復方五鳳草液上清液及混懸液對常見大鼠皮膚潰瘍的藥效學研究

高敏行，黃子慧*，何玲，程兆炎，夏慶鵬，胡鈺慧，王晨

(1.南京中醫(yī)藥大學附屬南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院，江蘇 南京；2.中國藥科大學，江蘇 南京)

0 引言

慢性皮膚潰瘍即慢性創(chuàng)面，是指無法通過正常有序而及時修復過程達到解剖和功能上完整狀態(tài)的傷口，通常由于某些不利因素的影響如感染、異物等導致創(chuàng)面愈合過程受阻，使創(chuàng)面愈合時間超過1 個月。常見的慢性創(chuàng)面有靜脈性潰瘍、壓力性潰瘍，糖尿病潰瘍、燒傷性潰瘍、結核性潰瘍等。慢性創(chuàng)面發(fā)病率高，治療難度大，治療周期長，嚴重影響患者生活及工作，給患者本人、社會及醫(yī)療機構帶來沉重負擔，已越來越為臨床所重視。

復方五鳳草液是院內(nèi)名老中醫(yī)經(jīng)驗方，為外用中藥，應用于臨床20 余年，主要用于結核性潰瘍的治療，療效確切[1]、[2]。在應用過程中，我們發(fā)現(xiàn)該藥物對其余慢性潰瘍?nèi)缦轮o脈性潰瘍、糖尿病足等同樣有治療作用。本文通過觀察復方五鳳草液上清液及混懸液對大鼠幾種皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合的影響，對其療效予以評估，為其臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SD 大鼠，180g-200g，雌雄各半，由南京市江寧區(qū)青龍山動物養(yǎng)殖場提供，許可證號：SCXK(浙)2014-0001。飼養(yǎng)條件：清潔級，22±1℃室溫下通風單籠飼養(yǎng)，晝夜自然照明，自由飲水攝食。

1.1.2 受試藥物復方五鳳草液混懸液

南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院制劑室提供；復方五鳳草液上清液：由混懸液靜置24 小時后取上層得到；復方黃柏液，山東漢方制藥，國藥準字18050812；康復新，湖南科倫制藥，國藥準字Z180609。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模及分組

1.2.1.1 下肢靜脈性潰瘍動物模型[3]

在無菌操作臺上，大鼠腹腔注射10% 水合氯醛麻醉后，剪去左側大腿根部毛發(fā)，仰臥位固定。常規(guī)無菌消毒，鋪好無菌孔巾。在左側腹股溝內(nèi)側做長約2 cm 切口，分離皮下組織和淺筋膜等，分離并暴露髂-股靜脈約1.0 cm。在其近、遠心端用動脈夾夾閉此靜脈，然后用自制無齒的12 號蚊式鉗夾閉血管，于動脈夾位置相鄰，力量為血管鉗緊1 扣，時間持續(xù)2～3s。松開蚊式鉗并進行縫合，局部皮膚常規(guī)消毒。手術后24h，將放置血管夾取出。下肢深靜脈血栓模型制備成功3d后，在無菌操作臺上，大鼠腹腔注射10% 水合氯醛麻醉，剪去左側大腿外側毛發(fā)，保證皮膚完整無破損，然后取適量脫毛膏脫毛，直徑約為3 cm。大鼠俯臥位固定，局部皮膚常規(guī)無菌消毒，鋪好無菌孔巾，用直徑1.5cm 打孔器標記造模位置，剪取標記位置全層皮膚，造成直徑1.5cm 圓形皮膚缺損，深度達皮下深筋膜。大鼠分籠單個飼養(yǎng)，籠具內(nèi)鋪墊無菌紗布，同時注意保暖，觀察大鼠皮損變化和一般行為狀態(tài)。

選取造模成功的大鼠40 只，分為模型組、復方五鳳草液上清液組、復方五鳳草液混懸液組、陽性藥組(復方黃柏液)，共4 組，每組10 只。

1.2.1.2 燒傷性潰瘍動物模型[4]

大鼠用10% 水合氯醛腹腔注射進行全身麻醉后，背部用電動剃刀剃毛暴露，將銅圓柱體模具(直徑為1.8cm)置于100.0℃電熱恒溫水浴鍋中10min，取出后立即置于大鼠背部8s，造成直徑1.8cm 的深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面。

選取造模成功的大鼠40 只，分為模型組、復方五鳳草液上清液組、復方五鳳草液混懸液組、陽性藥組(康復新液)，共4 組，每組10 只。

1.2.1.3 糖尿病潰瘍動物模型的建立[5]

