化學衍生化技術在農藥分析中的應用研究

張 婧，王 玥，李紅霞，林吉柏

(北京穎泰嘉和分析技術有限公司，北京 102206)

1 概述

農藥產品中的活性成分及雜質含量是農藥登記注冊要求提供的信息。氣相/液相色譜是分析檢測中最常用的分析方法，已廣泛用于農藥主成分及其雜質的檢驗。氣相色譜具有分離能力強、靈敏度高、分析快速等優點，但是會受使用條件的限制，不能直接檢測一些熱穩定性較差或高沸點的物質，通常需要先把這些物質轉化為穩定性好或沸點低的衍生物再進行檢測。液相色譜檢測常使用反相色譜模式，而一些極性強的化合物如草銨膦、草甘膦等卻無法在反相柱上保留。用親水色譜柱可以分析這些強極性待測物，但親水色譜柱價格昂貴，因此通常先對化合物進行衍生化，再進行檢測。此外，農藥產品中雜質含量一般較低，有的雜質分子量較小，也不適合用常規的色譜分析方法直接測定其含量。也可以通過適當的衍生化，提高雜質的色譜適用性和靈敏度，從而達到檢測要求。因此，在農藥分析領域中發展衍生化技術具有重要的意義。

衍生化方式有柱前衍生、柱上衍生和柱后衍生3種。間接分析法中衍生化試劑的選擇尤為重要，在選擇時需要綜合考慮以下幾方面的因素：⑴ 衍生試劑必須穩定，不與本底發生反應；⑵ 衍生試劑本身和生成的副產物干擾應盡可能小，衍生化反應的轉化率盡可能完全；⑶ 衍生化反應條件不能太苛刻，避免高溫高壓等條件；⑷ 試劑安全易獲得，毒性較小。

本文結合實例，介紹基于衍生化技術定量分析吡蚜酮、乙烯利和咪唑乙煙酸3種農藥活性成分或其雜質的方法。

2 吡蚜酮中雜質——水合肼的測定

對于吡蚜酮中雜質——水合肼的測定，常采用ZB G14001-90中規定的方法，即利用水合肼與硫酸生成硫酸肼，在碳酸氫鈉存在下，用碘溶液滴定的方法。此方法工作量大，重現性差，準確度不高。本文介紹了測定樣品中微量的水合肼的基于衍生化技術的液相色譜法[1]。

2.1 衍生化方法

本實驗室用過量的五氟苯甲醛(PFB)衍生水合肼，形成吖嗪化合物(PFBA，圖1)。具體為將吡蚜酮樣品溶解于乙腈∶超純水=5∶1(體積比)的混合溶劑中，加入過量的衍生化試劑PFB，充分混合10 min后，用正己烷萃取收集衍生化產物，用GC-ECD檢測分析。

圖1 水合肼衍生化反應過程

2.2 儀器條件

安捷倫DB-5色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)：起始溫度60 ℃，以40 ℃/min升至100 ℃，再以20 ℃/min升至250 ℃，持續5 min。流速：1.0 mL/min(恒流)，不分流。進樣量：1 μL，進樣口溫度：250 ℃，檢測器溫度：300 ℃。

2.3 結果

衍生化試劑PFB不與主成分吡蚜酮反應，過量的PFB與衍生化產物PFBA能夠很好地分離。由于衍生化產物分子中含有10個氟原子，利用ECD檢測器進行分析，可以獲得較好的響應。研究獲得的LOD為0.32 ng/mL，定量的下限是36.5 ng/mL(圖2)。此方法適合大多數農藥體系中水合肼的定量。

圖2 36.5 ng/mL衍生化產物PFBA的氣相色譜圖

3 乙烯利主成分及相關雜質MEPHA的定量

乙烯利是一種常用的植物生長調節劑，其不僅自身能釋放出乙烯，而且還能誘導植株產生乙烯。乙烯利在pH＜3.5水溶液中穩定，隨pH升高而水解釋放出乙烯；對紫外光敏感，75 ℃以下穩定；沸點約265 ℃(分解)，溶于乙醇、甲醇等極性有機溶劑。MEPHA是植物生長調節劑乙烯利的中間體，也是乙烯利產品中的相關雜質。其沸點124～125 ℃，可在中性至堿性溶液中分解而放出乙烯。MEPHA與乙烯利具有類似的化學結構，對紫外光及熱不穩定。FAO明確要求乙烯利中MEPHA的限值為20 g/kg。

圖3 乙烯利和MEPHA的結構式

關于乙烯利的分析方法，國際上FAO采用CIPAC方法，即化學法的酸堿滴定法[2]；我國化工行業標準方法是將其經重氮甲烷酯化，以對硝基苯作內標，對乙烯利甲酯進行氣相色譜法定量分析[3]。重氮甲烷不穩定且易爆，實驗室制備及儲存不方便也不安全。《農藥分析》[4]一書介紹了一種簡單的測定方法即測定乙烯的重量法，但是以上方法的步驟較繁瑣，重現性差、誤差大。本文介紹一種新的衍生化方法，用N,O-雙(三甲基硅基)乙酰胺(BSA)對被試物進行甲基化衍生化后，對衍生化產物進行氣相色譜法分析。該方法重現性好，靈敏度高，衍生試劑安全易獲得。

