醬香型白酒中生物活性物質抗幽門螺桿菌作用評價

羅強 劉杰 劉志剛

摘 要：目的：評價醬香型白酒中生物活性物質（Bio-active compounds， BAC）抗幽門螺桿菌（Helicobacter pylori， Hp）活性及潛在的作用機制。方法：BAC處理Hp菌液，觀察Hp的活性及形態變化。RT-PCR分析BAC對Hp基因及相關毒力蛋白的表達影響。檢測BAC處理Hp對胃黏膜上皮細胞GES-1活性、細胞凋亡的影響。結果：BAC可抑制Hp生長，但Hp形態未見明顯改變;BAC可抑制Hp外膜蛋白基因（BabA）和毒力基因（CagA和VacA）的表達;抑制毒力蛋白（CagA和VacA）的表達;BAC可抑制Hp所致的GES-1細胞活性降低及細胞凋亡（p<0.05）。結論：BAC對Hp有一定的抑制作用，可通過降低Hp外膜蛋白基因（BabA）和毒力基因（CagA和VacA）及毒性蛋白（CagA和VacA）的表達抑制Hp對胃上皮細胞的損傷。

關鍵詞：醬香型白酒;幽門螺桿菌;外膜蛋白;毒力蛋白

Abstract：Objective： To evaluate the anti-helicobacter pylori （Hp） potency and mechanism of bio-active compounds （BAC） in Maotai flavor liquor. Methods： The activity and the morphological changes of Hp were observed after the co-culture with BAC. RT-PCR was used to evaluate the effect of BAC on the expression of Bab A， CagA and VacA genes. The effect of Hp on the cell viability and apoptosis of gastric mucosal epithelial GES-1 cells was evaluated with CCK8 method and flow cytometry. Results： BAC inhibits the growth of Hp， and inhibits the expression of Bab A， CagA and VacA genes; BAC also attenuates the expression of CagA and VacA proteins; BAC significantly inhibits the decrease of cell viability and cell apoptosis of GES-1 cells induced by Hp infection （p<0.05）. Conclusion： BAC can attenuate Hp induced gastric epithelial cells apoptosis and cell viability decrease by inhibiting the Bab A， Cag A and Vac A expressions.

Key words：Maotai flavor liquor; Helicobacter pylori; CagA; VacA

中圖分類號：TS262.3

醬香型白酒是我國重要的白酒香型之一，具有與其他香型的白酒所不同的氣味與口感。醬香型白酒的生產工藝復雜、耗時長、產量低，但其具有的獨特香味受到人們的喜愛。文獻報到，通過2D-GC-MS技術檢測發現，醬香型白酒中至少含有500多種化合物[1]。眾所周知，過量飲酒會導致肝臟疾病，但研究發現，適量飲用醬香型白酒未對肝臟造成損傷，推測是醬香型白酒具有的獨特的化學成分起到了一定的減輕酒精對肝臟的損傷作用[2]。

世界范圍內有超過50%的人群感染過幽門螺桿菌（Helicobacter pylori， Hp），而Hp感染會引起一系列諸如胃黏膜炎癥、胃癌等的胃部疾病[3-4]。Hp對人胃黏膜的黏附在其定植和致病中起著關鍵作用，Hp粘附定植過程是根治Hp感染的重要靶點[5]。迄今為止，Hp感染的最好的治療方案依然是使用抗生素，但Hp現已顯示出對大部分抗生素的耐藥性，同時抗生素的使用會引起一系列的副作用[6]。

研究表明，乙醇攝入與Hp感染具有一定的關系，而醬香型白酒中除乙醇外富含醛類物質（肉桂醛、辛醛、3-呋喃甲醛，2-噻吩甲醛等）[1]，這些醛類物質（Aldehydes， ALDs）是否具有抑制Hp感染的作用的相關報道很少。因此，本文將醬香型白酒中的生物活性物質及醛類化合物體外抗Hp活性及降低Hp對胃黏膜上皮細胞損傷活性進行評價，并對潛在的機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Hp標準菌株為Sydney Strain 1（SS1）H.pylori標準菌株，深圳大學醫學院病原微生物系惠贈。胃上皮GES-1細胞株（ATCC，美國），胎牛血清（FBS）（Hyclone公司，美國），青-鏈霉素（HyClone公司，美國），PBS（廣州瑞舒生物科技有限公司，中國），RPMI 1640培養基（HyClone公司，美國），NO、ROS、IL-8、IL-1β、IL-6等試劑盒均購于碧云天生物科技有限公司，CCK-8試劑（同仁公司，日本），Cag A和VacA抗體（Santa Cruz Biotechnology公司，美國），哥倫比亞瓊脂、布氏肉湯（Oxoid，英國），RPMI 1640（Hyclone，美國）。醬香型白酒（Moutai-flavour liquor，MTL）（購于貴州茅臺集團，貴州）。醬香型白酒中生物活性成分（Bio-active compounds in Moutai-flavour liquor， BAC）參考文獻方法提取獲得。醬香型白酒中醛類化合物（Aldehydes reported in Moutai flavour liquor， ALDs），標準品購于阿拉丁試劑有限公司[7]。

