pH響應的銅-大黃素脂質體的制備及其體外釋放研究

陳 靜

（南京中醫藥大學翰林學院，江蘇泰州225300）

0 引言

大黃素（Emodin，EM）是一種蒽醌的衍生物，是大黃的有效成分之一。大黃素的藥理作用廣泛，研究發現其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及調節胃腸功能的作用，同時還具有止咳、利尿等作用，且也能夠改善心血管系統。但由于其水溶性差、生物利用度低等問題，限制了其在臨床上的廣泛運用［1-3］。pH 響應型的遞藥系統是根據腫瘤部位的酸性環境而設計的。利用大黃素的富電子基團與外層缺點子的金屬離子形成配位共價鍵，當環境呈現酸性時，氫質子與金屬離子競爭，使得大黃素-金屬離子配位鍵斷裂，從而實現大黃素的藥物釋放［4］。這種大黃素-金屬離子的配位鍵，不僅連接了藥物，實現藥物的穩定遞送，同時使得藥物的釋放具有環境響應性，從而降低了藥物在腫瘤治療過程的毒副作用，實現靶向給藥。

1 材料與儀器

1.1 材料

大黃素（純度≥98.5%，上海源葉生物科技有限公司），大豆磷脂（上海胎位藥業有限公司），膽固醇（國藥集團化學試劑有限公司），乙酸銅（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

RE-2000A 型旋轉蒸發儀，鞏義市予華儀器責任有限公司；Waters 2695 高效液相色譜儀，美國Waters公司；Hedera ODS-2 色譜柱，江蘇漢邦科技有限公司；CL21 R 型高速離心機，德國ThermoFisher 公司；HY-45氣浴恒溫生物搖床，江蘇金壇市金城國盛實驗儀器廠。

2 方法與結果

2.1 分析方法的建立

2.1.1 色譜條件

采用HPLC-UV 測定大黃素。色譜柱為Hedera ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1%磷酸水（70∶30）；流速為1 mL/min；檢測波長為437 nm，進樣量10 μm；柱溫為30 ℃。

2.1.2 線性關系考察

精密稱取大黃素原料藥9.92 mg 于100 mL 容量瓶中，加甲醇定容，配置成99.20 μg/mL的大黃素標準溶液。精密吸取標準溶液，用流動相進行稀釋，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定。以大黃素峰面積（A）為縱坐標、濃度（C，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸。在0.20～59.52 μg/mL 內的線性關系良好，標準曲線為y=63 660x+1 571.9，r=0.999 9。

2.1.3 精密度試驗

取標準溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，連續進樣6次，考察儀器精密度。根據峰面積結果計算大黃素濃度，并計算出大黃素精密度RSD 為1.32%，說明儀器精密度良好。

2.1.4 重復性試驗

取銅-大黃素脂質體100 μL，加入850 μL甲醇破乳，加入50 μL 2%磷酸調pH 至酸性，渦旋30 s，適量甲醇稀釋，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，平行操作6 次。根據峰面積結果，計算大黃素的含量，并計算出大黃素重復性RSD為1.75%，說明此處理方法重復性良好。

2.1.5 穩定性試驗

取銅-大黃素脂質體150 μL，加入850 μL甲醇破乳，加入50 μL 2%磷酸調pH 至酸性，渦旋30 s，適量甲醇稀釋，按“2.1.1”項下色譜條件，分別于0，2，4，8，12，24 h 進樣。根據峰面積結果，計算24 h 內大黃素含量變化，并計算出大黃素穩定性RSD為2.17%，說明大黃素在供試品溶液中穩定性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗

精密吸取6 份已知含量的銅-大黃素脂質體100 μL，加入已知含量的標準品50 μL，加甲醇破乳，加入50 μL 2%磷酸調pH至酸性，渦旋30 s，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，加樣回收率試驗結果如表1 所示，大黃素平均回收率為98.42%，RSD為1.48%。