3.1 衍生化方法

過量的BSA衍生乙烯利和乙烯利雜質MEPHA中的羥基，形成硅甲烷化衍生產物(圖4、圖5)。本實驗室的具體操作為將含乙烯利或MEPHA的樣品溶解于二氯甲烷中，加入過量的衍生化試劑BSA，在(54±2) ℃放置0.5 h，用二氯甲烷定容后用GC-FID檢測分析。

圖4 乙烯利衍生化反應過程

圖5 MEPHA衍生化反應過程

3.2 儀器條件

3.2.1 測定乙烯利的色譜條件

安捷倫DB-5色譜柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)：起始溫度：100 ℃，持續1 min，然后以20 ℃/min升溫至250 ℃，持續1 min。流速：2.0 mL/min(恒流)，進樣口溫度：200 ℃，分流比：15∶1，進樣量：1 μL，檢測器溫度：280 ℃。乙烯利的衍生化產物的保留時間為5.0 min。

3.2.2 檢測MEPHA的色譜條件

安捷倫DB-5色譜柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)：起始溫度：80 ℃，持續1 min，然后以20 ℃/min升溫至280 ℃，持續1 min。流速：2.0 mL/min(恒流)，進樣口溫度：200 ℃，分流比：20∶1，進樣量：1 μL，檢測器溫度：280 ℃。MEPHA的衍生化產物的保留時間為7.0 min。

3.3 結果

3.3.1 乙烯利的測試結果

衍生化試劑BSA能夠與乙烯利充分反應，用常規的FID檢測器分析衍生化產物，可以獲得較好的響應。線性范圍為767.14～1 203.72 μg/mL(圖6)，線性相關系數為：0.999 7，精密度：1.36%，回收率為：(99.94±0.60)%，無基質效應。衍生化的轉化率為：(101.1± 0.75)%。

圖6 767.14 μg/mL乙烯利標準品的氣相色譜圖

3.3.2 MEPHA的測試結果

衍生化試劑BSA能夠與MEPHA充分反應，用常規的FID檢測器分析衍生化產物，可以獲得較好的響應，線性范圍為4.87～79.66 μg/mL(圖7)，線性相關系數為：0.999 7，精密度：1.76%，在8.0、50.0、78.5 μg/mL 3個濃度下的回收率分別為：(120.46±3.69)%、(103.72±1.25)%、(99.68±0.39)%，研究獲得的LOD為2.0 ng/mL，無基質效應。衍生化的轉化率為：(100.4±1.91)%。

圖7 17.70 μg/mL MEPHA標準品的氣相色譜圖

4 咪唑乙煙酸中甲醛的定量

常用的甲醛定量方法是通過對甲醛衍生化后進行分光光度法分析[5]，工作量大，不能實現大批量的智能操作。本文采用甲醛衍生化后液相色譜法，分析周期短，衍生化過程簡單，沒有繁瑣的前處理操作。

4.1 衍生化過程

甲醛在過量銨鹽存在下，與乙酰丙酮反應，生成二甲基二乙酰基二氫吡啶(DDL)。該化合物在414 nm處有最大吸收，3 h內吸光度基本不變。根據此原理，本實驗室的具體操作為將含醋酸銨的乙酰丙酮溶液置于含甲醛的溶液(乙腈∶超純水=1∶1)中，在(40±2) ℃水浴鍋中加熱15 min，發生衍生化反應(圖6)。衍生化產物DDL經由HPLC-DAD分析。

圖8 甲醛衍生化反應過程

4.2 儀器條件

安捷倫XDB-C8色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：乙腈∶0.5%HAc=30∶70(體積比)；波長：412 nm。流速：1.0 mL/min，進樣量：20 μL，檢測器溫度：30 ℃。運行時間：7 min。

4.3 結果

衍生化試劑能夠與甲醛充分反應，用常規的DAD檢測器分析衍生化產物，可以獲得較好的響應。線性范圍為0.425～3.401 μg/mL (圖9)，線性相關系數為：0.999 2，在0.456、0.890、1.707 μg/mL 3個濃度下的回收率分別為：(109.29±1.23)%、(100.62±0.65)%、(99.61±0.56)%，無基質效應。衍生化的產率為：(104.66±0.46)%。

圖9 0.850μg/mL甲醛標準品衍生化后的液相色譜圖

5 結語

衍生化技術在農藥分析中有著不可或缺的重要作用，通過各種衍生化手段，結合HPLC和GC等現代分析儀器與各種檢測器(DAD、FID、ECD、MS等)的聯用，實現了農藥分析檢測的高效、快速、高靈敏度、良好的重現性。如何選擇合適的衍生化試劑、優化衍生化反應條件、簡化衍生化步驟和程序、提高衍生化效率、使衍生產物穩定并便于檢測，將是衍生化技術今后需要進一步努力的方向。隨著衍生化試劑的豐富多樣以及衍生化技術的發展、分析儀器的進步，農藥的衍生化分析方法亦將更加靈敏、準確和可靠，在農藥分析檢測領域亦將發揮更大的作用。