1.2 儀器

三菱C-31厭氧培養盒（三菱，日本）;恒溫培養箱、超凈化工作臺（上海實驗儀器廠）;超凈工作臺（SW-CJ-IC型，蘇州）;CO2培養箱（INCO2108型，Memmert，德國）;酶標儀（TECAN infinite M200多功能酶標儀，德國）;低溫高速離心機（2K15型，Sigma公司，美國）;PCR擴增儀（Bio-Rad PCR儀T100，美國）。

1.3 方法

1.3.1 ALD細胞毒性檢測

GES-1細胞接種于96孔板中（5 000 cells/well），濃度為2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.064、0.032及0.016 mg·mL-1的BAC、MTL、乙醇（Ethanol）及ALDs溶液加入96孔板中，培養24、48 h，CCK-8法檢測細胞活力。

1.3.2 體外抑菌實驗

將凍存的Hp復蘇，接種于哥倫比亞瓊脂固體培養基，置于37 ℃微需氧環境（體積分數為5%的O2，體積分數為10%的CO2，體積分數為85%的N2）中培養。72 h后轉至布氏肉湯液體培養基，置于37 ℃微需氧環境（體積分數為0.05的O2，體積分數為0.10的CO2，體積分數為0.85的N2），在100 r·min-1的搖床上振蕩，擴大培養。取用Hp時，將培養3 d的Hp菌株挑起一部分，用無菌生理鹽水洗下后，配成布氏肉湯菌懸液，再用標準比濁管比濁，校正菌液濃度，使其菌液濃度相當于1×108 cfu·mL-1[8]。

用PBS作為溶劑溶解BAC、MTL、Ethanol及ALDs至終濃度為0.064 mg·mL-1。將培養的Hp菌液用PBS重懸至1×107 CFU·mL-1，取0.1 mL Hp的PBS混懸液加入配制好的BAC、MTL、Ethanol及ALDs溶液中，37 ℃振蕩搖菌60 min。將振蕩后的Hp菌液用PBS稀釋10倍，取0.10 mL涂于哥倫比亞固體培養板上培養72 h，觀察Hp生長情況，統計菌落數。

1.3.3 RT-PCR檢測Hp毒力基因表達的變化

用PBS作為溶劑溶解BAC、MTL、Ethanol及ALD-22至終濃度為0.064 mg·mL-1。將培養的Hp菌液用PBS重懸至1×107 CFU·mL-1，取0.1 mL Hp的PBS混懸液加入配制好的BAC、MTL、Ethanol及ALDs溶液中，37 ℃振蕩微氧孵育24 h，離心棄上清，用PBS沖洗3次后，使用RNA prep pure Cell/Bacteria Kit （TianGen公司，中國）分離總RNA[9]。cDNA的合成按試劑盒（SYBR@PrimeScript TM RT-PCR Kit）操作說明進行。引物如表1所示。

1.3.4 Western blotting檢測

用PBS作為溶劑溶解BAC、MTL、Ethanol及ALD-22至終濃度為0.064 mg·mL-1。將培養的Hp菌液用PBS重懸至1×107 CFU·mL-1，取0.1 mL Hp的PBS混懸液加入配制好的BAC、MTL、Ethanol及ALD-22溶液中，37 ℃振蕩微氧孵育24 h，離心棄上清，用PBS沖洗3次后，按細菌蛋白提取試劑盒（Solarbio公司，中國）說明提取細菌總蛋白，Western blotting檢測細胞毒素A（Cag A）和空泡毒素A（Vac A）的蛋白表達情況[10]。