大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，給予高脂高糖飼料，飼養(yǎng)4 周后，大鼠均禁食12h 后給予30mg/kg、1%STZ 溶液( 臨用前用0.1mol/L、pH4.5 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制)單次腹腔注射。注射后第3 天采用斷尾取血法測血糖，隨機血糖≥16.67mmol/L 為糖尿病造模成功；造模不成功者再次空腹12h 后注射10mg/kg、1% STZ 溶液。4 周后，大鼠以水合氯醛腹腔注射進行麻醉，背部脫毛，常規(guī)消毒，在背部制作直徑約為2.5cm 的圓形創(chuàng)面，深至皮下。

選取造模成功的大鼠40 只，分為模型組、復方五鳳草液上清液組、復方五鳳草液混懸液組、陽性藥組(復方黃柏液)，共4 組，每組10 只。

1.2.2 換藥方法

模型建立成功后，大鼠單籠飼養(yǎng)，保證大鼠日常自由飲水、攝食。自然暴露1 天，第2 天記作給藥第1 天，開始進行藥物干預，給藥周期為14 天。

模型組：只用生理鹽水清洗創(chuàng)面。

上清液組：取適當棉片，以上清液2mL 浸濕外敷，無菌紗布包裹固定，每日換藥2 次。

混懸液組：取適當棉片，以混懸液2mL 浸濕外敷，無菌紗布包裹固定，每日換藥2 次。

陽性藥組：取適當棉片，根據(jù)不同動物模型，分別以復方黃柏液2mL、康復新液2mL 浸濕外敷，無菌紗布包裹固定，每日換藥2 次。

1.2.3 觀察指標

在給藥前以及給藥結束后，對大鼠潰瘍創(chuàng)面進行相機拍照，采用Adobe Photoshop CS5 軟件圖像處理創(chuàng)面，分別得到原始創(chuàng)面面積和給藥后未愈合創(chuàng)面面積。根據(jù)以下公式計算創(chuàng)面愈合率：

創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.2.4 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 7 軟件進行分析及作圖，各組數(shù)據(jù)以±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD 檢驗。P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 下肢靜脈性潰瘍動物模型

結果表明，與模型組相比，給藥14 天以后復方黃柏液、復方五鳳草液上清液及混懸液均顯著促進了大鼠創(chuàng)面的愈合(P＜0.01；P＜0.01；P＜0.01)。與陽性藥相比，復方五鳳草液上清液、混懸液治療效果與復方黃柏液相當，無顯著性差異(P＞0.05；P＞0.05)，且上清液與混懸液之間也無顯著性差異(P＞0.05)(表1，圖1，圖2)。

表1 復方五鳳草液對大鼠下肢靜脈性潰瘍創(chuàng)面愈合率的影響(%,±s, n=9)

表1 復方五鳳草液對大鼠下肢靜脈性潰瘍創(chuàng)面愈合率的影響(%,±s, n=9)

注：與模型組比較，*P＜0.01。

組別 模型組 黃柏液組 上清液組 混懸液組創(chuàng)面愈合率 78.4±10.8 88.5±4.1* 89.3±3.3* 88.4±6.0*

圖1 復方五鳳草液對大鼠下肢靜脈性潰瘍創(chuàng)面愈合率的影響

圖2 下肢靜脈性潰瘍創(chuàng)面照片

2.2 燒傷性潰瘍動物模型

結果表明，與模型組相比，給藥14 天以后康復新液、復方五鳳草液上清液及混懸液均顯著促進了大鼠創(chuàng)面的愈合(P＜0.01；P＜0.01；P＜0.01)。與陽性藥相比，復方五鳳草液上清液、混懸液治療效果與康復新液相當，無顯著性差異(P＞0.05；P＞0.05)。與上清液相比，混懸液效果略優(yōu)，但是二者之間也無顯著性差異(P＞0.05)(表2，圖3，圖4)。

表2 復方五鳳草液對大鼠燒傷創(chuàng)面愈合率的影響(%,±s, n=9)

表2 復方五鳳草液對大鼠燒傷創(chuàng)面愈合率的影響(%,±s, n=9)

注：與模型組比較，*P＜0.01。

組別 模型組 康復新液組 上清液組 混懸液組創(chuàng)面愈合率 72.0±3.0 85.5±2.9* 91.3±1.8* 91.4±1.6*

圖3 復方五鳳草液對大鼠燒傷創(chuàng)面愈合率的影響

圖4 燒傷創(chuàng)面照片

2.3 糖尿病潰瘍動物模型

結果表明，與模型組相比，給藥14 天以后復方黃柏液以及復方五鳳草液上清液顯著促進了大鼠創(chuàng)面的愈合(P＜0.05；P＜0.05)，而復方五鳳草液混懸液對大鼠創(chuàng)面的愈合無影響(P＞0.05)。與陽性藥相比，復方五鳳草液上清液治療效果與復方黃柏液相當，二者無顯著性差異(P＞0.05)(表3，圖5，圖6)。

表3 復方五鳳草液對大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合率的影響(%,±s,n=9)

