豬圓環病毒抗原表位肽免疫層析試紙條的研制

楊禮

摘 ?要：豬圓環病毒2型（Porcine Circovirus type 2，PCV2）的感染與斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS）的發生密切相關。為快速便捷地檢測豬圓環病毒2型抗體，本次試驗主要采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，運用金黃色葡萄球菌蛋白A蛋白（Staphylococal Protein A，SPA）作為標記蛋白制備金標墊，分別以豬圓環病毒抗原表位肽和SPA免疫兔血清純化IgG作為檢測帶（T帶）與質控帶（C帶），經多次重復試驗，分別確定了膠體金的最佳標記濃度、最適pH、重懸液和樣品墊處理液的最佳配方以及檢測帶（優勢抗原表位肽）和質控帶（多抗IgG）的最適包被濃度，最終裝配成抗體檢測試紙條，用以檢測已知的PCV2陽性血清和陰性血清，驗證其檢測的敏感性、特異性與穩定性。結果表明，經納米粒度儀檢測可得知膠體金顆粒大小在10 nm～14 nm之間。用SPA標記膠體金的最適pH為6.0，最佳標記量為7 μg/mL。檢測帶和質控帶的蛋白包被濃度均為1 mg/mL。經驗證，該試紙條不同批次間以及同一批次內重復性較好，具有較好的靈敏度、特異性和穩定性，能夠準確檢測豬血清樣品中的抗體水平，可以進一步評價豬圓環病毒病疫苗的免疫效果。

關鍵詞：豬圓環病毒2型;豬圓環病毒抗原表位肽;免疫層析試紙

中圖分類號：S852.4+3 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2020）07-0022-06

1 ?材料和儀器

1.1 材料

PVC襯板、NC膜、玻璃纖維和吸水紙均購自GE公司;蔗糖、吐溫20、氯金酸和氯化鈉購自SIGMA公司;金黃色葡萄球菌A蛋白（Staphylococal Protein A，SPA）、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone，PVP）、檸檬酸三鈉、牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）和海藻糖購自BD公司;純凈水購自娃哈哈公司;SPA免疫兔血清純化后的IgG和豬圓環病毒抗原表位肽由本實驗室保存。

1.2 儀器

4 ℃離心機和納米粒度儀均購自馬爾文（Malvern）公司，型號分別為MGLD4-2A和ZNE3600。

2 ?方法

2.1 膠體金顆粒的制備

2.1.1 玻璃器皿的清潔

玻璃表面少量的污染會干擾膠體金顆粒的生成，一切玻璃器皿應該絕對清潔，使用前經過酸洗和硅化。硅化過程一般是將玻璃容器浸泡于5%二氯二甲硅烷的氯仿溶液1 min，室溫干燥后蒸餾水沖洗，再干燥備用。

2.1.2 膠體金溶膠制備

膠體金顆粒的直徑與制備時加入的檸檬酸三鈉的數量密切相關，保持其他條件恒定，只改變加入的檸檬酸三鈉的數量，可制得不同顏色的膠體金，也就是不同粒徑的膠體金（表1）。膠體金的光散射性與溶膠顆粒的大小密切相關，一旦顆粒大小發生變化，光散射性也隨之發生變異，有肉眼可見的顯著顏色變化。

在硅化后的錐形瓶中加入100 mL水，置于磁力攪拌器上加熱，同時加入1 mL 1%的氯金酸水溶液，加熱至沸，調整至一定轉速后邊攪拌邊逐滴加入2 mL 1%的檸檬酸三鈉水溶液，繼續煮沸15 min;膠體金溶液的顏色由藍變紫，再由紫變紅，冷卻后用蒸餾水定容至初始體積，置4 ℃保存。

2.1.3 膠體金顆粒大小測量

取50 μL制備好的膠體金，放入納米粒度儀內測定膠體金顆粒的大小。

2.2 金標SPA（抗原）最佳標記條件的確定

2.2.1 SPA最佳標記量的確定

⑴將SPA溶解稀釋成0.2 mg/mL;

⑵取96孔板，每孔加入100 μL的膠體金;

⑶將1 μL～20 μL 0.2 mg/mL的SPA分別加入每孔并混勻，靜置15 min;

⑷每孔加入20 μL 10%NaCl溶液，放置10 min，顏色保持紅色的為最小蛋白用量，在此基礎上加20%為最佳標記量。

2.2.2 SPA與膠體金最佳標記pH確定

⑴取96孔板，每孔加入100 μL的膠體金;

⑵每孔加入已確定的SPA的最佳標記量 ;

⑶每孔分別加入2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL和15 μL ? 的0.1 mol/L K2CO3并混勻，靜置15 min;