1.3.5 細胞活性及凋亡的檢測

PBS作為溶劑溶解BAC、MTL、Ethanol及ALD-22至終濃度為0.064 mg·mL-1。將培養的Hp菌液用PBS重懸至1×107 CFU·mL-1，取0.1 mL Hp的PBS混懸液加入配制好的BAC、MTL、Ethanol及ALD-22溶液中，37 ℃振蕩搖菌60 min。收集細菌，PBS洗2次，調節細菌終濃度為1×108 CFU。1×105 cells/mL胃上皮GES-1細胞鋪于6孔板中培養24 h。不做處理設為空白對照組（Control）;加入Hp為Hp損傷組（Hp）;加入BAC處理的Hp為BAC組（BAC）;加入MTL處理的Hp為MTL組（MTL）;加入Ethanol處理的Hp為Ethanol組（Ethanol）;加入ALD-22處理的Hp為ALD-22組（ALD-22）;使Hp與GES-1細胞比例為100-1，GSE-1細胞培養48 h后，收集細胞，PBS洗滌：①CCK8方法檢測細胞活性。②收集包括上清液漂浮細胞在內的全部細胞，1 000 r·min-1離心5 min，用預冷的PBS洗2次，按Annexin V-FITC/PI試劑盒使用說明流式細胞術檢測細胞凋亡情況。③ELISA試劑盒檢測細胞中NO、ROS、IL-8、IL-1β、IL-6含量。

1.4 數據處理

所有數據采用GraphPad Prism 8軟件進行統計。

p<0.05定為具有顯著性差異，結果均以Mean±SEM表示;對樣本先進行方差齊性檢驗，方差齊時，用One-Way ANOVA檢驗，并進行組間的多重比較;方差不齊時，用非參數秩和檢驗，先用Kruskal-WallisHtest比較總的差異，再用Mann-Whitney U進行兩組之間比較。

2 結果與分析

2.1 BAC對GES-1細胞的毒性作用

為了避免BAC及ALDs等對細胞活性造成的影響。因此，通過CCK-8方法檢測了不同濃度的BAC、MTL、Ethanol及ALDs對GES-1細胞活性的影響。實驗結果顯示，當BAC、MTL、Ethanol及ALDs濃度低于0.064 mg·mL-1時，與空白對照組相比，細胞活性均無顯著性差異（24，48 h，p>0.05），說明GES-1細胞未受到顯著的損傷。基于此，接下來的實驗，BAC、MTL、Ethanol及ALDs的濃度設置為0.064 mg·mL-1。

2.2 BAC抑制Hp菌落形成

實驗結果顯示，空白組Hp菌落生長良好，而BAC、MTL、Ethanol及ALDs處理后的Hp菌液轉移至哥倫比亞固體培養基繼續培養后Hp菌落數目有不同程度的減少（表2）。

其中，BAC、MTL及Ethanol組Hp菌落數為21.2、26.3、28.4個，是空白對照組（35.8個）的59.2%（p<0.05），73.4%（p<0.05），79.3%（p<0.05）。說明BAC、MTL、Ethanol處理對Hp的生長具有一定的抑制作用。此外，ALD-22（2-噻吩甲醛）對Hp生長抑制作用最強烈，ALD-22組Hp菌落數為20.7個菌落，是空白對照組的57.8%，Hp生長受到ALD-22顯著抑制。

2.3 BAC抑制Hp對GES-1細胞的損傷

Hp感染損傷胃黏膜細胞會誘發胃黏膜炎癥、胃癌等，因此，檢測了BAC處理能否降低Hp對GES-1細胞的損傷能力。實驗結果如圖1所示，與Control組相比，Hp組中細胞活力下降13.7%（#p<0.05）;而與Hp組相比，BAC、MTL、Ethanol及ALD-22實驗組中細胞活力提高8.73%（p<0.05），4.22%，3.16%，7.34%（p<0.05）。推測Hp感染GES-1細胞會導致細胞損傷，細胞活力降低;而BAC、MTL、Ethanol及ALD-22預處理Hp會降低Hp感染GES-1細胞的能力。

細胞凋亡實驗結果如圖2所示，與空白對照組（7.21±0.54）%比較，Hp組GES-1細胞凋亡明顯增加（16.9±1.31）%;而相比與Hp組，BAC、MTL、Ethanol及ALD-22組細胞凋亡率為[（9.96±0.99）%、（11.4±1.17）%、（13.6±1.32）%、（7.99±0.65）%]，下降6.94%（p<0.05）、5.50%、3.30%及8.91%（p<0.05），其中BAC及ALD-22對Hp感染所致的GES-1細胞凋亡有明顯抑制作用。