注：與模型組比較，*P＜0.05。

圖5 復方五鳳草液對大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合率的影響

圖6 糖尿病潰瘍創(chuàng)面照片

3 討論

下肢靜脈性潰瘍是因靜脈壓增高、靜脈血液回流不暢及激發(fā)作用而引起的小腿皮膚水腫、硬化和潰瘍，臨床特點是呈慢性復發(fā)性過程，常見發(fā)病部位為小腿中下段前內(nèi)側面，即足靴區(qū)，其次為內(nèi)踝、外踝和足背區(qū)；皮膚發(fā)生濕疹性變化，隨即搔抓后出現(xiàn)糜爛及潰瘍，創(chuàng)口經(jīng)久不愈。糖尿病潰瘍是由于神經(jīng)病變及不同程度末梢血管病變而導致下肢感染、潰瘍形成，其臨床特點為足部或肢體遠端局部軟組織皮膚糜爛，初為水皰或淺潰瘍，繼之潰爛深入肌腱和肌層，破壞骨質，組織壞死腐爛，形成膿腔和竇道，排出穢臭分泌物，周圍呈增生性實性腫脹，以濕性壞疽為主。燒傷性潰瘍是熱液、蒸氣、高溫氣體、火焰、熾熱的金屬液體或者固體引起皮膚或黏膜損害而形成，臨床特點以局部創(chuàng)面紅斑、腫脹、疼痛、水皰、滲出、焦痂為主要表現(xiàn)。這幾種潰瘍目前臨床中較為常見，嚴重影響廣大患者的身心健康與生活質量，給國家醫(yī)療財政造成一定的負擔與壓力，所以越來越為臨床所重視。

以上幾種慢性潰瘍屬中醫(yī)“瘡瘍”范疇，其創(chuàng)面病機特點為“膿毒腐肉郁積，氣血化生不足”，即如明代李延的《醫(yī)學入門》指出：瘡口不斂，由于肌肉不生；肌肉不生，由于腐肉不去。因而可以祛腐生肌法治療。復方五鳳草液為院內(nèi)協(xié)定方，方中以五鳳草(澤漆)、白及、貓爪草為主藥，其中五鳳草[6]行水殺蟲，祛腐解毒；白及[7]斂瘡消腫，止血生肌；貓爪草[8]拔膿解毒，活血消腫。諸藥合用，共湊提膿祛腐，活血生肌之效，促進創(chuàng)面愈合。近年來，科室將復方五鳳草液用于結核性潰瘍等慢性創(chuàng)面的治療，取得了滿意的療效。本文則研究復方五鳳草液上清液及混懸液對大鼠幾種常見慢性皮膚潰瘍的治療改善作用，為其臨床應用提供實驗依據(jù)。

在下肢靜脈性潰瘍實驗中，復方五鳳草液上清液以及混懸液均能顯著促進大鼠下肢靜脈性潰瘍創(chuàng)面的愈合，二者的治療效果無顯著性差異，并且治療效果皆與陽性藥復方黃柏液相當。

在燒傷實驗中，復方五鳳草液上清液以及混懸液均能顯著促進大鼠燒傷創(chuàng)面的愈合，且混懸液治療效果略優(yōu)于上清液，但是差異并不顯著。此外，上清液、混懸液的治療效果皆與康復新液相當。

在糖尿病潰瘍實驗中，復方五鳳草液上清液顯著促進了大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面的愈合，其治療效果與復方黃柏液相當，而混懸液對大鼠創(chuàng)面的愈合幾乎無影響。值得注意的是在上一次藥效初篩實驗中，對于糖尿病潰瘍，混懸液也沒能顯示出任何治療作用，與本次實驗結果一致。

以上實驗結果表明，復方五鳳草液上清液以及混懸液均能顯著促進下肢靜脈性潰瘍和燒傷創(chuàng)面的愈合，二者的治療效果無顯著性差異，且治療效果皆與陽性藥相當，可以考慮進行進一步的機制研究。

但是對于糖尿病潰瘍，上清液能顯著促進創(chuàng)面的愈合，而混懸液幾乎沒有作用。造成這種結果的原因目前還不清楚，可能是由于相對于燒傷以及下肢靜脈性潰瘍，糖尿病潰瘍的創(chuàng)口較大，而且糖尿病大鼠身體及精神狀態(tài)較差，長時間的給予混懸液容易使混懸液中的雜質及沉淀積聚于創(chuàng)面，反而會影響有效成分的吸收，甚至影響創(chuàng)面的愈合。需要注意的是，這種療效的差異可能僅限于大鼠，在患者身上是否也存在此種情況還不清楚。

因此，對于不同的皮膚潰瘍模型，復方五鳳草液上清液與混懸液的治療效果可能有所不同，其根本原因在于上清液及混懸液不同的物質成分及理化性質。我們后續(xù)將分別對復方五鳳草液的上清液與混懸液進行深入的藥學及物質基礎研究，從而為復方五鳳草液不同劑型的開發(fā)提供依據(jù)。