程［6］。本課題組前期工作中發現，缺失關聯多藥耐受性轉錄因子 Yrr1p（for yeast reveromycin aresistance）是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）提高香草醛耐受性的重要原因［7］。然而，這與Yrr1p對提高其他藥物耐受性的表現不同，該轉錄因子的存在或獲得性功能突變能夠顯著提高釀酒酵母對如細胞周期抑制劑Reveromycin A和寡霉素、4-硝基喹啉-N-氧化物、水楊酸、戴森錳鋅等藥物的耐受性［8-12］。這種截然相反的現象暗示Yrr1p在不同抑制物脅迫下存在不同的調控功能。本文將回顧Yrr1p的發現過程，并對這幾年的相關研究進展，特別是Yrr1p結構及其介導釀酒酵母耐受性的調控機制做出綜述，為生物體脅迫應答調控網絡的研究提供模式依據。

1 轉錄因子Yrr1p的結構特征

釀酒酵母的YRR1基因（YOR162C）位于釀酒酵母第XV號染色體上，基因全長2 466 bp，編碼的蛋白Yrr1p由810個氨基酸殘基組成。Yrr1p氨基端的DNA結合結構域中存在一個Zn（II）2Cys6型的鋅指結構基序CGFCRRRKLRCDQQKPMCSTCISRNLTTC，由半胱氨酸介導兩個鋅原子結合，屬于鋅指蛋白的鋅簇蛋白亞家族，鋅簇蛋白僅存在于真菌中。目前只有釀酒酵母有鋅指轉錄因子Yrr1p的報道。與其他真菌鋅簇蛋白結構類似，Yrr1p蛋白序列從氨基端到羧基端依次為DNA結合域（DNA binding domain，DBD）、中心同源區（Middle homologous region，MHR，也稱為中心調控域，Central regulation domain）和激活結構域（Activating domain，AD）［13］，各個結構域執行不同的功能。（1）DNA結合域：Yrr1p的DBD又包含鋅指結構域（Znic finger domain）、連接區域（Linker region）和二聚化區域（Dimerization region）。Yrr1p通過二聚化區域形成同源二聚體后，再利用鋅指結構域特異性識別并結合于靶基因的上游順式調控元件YRRE（Yrr1p response element），其motif為T/ACCGC/TG/TG/TA/TA/T（圖1）［9，14］。（2）中心調控域：Yrr1p的中心同源區（MHR），含有蛋白激酶C磷酸化位點，位于Yrr1p蛋白質序列的第175-190位，連接氨基端DBD和羧基端的激活結構域（AD）［9］。中心調控域參與靶基因的激活，與DBD的鋅指相互作用，降低其對非結合位點的親和力并增強其對結合位點識別的特異性，它對羧基端激活結構域的轉錄激活功能存在抑制作用，該區域缺失會導致Yrr1p產生組成型活性，持續激活靶基因的表達［15］。（3）激活結構域：Yrr1p的激活結構域位于氨基酸序列的羧基端。該結構域存在潛在的磷酸化位點（S184），與Yrr1p的激活調控能力密切相關。野生狀態的Yrr1p在常態下低水平激活受控基因的表達，而當 Yrr1p激活結構域的氨基酸發生突變（如非極性氨基酸突變為極性氨基酸或者插入短肽），能夠形成高活性Yrr1p突變體，以較高水平激活受控基因表達［8，10，16］。

圖1 轉錄因子Yrr1p鋅指結構與DNA的結合方式［14-15］

2 轉錄因子Yrr1p的調控功能

Yrr1p與靶基因啟動子區域的順式調控元件YRRE（T/ACCGC/TG/TG/TA/TA/T）結合，激活或抑制靶基因的轉錄。由于轉錄因子結合結構域的特異性識別作用，一般認為啟動子含有YRRE元件的基因均是Yrr1p潛在調控靶點［9］。但在不同環境脅迫條件下，Yrr1p的調控靶點也有所不同。