2.4 BAC抑制Hp感染誘發的GES-1細胞炎性細胞因子分泌

研究報道，Hp感染會損傷胃黏膜細胞，誘發炎性細胞因子分泌[11]。因此，檢測了Hp感染對GES-1細胞中NO、ROS及IL-8、IL-1β、IL-6等炎性細胞因子分泌的影響。

實驗結果如圖3所示，為便于比較，將Control組中NO、ROS、IL-8、IL-1β、IL-6的含量設為1。與Control組比較，Hp感染使GES-1細胞中NO、ROS、IL-8、IL-1β、IL-6分泌增加338%（p<0.05）、511%（p<0.05）、202%（p<0.05）、351%（p<0.05）及288%（p<0.05），說明Hp感染誘發GES-1細胞炎性因子分泌、氧化應激，進而造成細胞損傷，使細胞活力降低、凋亡。而相比于Hp組，BAC組中NO、ROS、IL-8、IL-1β、IL-6分泌降低28.9%、40.1%、37.4%、18.8%及43.6%;ALD-22組中NO、ROS、IL-8、IL-1β、IL-6分泌降低23.3%、36.4%、41.6%、40.4%及41.5%;說明BAC、ALD-22預處理Hp降低了其損傷GES-1細胞的能力，使GES-1炎性因子分泌減少、氧化應激減弱。而MTL及Ethanol中NO、ROS、IL-8、IL-1β、IL-6含量變化不明顯，推測MTL及Ethanol處理未能顯著抑制Hp感染GES-1細胞的能力。

2.5 BAC抑制Hp毒力基因及蛋白的表達

BabA是Hp外膜蛋白基因，可特異性結合宿主細胞受體，賦予Hp持久定植能力;高毒力的Hp菌株具有細胞毒素相關基因（Cag A），參與Cag A轉運和宿主的炎癥反應[12];空泡細胞毒素A（Vac A）能夠破壞細胞內吞作用、抑制免疫細胞導致免疫耐受和慢性感染等[13]。

通過RT-PCR檢測BAC、MTL、Ethanol及ALD-22對Hp Bab A、Cag A及Vac A基因表達影響，結果如圖4所示。BAC、MTL、Ethanol及ALD-22能夠抑制Hp中外膜蛋白基因Bab A、細胞毒素基因A（Cag A）和空泡毒素基因A（Vac A）的轉錄。其中，ALD-22及BAC對Bab A、Cag A及Vac A基因表達抑制能力高于MTL及Ethanol組。相比于Hp空白對照組，ALD-22作用后，Bab A、Cag A及Vac A基因表達下降44.1%（p<0.05），68.7%（p<0.05），70.6%（p<0.05）;而BAC作用后，Bab A、Cag A及Vac A基因表達下降31%（p<0.05），71%（p<0.05），73%（p<0.05）。Bab A、Cag A及Vac A編碼的蛋白能夠誘發炎癥導致細胞損傷等，因此推測，BAC、ALD-22可通過抑制Hp相關基因的表達，減少Hp對GSE-1的定植及損傷。

Western Blotting進一步分析Hp中細胞毒素A（Cag A）和空泡毒素A（Vac A）的表達，結果如圖5所示，BAC、ALD-22能夠顯著降低Hp中Cag A和Vac A的表達，與RT-PCR結果（圖4）類似。據推測，BAC、ALD-22可能是通過抑制Hp中相關毒力基因的轉錄及毒力蛋白的表達，從而抑制Hp對胃上皮細胞的損傷。

3 討論與結論

胃上皮細胞是胃腸道黏膜機械屏障的重要組成部分，而Hp的遷移與胃腸道黏膜通透性有著密切的關系。Hp感染人體首先是通過表達Bab A等外膜蛋白黏附在胃腸道黏膜細胞上，再通過表達Vac A和Cag A等蛋白誘發炎癥和細胞損傷，進而增加胃腸道黏膜通透性，利于其遷移。本研究表明，醬香型白酒中的生物活性物質可抑制Hp對GSE-1細胞的黏附及因Hp感染造成的細胞活力降低及凋亡。進一步研究表明醬香型白酒中的生物活性物質（如醛類化合物）可能是通過抑制Hp相關毒力基因Bab A、Vac A和Cag A的轉錄，及Vac A、Cag A蛋白的表達發揮作用的。此外，大量研究顯示酗酒會損傷胃腸道黏膜，醬香型白酒中的生物活性物質雖具有抑制Hp對胃粘膜細胞損傷的活性，但仍不建議酗酒。

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