延齡草甾體皂苷類成分對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的保護作用

陳林林 李中煉 萬登峰 曹文鋒 左月明 張忠立

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 1藥學(xué)院，江西 南昌 330004；2實驗動物科技中心；3江西省人民醫(yī)院)

延齡草是傳統(tǒng)名貴中藥，也是恩施土家族民間藥之一〔1〕，其味甘、性平、有小毒，具有延年益壽的功效，主治頭暈?zāi)垦！⒌驌p傷、神經(jīng)衰弱、腦震蕩后遺癥等疾病〔2〕。現(xiàn)代藥理研究具有抗氧化、抗衰老、降血壓、抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫等作用〔3，4〕。有研究發(fā)現(xiàn)，頭頂一顆珠中提取的總甾體皂苷可減輕中動脈栓塞致局灶性腦缺血大鼠組織損傷，改善神經(jīng)病理學(xué)及神經(jīng)血管單元微結(jié)構(gòu)改變，增加缺血腦區(qū)血流灌注，促進神經(jīng)功能的重塑〔5〕。本研究組前期通過改良Zea Longa線栓法建立大鼠局灶性腦缺血/再灌注(I/R)損傷模型，研究證實延齡草抗腦I/R損傷的有效部位為85%乙醇洗脫物，并從中分離得到指標性和特征性4個甾體皂苷類單體化合物。本研究探討延齡草中4個甾體皂苷類單體成分抗腦I/R損傷作用機制。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級SD雄性大鼠96只，體重240～280 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證編號為SCXK(湘)2016-0002。

1.2藥物及試劑 偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(Y2T組)、偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-〔α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)〕-β-D-吡喃葡萄糖苷(Y3T組)、偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-〔α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)〕-β-D-吡喃葡萄糖苷(Y4T組)、偏諾皂苷元(YP組)均由本實驗室自行制備(純度均大于98%)；尼莫地平片(Lot170107)購于亞寶藥業(yè)集團股份有限公司；銀杏葉片(Lot 20170320)購于南京易亨制藥有限公司。

1.3主要儀器 Thermo D-37520臺式高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技有限公司)；UV8100紫外-可見分光光度計(美國萊伯泰科有限公司)；RM2255切片機(德國Leica公司)；ELX800酶標儀(Bio Tek公司)；BX43三目Olympus顯微鏡(上海三崴醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

1.4方法

1.4.1分組及給藥 SD大鼠隨機分為12組：假手術(shù)組(Sham組)，模型組(I/R組)，尼莫地平片組10 mg/kg(Contrast 1組)，銀杏葉片組60 mg/kg(Contrast 2組)，Y2T中劑量組60 mg/kg(Y2TM組)，Y2T高劑量組90 mg/kg(Y2TH組)，Y3T中劑量組60 mg/kg(Y3TM組)，Y3T高劑量組90 mg/kg(Y3TH組)，Y4T中劑量組60 mg/kg(Y4TM組)，Y4T高劑量組90 mg/kg(Y4TH組)，偏諾皂苷元中劑量組37 mg/kg(YPM組)，偏諾皂苷元高劑量組54 mg/kg(YPH組)，連續(xù)灌胃給藥8 d，第8天灌胃1 h后，制備腦I/R模型。Sham組和I/R組用蒸餾水灌胃。

1.4.2造模 末次給藥1 h后，應(yīng)用改良Zea Longa線栓法建立大腦中動脈阻塞法(MCAO)制備局灶性腦I/R模型〔6，7〕。大鼠全麻(水合氯醛腹腔注射)后固定，頸中部縱向切開皮膚2 cm，鈍性分離皮下組織與肌肉，暴露右側(cè)頸總動脈(CCA)，小心剪開包裹CCA及迷走神經(jīng)的鞘膜，并繼續(xù)分離右頸內(nèi)動脈(ICA)及右頸外動脈(ECA)。在CCA 近心端、遠心端分別穿線，近心端系緊，結(jié)扎CCA，遠心端系一松結(jié)備用。分離ECA、ICA，并在ECA穿線結(jié)扎，用動脈夾夾閉ICA。距CCA分叉處約4 mm剪一“V”形小口，插入栓線，用備用的絲線打一正結(jié)，松開ICA 的動脈夾，然后調(diào)整線栓角度，使線栓弧度水平向外，輕輕將線栓送入顱內(nèi)，輕緩?fù)七M直至感覺到阻力，插入深度在18.0～20.0 mm，即完成了大腦中動脈阻塞所致大腦局灶性腦缺血的制備。分層縫合肌肉與皮膚(部分栓線留體外)。于2 h 后輕輕地向外拔出栓線1 cm左右至略感阻力即可進行再灌注4 h，剪斷皮膚外露的栓線。Sham組不插入線栓，其余同I/R組。