2.1 轉錄因子Yrr1p的調控靶點

由于Yrr1p的中心結構域會抑制自身活性，影響全基因組范圍篩選靶基因的靈敏度，Le Crom等［9］將GAL4激活結構域與Yrr1p結合結構域融合成轉錄激活能力高于野生型Yrr1p的Yrr1*GAD。與野生型Yrr1p相比，Yrr1*GAD菌株中有15個基因的表達水平顯著上調，其中13個基因的啟動子區含有Yrr1p的識別序列YRRE。進一步通過凝膠遷移實驗證實有9個基因（SNQ2、YOR1、FLR1、AZR1、SNG1、APD1、PLB1、YPL088W和YLL056C）能夠與Yrr1p直接結合而被激活表達。推測其余6個基因（YLR179C、YLR346C、YMR102C、YLR046C、YRG035C和YKL051W）的表達是通過其他方式激活的。而這一推測也在隨后Gallagher等［16］的研究中得到證實：在無脅迫條件下，利用ChIP-Seq技術在全基因組范圍內鑒定Yrr1p調控靶點及識別元件，發現上述15個靶基因呈現不同的結合峰型，推測除YRRE外，Yrr1p可能還識別其它的順式調控元件。

綜上，Yrr1p激活的靶基主要分為以下4類：（1）ABC轉運蛋白，例如SNQ2和YOR1；（2）易化載體蛋白超家族，例如FLR1、AZR1和SNG1；（3）與胞內脂質代謝，細胞膜組分代謝有關的PLB1，YPL088W、APD1、和YLL056C；（4）其他功能尚不清楚的YLR179C、YLR346C、YMR102C、YLR046C、YRG035C和YKL051W。

本課題組對YRR1敲除菌株及其野生菌株進行轉錄組學分析，結果顯示，在無香草醛脅迫下，Yrr1p缺失只引起8個基因發生差異表達，其中6個表達上調（線粒體膜蛋白FMP45和UTH1、L-鳥氨酸轉氨酶 CAR2、內質網膜合成相關SCS3以及功能未知的YCL048W-A 和YBR230W-A），2個表達下調（質膜蛋白YDR276C 和細胞溶質小蛋白CMI7）［17］。Le Crom等［9］已證實的受Yrr1p激活的靶基因都不在其列。Yrr1p的缺失和存在均能引起基因的差異表達，但所調控靶基因的不同暗示這兩種狀態參與不同的生物學過程。

2.2 轉錄因子Yrr1p提高釀酒酵母對多種含苯環藥物耐受性的機制

轉錄因子Yrr1p提高釀酒酵母抑制物耐受性機制的研究工作主要涉及的抑制物，包括細胞周期抑制劑Reveromycin A和寡霉素、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-oxide，4-NQO）、水楊酸、戴森錳鋅等。Cui等［8］對細胞周期抑制劑Reveromycin A高耐受釀酒酵母菌株YRR1-1的基因組文庫進行抗性元件的篩選發現，YOR162C的一個突變體能夠顯著提高釀酒酵母對Reveromycin A及4-NQO的耐受性。而敲除該基因則導致釀酒酵母對這兩種藥物的敏感表型。進而Zhang 等［10］證實了該突變基因在對線粒體抑制劑寡霉素的耐受性上也發生了相同的現象。為此將YOR162C命名為YRR1（for yeast reveromycin A resistance）。Kodo等［11］也進行了類似研究，他們將一株水楊酸高耐受性酵母菌株與野生型菌株進行雜交，分離其子代并進行遺傳特性分析，確定水楊酸高耐受表型是由單基因控制。利用該高耐受菌株的基因組文庫篩選這個單基因，確定是YRR1的獲得性功能突變體YRR1-52提高了菌株對水楊酸的耐受性。同時發現YRR1-52也能提高釀酒酵母對4-NQO和寡霉素的耐受性。另外，有研究者從感染真菌性急性肺炎的艾滋病患者體內分離出致病性釀酒酵母YJM789，該菌株較經典S288C衍生菌株的衍生株S96具有更高的4-NQO耐受性。數量性狀位點分析表明，不同耐受性表型與兩者的YRR1序列差異有關［16］。