2.2 銅-大黃素脂質體的制備

稱取大黃素50 mg（0.185 mol）于250 mL錐形瓶，60 mL乙醇溶解，逐滴加入等物質的量的乙酸銅乙醇溶液，以氫氧化鈉調節pH 8～9，60 ℃攪拌12 h，有褐色沉淀生成。反應液抽濾，依次用無水乙醇和乙醚洗滌，得銅-大黃素配合物。稱取大豆磷脂100 mg，膽固醇10 mg，溶于30 mL 乙醇中，將5 mg 銅-大黃素配合物分散于少量的二甲亞砜中，轉移至250 mL 梨形瓶，超聲使溶解完全，40 ℃減壓蒸發2 h，得均勻薄膜，真空干燥過夜。用10 mL蒸餾水水合10 min，取水合后溶液于西林瓶，冰浴，探頭超聲10 min，超聲條件：300 W，持續超聲2 s，停1 s，即得銅-大黃素脂質體。

2.3 包封率測定

由于銅-大黃素配合物在水中的溶解度很低，故采用膜過濾法測定脂質體包封率。取制備好的銅-大黃素脂質體，過0.45 μm 濾膜，分別取過膜前后的脂質體100 μL，加入850 μL甲醇破乳，加入50 μL 2%磷酸調pH 至酸性，渦旋30 s，適量甲醇稀釋，按“2.1.1” 項下色譜條件進行測定，計算大黃素含量。

包封率（EE，%）=過膜后大黃素含量/大黃素投藥量×100%

2.4 體外釋放研究

2.4.1 緩沖溶液的配制

pH 4.5緩沖溶液的配制：精密稱取醋酸鈉18.00 g，加蒸餾水溶解，加入冰醋酸9.8 mL，混合均勻，定容至1 000 mL，即得。

pH 6.5 緩沖溶液的配制：精密稱取磷酸二氫鉀6.80 g，加水蒸餾水溶解，加入152 mL濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液，混合均勻，定容至1 000 mL，即得。

pH 7.4 緩沖溶液的配制：精密稱取磷酸二氫鉀1.36 g，加蒸餾水溶解，加入79 mL濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液，混合均勻，定容至200 mL，即得。

2.4.2 體外釋放

為研究銅-大黃素脂質體中大黃素的體外釋放行為，選擇不同pH 釋放介質進行考察。以pH 4.5 緩沖體系模擬腫瘤細胞內涵體/溶酶體（pH 4.0～6.0）環境，以pH 6.5 緩沖體系模擬腫瘤間隙（pH 6.5～7.2）環境，以pH 7.4緩沖體系模擬血液（pH 7.4）環境［5］。精密吸取銅-大黃素脂質體、大黃素混懸液，加入預處理過的3 500 Da分子量的透析袋中，置于50 mL不同pH的緩沖液中，37 ℃恒溫空氣浴搖床，不斷震蕩。分別于0，5，15，30，45 min及1，2，4，8，12，24，36 h取樣5 mL，并補足新鮮介質。

表1 脂質體中大黃素的加樣回收率

將不同釋放介質中取出的樣品過0.45 μm濾膜，按“2.1.1”項下色譜條件進行檢測。以時間為橫坐標、累計釋放度為縱坐標，繪制累計釋放度曲線，如圖1所示。

圖1 銅-大黃素脂質體在不同pH環境中的釋放（n=3）

從圖中可以看出，由于大黃素水溶性差，大黃素混懸液36 h累積釋放度只有8.12%。對于銅-大黃素脂質體，在pH 4.5 條件下，大黃素的累積釋放度達89.52%，顯著高于pH 6.5（41.03%）和pH 7.4（30.77%），表明在血漿中銅-大黃素脂質體能保持較穩定的狀態，而在到達腫瘤部位時，在腫瘤細胞內涵體/溶酶體（pH 4.0～6.0）環境下釋放藥物，實現pH響應性釋放。

3 討論

本文建立了大黃素的HPLC測定方法，實驗表明該方法專屬性好，精密度高，回收率符合要求。以薄膜分散法制備銅-大黃素脂質體，包封率達75.68%，粒徑為183.46 nm。為驗證銅-大黃素脂質體的pH響應性，以不同pH得緩沖體系模擬血漿、腫瘤細胞間隙和腫瘤細胞內涵體/溶酶體環境，結果發現，銅-大黃素脂質體在酸性環境中的釋放量明顯增加，具有pH響應性，為實現腫瘤的靶向治療奠定基礎。