1.5指標測定

1.5.1一般情況觀察 實驗過程中每天觀察并記錄飲食、飲水情況及精神狀態(tài)。

1.5.2神經(jīng)功能評分 參照Zea Longa 5分制評分標準對大鼠神經(jīng)功能進行盲評：0分：沒有神經(jīng)功能缺損；1分：對側(cè)前爪不能完全伸展，為對側(cè)前肢內(nèi)收、屈曲；2分：行走時大鼠向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈、劃圈，將大鼠置于地面時，推動患側(cè)肩向?qū)?cè)移動時，阻力明顯降低；3分：行走時大鼠身體向左側(cè)(癱瘓側(cè))傾倒；4分：意識喪失，不能自發(fā)行走；5分：死亡。評分在1～3者，確定大鼠造模成功，納入I/R組。

1.5.3大鼠腦指數(shù)的測定 腦I/R評分后，大鼠麻醉，取出全腦，生理鹽水沖洗，去除嗅球、小腦及腦干，濾紙吸干水分，稱重。腦指數(shù)=腦濕重(g)/體重(100 g)，可反映血腦屏障結(jié)構(gòu)損傷的情況。

1.5.4大鼠腦梗死體積的測定 將腦組織稱重后，立即放置-20℃冰箱中快速冷凍20 min，用手術(shù)刀片由前向后行冠狀位切片，共5片，每片約 2 mm厚，置 2% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液中，37℃避光染色30 min，15 min后翻面。經(jīng)染色正常腦組織呈玫瑰紅色，而梗死區(qū)呈蒼白色，界限清晰。染色后再用4%多聚甲醛固定30 min，拍照，采用Image Pro Plus6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對腦梗灶體積進行分析，使用計數(shù)與測量工具計算梗死區(qū)體積及占整個腦體積的比例。

1.5.5大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)和血清生化指標的測定 大鼠行心臟采血，離心后取血清，測定血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷氨酸、一氧化氮(NO)和Ca2+的含量；部分大鼠取腦組織，測定大鼠腦組織炎癥因子白細胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α含量，觀察海馬CA1區(qū)和皮質(zhì)層病理學(xué)改變。

1.6統(tǒng)計方法 采用SPSS13.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1延齡草甾體皂苷單體對腦I/R損傷大鼠神經(jīng)功能評分的影響 Sham組無神經(jīng)功能缺損，I/R組神經(jīng)功能缺損明顯；Contrast 1組、Contrast 2組、Y2TM組、Y2TH組、Y3TH組、Y3TM組、YPM組、T4TH組神經(jīng)功能缺損評分均明顯低于I/R組(P<0.05，P<0.01)。YPH組、Y4TM組神經(jīng)功能缺損與I/R組無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.2延齡草甾體皂苷單體對腦I/R損傷大鼠腦指數(shù)的影響 I/R組大鼠腦指數(shù)明顯高于Sham組，Contrast 2組、Y2TM組、Y3TM組、Y3TH組、Y4TM組及Y4TH組大鼠腦指數(shù)均明顯低于I/R組(P<0.05，P<0.01)；其余各組大鼠腦指數(shù)改善不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3延齡草甾體皂苷單體對I/R損傷大鼠腦梗死體積的影響 TTC染色結(jié)果顯示(正常腦組織呈玫瑰紅色，而梗死組織呈蒼白色，界限清晰)，Sham組未見梗死灶，I/R組出現(xiàn)明顯梗死灶。Contrast 1組、Contrast 2組、Y2TH組、Y2TM組、Y3TH組、Y3TM組、Y4TM組、Y4TH組、YPM組、YPH組梗死灶體積明顯小于I/R組(P<0.01，P<0.05)。見表1，圖1。