一般地，當釀酒酵母受到環境脅迫時，會激活轉運蛋白表達來幫助毒性物質外排，以維護自身存活。例如，4-NQO、寡霉素和戴森錳鋅分別依賴于ABC轉運蛋白Snq2p、Yor1p以及易化載體超家族Flr1p［8，12，18-19］的表達，而Yrr1p調控的靶基因則正是一些與抑制物耐受性有關的膜轉運蛋白。4-NQO高耐受性YRR1基因突變株YRR1-1和YRR1YJM789受4-NQO脅 迫 后，其ABC轉 運 蛋 白Snq2p和Yor1p表達量較對照菌株均顯著上調，而無脅迫條件下，SNQ2的轉錄水平不受YRR1突變體的影響［8，16］。在YRR1和SNQ2雙缺失菌株中回補YRR1不能補救釀酒酵母對4-NQO的敏感性，證明Yrr1p主要通過激活SNQ2的表達從而提高菌株對4-NQO的耐受性。而后Zhang 等［10］在YRR1缺失菌株中將YOR1的啟動子在不同位置進行突變，利用這些突變的啟動子控制YOR1-lacZ的表達，并用低拷貝質粒分別回補野生型YRR1和突變體YRR1-1，經酶活測定，發現 Yrr1p 是通過結合在YOR1起始密碼子上游-222到-190位置序列，激活YOR1表達，賦予釀酒酵母對寡霉素的耐受性。這兩種轉運蛋白表達量在Kodo等［11］發現的水楊酸高耐受性突變株YRR1-52中也有提高。熒光定量PCR結果表明YRR1-52是通過激活膜轉運蛋白Snq2p、Yor1p、Flr1p和Azr1p的高表達綜合提高菌株對水楊酸的耐受性，其中Flr1p也是釀酒酵母耐受殺菌劑戴森錳鋅的關鍵蛋白［12］。熒光定量PCR結果顯示在野生型釀酒酵母菌株中破壞YRR1，FLR1的轉錄水平會相應下降50%，從而引起菌株對戴森錳鋅的超敏感性。上述突變形式的Yrr1p增強了自身激活調控能力，在多種結構的含苯環藥物脅迫條件下，激活相關轉運蛋白表達，賦予突變株較野生型狀態較高的藥物耐受性水平。這些突變體共同的特征是Yrr1p激活結構域的堿基序列發生置換或插入突變，這種獲得性功能突變改變了Yrr1p蛋白結構。如YRR1-1突變體，在Yrr1p第695至706位插入12個氨基酸序列RTYRTILGNVIE［8］。YRR1-52突變體發現Yrr1p激活結構域的第626位絲氨酸突變為苯丙氨酸［11］。這兩種突變如何影響Yrr1p活性還需進一步研究。另外，研究發現4-NQO高耐受性酵母菌株YJM789的YRR1基因YRR1YJM789編碼的氨基酸序列第775位是蘇氨酸，能夠被磷酸化，而低耐受性菌株YRR1S96的第775位是異亮氨酸，不能發生磷酸化。研究人員將YRR1S96的異亮氨酸突變為帶負電荷的谷氨酸，以模仿該位點被磷酸化后的強負電荷，結果顯示突變后S96的4-NQO耐受性顯著提高，且與YJM89的耐受性水平相當，從而證實激活結構域的磷酸化狀態與Yrr1p介導釀酒酵母對4-NQO的耐受性密切相關［16］。