⑷每孔加入20 μL的10% NaCl溶液，放置10 min;

⑸顏色仍保持紅色的為最佳量，測定pH，即為SPA與膠體金的最佳標記pH。

2.3 SPA-膠體金重懸液的制備

2.3.1 重懸液的配制

按下面的方法配制重懸液。

⑴取5 g蔗糖、0.121 g三羥甲基氨基甲烷（Trishydroxymethylaminomethane，Tris）、500 μL吐溫20、2 g BSA、3%海藻糖和0.5% PVP，溶于100 mL雙蒸水中，過濾備用。

⑵取5 g蔗糖、0.121 g Tris、500 μL吐溫20和2 g BSA，溶于100 mL雙蒸水中，過濾備用。

2.3.2 SPA-膠體金重懸液量的確定

在1 mL膠體金溶液中按最佳標記量加入SPA，加入一定體積的0.1 mol/L K2CO3調節至最佳pH，室溫下計時放置30 min，每隔5 min震蕩一次。加入5% BSA至終濃度為1%，室溫下計時放置20 min，每隔 ? ? ? 5 min震蕩一次;4 ℃，2 000 r/min離心10 min，棄沉淀;收集上清液，4 ℃， ?10 000 r/min離心30 min;離心后，上清無色透明最好（圖1）。小心吸去上清，將沉淀分別溶于100 μL、150 μL和200 μL的重懸液中，制成不同重懸液的標記膠體金溶液。

2.4 樣品墊的預處理

⑴取0.6 g Tris、1 g吐溫20、1 g PVP和1 g BSA溶于100 mL水中，過濾備用。

⑵取20 mmol/L聚丁烯（Polybutylene，PB）、1%吐溫20、1% BSA和2.5%蔗糖溶于100 mL水中，過濾備用。

將玻璃纖維膜切成4 mm左右的樣品條，然后分別浸泡于兩種處理液中，室溫晾干或烘干。

2.5 金標墊的制備

SPA-膠體金重懸液混勻后分別涂抹于未做任何處理的玻璃纖維紙條上，吸附比例為10 μL/cm～50 μL/cm。自然干燥或烘干（圖2）后避光保存。

2.6 豬圓環病毒抗原表位肽與兔抗SPA IgG濃度的確定

為建立質控帶和檢測帶，將不同濃度豬圓環病毒的抗原表位肽與兔抗SPA IgG通過交叉試驗（表2），分別以1 μL/cm的速度噴于硝酸纖維素膜上，制成試紙條，觀察顯色，測定兩者反應的最佳濃度。

⑴純化后的豬圓環病毒抗原表位肽的包被濃度分別為0.5 mg/mL、0.8 mg/mL和 ?1 mg/mL;

⑵兔抗SPA IgG的包被濃度分別為 ?0.5 mg/mL、1 mg/mL和2 mg/mL;

2.7 豬圓環病毒抗原表位肽免疫層析試紙條的制備

在確定了膠體金的制備條件、標記物最適濃度、檢測帶優勢抗原表位肽濃度和質控帶多抗IgG濃度的基礎上，制備豬圓環病毒抗原表位肽免疫層析試紙條。試紙條的構造主要包括PVC襯板、NC膜、吸收墊、樣品墊、金標墊、檢測帶和質控帶（圖3）。具體制備過程如下：

⑴將優勢抗原表位肽和兔抗SPA IgG用超純水稀釋為步驟2.6所測得的最佳濃度。按1 μL/cm的速度將兩種蛋白噴于硝酸纖維素膜上，分別形成檢測帶和質控帶。

⑵在PVC底板上分別將預處理的玻璃纖維紙制成的樣品墊、檢測帶和質控帶以及金標墊和吸收墊按圖3裝配（各部分略有重疊即可）。以縱向剪切，裁成寬為4 mm的條狀成品，即為試紙條成品。

2.8 試紙條的檢測原理及結果判定

如果血液樣品中含有PCV2抗體，將該血清適度稀釋后加在本試紙條的樣品墊上，該液體隨后會沿著試紙條進入金標蛋白釋放墊中，血液樣品中含有的PCV2抗體與金標墊上標記膠體金的SPA結合形成相應的復合物，前行與包被的PCV2優勢抗原表位肽結合后形成紅色線條，即在檢測帶形成紅色條帶，繼續前行，未與抗原結合的抗體攜帶SPA與已包被的兔抗SPA IgG抗體形成紅色線條，即在質控帶形成紅色條帶。如果質控帶不出現紅色條帶，則說明該試紙條失效。如果被檢血液樣品中不含有PCV2相關抗體，則檢測帶不會出現紅色條帶，但質控帶必定會出現紅色條帶。