2.3 缺失轉錄因子Yrr1p提高釀酒酵母香草醛耐受性的機制

本課題組近幾年的研究發現，Yrr1p與釀酒酵母對香草醛的耐受性有關。香草醛是酚類化合物，對微生物生長發酵有強烈的抑制［20-21］。而酚類化合物是二代燃料乙醇預處理過程中不可避免的抑制物［21］。利用基因組測序技術發現，YRR1發生缺失突變是釀酒酵母EMV-8菌株香草醛耐受性提高的主要原因［22］。對YRR1的同源基因YRM1，PDR8分別在野生型和YRR1缺失菌株中敲除，并沒有引起香草醛耐受性的改變，推測同源基因之間的功能補償或競爭結合作用不是YRR1缺失提高香草醛耐受性的原因。進一步轉錄組學數據顯示，在無香草醛脅迫條件下，YRR1缺失只引起8個基因發生顯著差異表達。而在香草醛脅迫條件下有多達218個基因發生顯著差異表達。這一現象暗示香草醛在Yrr1p調控中發揮重要作用，即香草醛本身可能是Yrr1p調控的效應物。其中上文所涉及的其他藥物耐受性相關的Yrr1p受控基因SNG1、SNQ2、YLL056C和APD1在YRR1缺失菌株中顯著下調，其余受控基因表達量無明顯變化。這也說明香草醛與其他藥物的耐受性機制可能不同。另外，轉錄組結果還顯示香草醛抑制了野生型菌株的核糖體合成、rRNA加工相關基因的表達。而敲除YRR1則可以解除該抑制作用，相關基因（如RNA解旋酶基因DBP2）表達提高［23］。超表達DBP2能夠提高細胞對香草醛的耐受性，因此我們推測DBP2可能是潛在的Yrr1p負調控靶點。目前已報道的Yrr1p調控靶點均不涉及這類生物學過程，這可能是因為對Yrr1p靶基因的鑒定工作一般在常規培養條件下進行，忽略了抑制物本身的作用。因此，未來對于Yrr1p靶點的研究可以在不同環境如香草醛脅迫條件下進行，以發現新的調控靶點。該研究將揭示香草醛作為調控效應物影響 Yrr1p調控網絡的機制以及相應的分子結構基礎，為研究藥物與轉錄因子之間的相互作用提供示例。

3 轉錄因子Yrr1p的上游調控

轉錄因子Yrr1p在調控下游靶基因的同時，也會受到上游更高級調節蛋白或信號途徑的調控。Pdr1p和Pdr3p是釀酒酵母中調控多藥耐受性（Pleiotropic drug resistance，PDR）的一對同源轉錄因子，其識別的上游順式調控元件為PDRE（Pdr1/3p response element），其motif為C/TCCGC/TGGA/G［24-25］。YRRE和PDRE兩者序列僅在CCG三聯體周圍堿基組成上略有差異，并且單獨或交疊分布在共同調控靶基因的啟動子區［26］。YRR1啟動子存在Pdr1p結合位點PDRE以及Yrr1p自身結合位點YRRE，Zhang等［10］通過構建Yrr1p啟動子連接β-半乳糖苷酶（Laz）報告基因載體與含有兩種活躍程度的Pdr1p質粒共同轉化至釀酒酵母，證實Pdr1p可以激活YRR1表達。另外用類似的方法證明Pdr3p可以激活YRR1表達和YRR1可以自我激活轉錄［10］。而調控Yrr1p的上游信號途徑至今沒有研究。此外，Pdr1p和Pdr3p所識別的PDRE元件，也分布在Yrr1p的一些靶基因啟動子區域，如ABC轉運蛋白基因（SNQ2和YOR1）與易化載體超家族基因（AZR1、SNG1和FLR1）等。因此，不僅YRR1受Pdr1p和Pdr3p激活表達，其靶基因也受到Pdr1p和Pdr3p的直接調控。

4 轉錄因子Yrr1p的同源轉錄因子

此外，在釀酒酵母的全基因組中，已經鑒定到的有54個Zn（Ⅱ）2Cys6鋅簇蛋白，其中存在與Yrr1p的鋅指結構基序高度同源的兩個鋅簇蛋白—Yrm1p（Yor172wp）和Pdr8p（Ylr266cp），三者調控靶基因的重疊度高達80%以上。雖然同源蛋白的全氨基酸序列與YRR1的相似度并不高，分別為25.7%和41.1%，但鋅指結構域的高度相似（圖2）是它們調控相似靶基因的主要原因［9，27-28］。

圖2 Yrr1p與其同源基因鋅指結構域氨基酸序列的比對［9］

Yrm1p與Yrr1p存在相互作用。Lucau-Danila等［28］在YRR1缺失和野生型釀酒酵母菌株中分別轉入由半乳糖誘導啟動子控制表達的YRM1，對它們分別進行基因差異表達分析并結合Northern blot驗證，結果發現YRR1缺失菌株中，23個基因的表達水平顯著上調，利用染色質免疫共沉淀技術證明這23個基因均是Yrm1p的調控靶點，其中包含了14個Yrr1p的靶基因。而在野生型菌株中，相比YRR1缺失菌株，這14個靶基因表達水平明顯下調。換而言之，只有當YRR1缺失時，Yrm1p才發揮激活調控能力；Yrr1p存在，Yrm1p抑制Yrr1p轉錄調控活性，降低Yrr1p的靶基因轉錄水平。接著研究者構建了含有Yrm1p的結合結構域與Gal4p激活結構域的嵌合轉錄因子（該轉錄因子缺少了中心同源域），重復前面的實驗，結果與前者相反，Yrr1p對Yrm1p的影響消失了。這些結果表明，Yrm1p和Yrr1p兩者之間對靶基因啟動子的競爭關系依賴于它們的中心結構域。

Hikke等［27］使用了與上述相似的辦法，在野生型釀酒酵母中轉入半乳糖誘導啟動子控制表達的PDR8，對其進行基因轉錄水平的差異表達分析，結合染色質免疫共沉淀，證明了Pdr8p激活調控了8個靶基因，其中4個基因（AZR1、SNG1、YOR1和YLL056C）是Yrr1p的靶基因。

所有列出的基因受Yrr1p激活調控，主要分為4個功能類別：易化載體超家族、ABC轉運蛋白、代謝和未知功能。Yrr1p大部分靶基因同時也受轉錄因子Pdr1p、Pdr3p、Pdr8p和Yrm1p調控。這些轉錄因子激活調控其它轉錄因子的表達（Pdr1p和Pdr3p激活調控YRR1）或激活自身表達（Yrr1p），轉錄因子之間還存在相互作用（Yrr1p和Yrm1p互相抑制激活調控能力，Yrr1p對Yrm1p的抑制程度更高）。

5 總結與展望

Yrr1p轉錄因子的作用廣泛，參與釀酒酵母多藥耐受性的調控及其他化學脅迫壓力的響應。調控轉運蛋白、透性酶和代謝相關等靶基因的表達。圖3總結了以上綜述的Yrr1p的藥物耐受性調控網絡。可以看到，耐藥性調控網絡不是簡單的單向關系，在調控方式上，YRR1與功能高度相似的PDR1/PDR3/PDR8之間存在相互調控、協同互作的關系，同時YRR1和同源基因YRM1之間又存在相互作用關系。多藥耐受性調控網絡存在重要的重疊，一個轉運蛋白同時受多個轉錄因子調控，目的就是為了避免因一個轉錄因子發生突變而導致致死反應。上述轉錄因子構成釀酒酵母應對各種環境脅迫條件的遺傳緩沖調控的重要部分，同時也是釀酒酵母全局應激調控網絡的重要組成部分。在研究Yrr1p轉錄因子調控機制的同時，還應從全局考慮，關注整個脅迫應答調控網絡。

圖3 Yrr1p與其同源轉錄因子的調控網絡關聯多藥耐受性調控網絡［9，28］

另外，本課題組發現Yrr1p對木質纖維素水解液中的香草醛耐受性有負調控作用，且Yrr1p對在香草醛脅迫下的調控網絡不同于其他多藥耐受性的調控網絡，香草醛或許是Yrr1p調控網絡中小分子效應物，與Yrr1p協同抑制翻譯相關基因。未來可以利用ChIP-Seq在有和無香草醛條件，發掘Yrr1p潛在的調控靶點。

釀酒酵母耐受機理的研究，特別是解析抑制物對脅迫相關轉錄因子調控網絡的影響，為緩解纖維素乙醇生產中毒性化合物抑制的瓶頸問題提供理論基礎，同時對抗逆釀酒酵母細胞工廠的構建具有指導意義。