2.9 血清樣品的稀釋度測定

將陰性血清和陽性血清倍比稀釋，在已確定的抗原最佳標記量和最佳pH、質控帶檢測線濃度、重懸液配方及用量以及樣品墊的預處理方式等條件下，制作免疫層析試紙條，分別取1∶100、1∶200、1∶500、1∶800、1∶1 000稀釋的陰性血清和陽性血清進行檢測。

2.10 自制試紙條與市售成品試紙條的對比

將制好的試紙條與市售成品試紙條進行效果比對。

3 ?結果與分析

3.1 膠體金顆粒大小測定結果

膠體金顆粒大小測定結果如圖4及表3。

由圖4和表3可得：所制膠體金顆粒直徑大約在10 nm～14 nm之間，符合我們的要求。

3.2 標記抗原的最佳標記量和最佳pH

由圖5可得，第3孔仍保持紅色，即最小蛋白濃度為6 μg/mL，在該基礎上加20%，則SPA的最佳標記量為7 μg/mL。

由試驗可知，pH為6.0時，為最佳標記pH。

3.3 重懸液的最適量

由試驗可知，當重懸液按照5 g蔗糖、0.121 g Tris、500 μL吐溫20、2 g BSA、3%海藻糖和0.5% PVP溶于100 mL雙蒸水的方法配制，加入量為200 μL時，效果最佳。效果如圖6。

3.4 豬圓環病毒抗原表位肽與兔抗SPA多抗IgG濃度

交叉試驗表明抗原表位肽的包被濃度為1 mg/mL，多抗IgG的濃度為1 mg/mL時，效果最佳。

3.5 樣品墊的預處理

樣品墊按照標題“2.4 樣品墊的預處理”中的“（2）取20 mmol/L聚丁烯（polybutylene，PB）、1.5 mL 1.0%吐溫20、1 mL 1.0% BSA和3 g 2.5%蔗糖溶于100 mL水中”配制處理后，效果良好。

3.6 待檢血清樣品的稀釋度測定

檢測結果表明，陰性血清和陽性血清在1∶100稀釋的條件下，試紙條顯色最強，顏色最鮮明，即檢測效果最好。

3.7 自制試紙條與市售成品試紙條的對比

將制成的試紙條裝入現成的盒子中，加入100 μL的1∶100稀釋的陽性血清，對比效果如圖7。

自制試紙條質控帶和檢測帶均顯色良好，幾種市售成品試紙條檢測帶顯色較淡或假陰性較強。故本試驗所制試紙條檢測效果明顯相對較好。

4 ?討論

膠體金免疫層析技術是一種將膠體金標記技術和蛋白質層析技術結合的免疫檢測技術[6]。其原理為：將各種已知反應試劑分點固定在層析試紙條上，檢測樣品加在試紙條的一端，使其通過毛細管作用在層析試紙條上泳動，樣本中的檢測物與層析試紙條中的反應試劑發生特異性結合反應，形成的復合物被富集或固定在層析試紙條上的特定區域（檢測帶和質控帶），通過標記免疫技術顯色[7]。具有操作方便和不需要任何儀器、體積小、易于判斷、靈敏度高、特異性好以及速度快等特點[8]。如今該技術已廣泛應用于動物檢疫工作中，如豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征和豬細小病毒病等傳染病的病原微生物抗原和抗體檢測，也可用于一些違禁和超量使用激素殘留的檢測[9]。

目前，PCV2的診斷方法主要為PCR、免疫組化、原位雜交、免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）和間接免疫熒光（IIF），這些方法主要用于檢測抗原。PCV2的抗體檢測主要手段為酶聯免疫吸附試驗（ELISA）等，ELISA包括競爭ELISA、間接ELISA和抗原捕獲ELISA等。IIF和IPMA較為經典，但對操作要求很高，不便于大量樣品的檢測，ELISA操作簡單可靠，特異性好，但需要借助昂貴的儀器[10]。

本次試驗將兔抗SPA IgG和純化豬圓環病毒抗原表位肽作為質控帶和檢測帶標記于硝酸纖維素膜上，并與樣品墊、金標墊和吸水紙組裝成免疫層析檢測試紙條。經驗證，該試紙條不同批次間和同一批次內重復性較好，具有較好的靈敏度、特異性和穩定性，能夠準確檢測豬血清樣品中的抗體水平，可以進一步評價豬圓環病毒病疫苗的免疫效果。將自制試紙條與市售試紙條進行對比較，自制試紙條的檢測結果明顯好于市售試紙條。

參考文獻：（10篇，略）