表1 延齡草甾體皂苷單體對腦I/R損傷大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦指數(shù)及腦梗死體積的影響分)

圖1 延齡草甾體皂苷單體對腦I/R損傷大鼠腦梗死TTC染色結(jié)果

2.4延齡草甾體皂苷單體對腦I/R損傷大鼠血清SOD、MDA和谷氨酸含量的影響 I/R組血清SOD活性明顯低于Sham組，MDA和谷氨酸含量明顯高于Sham組(均P<0.01)；與I/R組比較，Contrast 1組、Contrast 2組、Y2TM組、Y2TH組、Y3TM組、Y3TH組、Y4TM組、Y4TH組、YPM組、YPH組均能使血清SOD活性升高，而使MDA和谷氨酸含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 延齡草甾體皂苷單體對腦I/R損傷大鼠血清SOD、MDA和谷氨酸含量的影響

2.5延齡草甾體皂苷單體對腦I/R損傷大鼠血清NO、Ca2+含量的影響 與Sham組相比，I/R組大鼠血清中NO和Ca2+含量明顯升高(P<0.01)；與I/R組比較，Contrast 1組、Contrast 2組、Y2TM組、Y2TH組、Y3TM組、Y3TH組、Y4TM組、Y4TH組、YPM組、YPH組均能使血清NO和Ca2+含量顯著降低(P<0.05,P<0.01)。見表3。

表3 延齡草甾體皂苷單體對腦I/R損傷大鼠血清NO和Ca2+含量的影響

2.6延齡草甾體皂苷單體對腦I/R損傷大鼠腦組織海馬區(qū)和皮質(zhì)層區(qū)病理損傷的影響 常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察腦缺血病理學(xué)變化，Sham組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)層區(qū)神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)正常。I/R組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)層區(qū)神經(jīng)細胞排列紊亂，細胞形態(tài)不完整、腫脹，大量神經(jīng)元丟失、死亡，部分細胞核溶解、固縮。各給藥組(尤其是Y2TH組、Y3TH組、Y4TH組)大鼠腦組織海馬區(qū)和皮質(zhì)層區(qū)神經(jīng)元數(shù)量增多，排列較整齊，細胞結(jié)構(gòu)接近正常，核固縮、壞死明顯減少，說明各給藥組對腦I/R損傷的神經(jīng)細胞損傷均有顯著改善和保護作用。見圖2。

圖2 延齡草甾體皂苷單體對腦I/R損傷大鼠海馬及皮質(zhì)層區(qū)病理學(xué)變化(HE，×400)

2.7延齡草甾體皂苷單體對腦I/R損傷大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α的影響 在進行腦I/R損傷造模后，與Sham組比較，I/R組腦組織IL-6、IL-1β和TNF-α含量明顯升高(P<0.01)；與I/R組比較，各給藥組腦組織IL-6、IL-1β和TNF-α含量均顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見表4。

表4 延齡草甾體皂苷單體對腦I/R損傷大鼠腦組織IL-6、IL-β和TNF-α含量的影響

3 討 論

腦I/R損傷的病理生理機制極為復(fù)雜，主要與自由基過度形成、興奮性氨基酸毒性作用、細胞內(nèi)鈣超載、炎性反應(yīng)等有關(guān)，同時伴有神經(jīng)功能受損、學(xué)習(xí)記憶障礙和腦梗死灶形成等〔8〕。祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥在治療缺血性腦血管病方面有較大潛力，尤其是中藥單體的生物活性研究得到廣泛開展。已有研究證實延齡草總甾體皂苷具有改善腦I/R損傷的藥理作用〔5〕。

線栓法制備MCAO動物模型具有不開顱、效果可靠，能準確地控制缺血及再灌注時間，對動物自身的生理功能損傷小、術(shù)后生存率高等特點。神經(jīng)功能評分是評價治療腦缺血藥物療效的一項指標，可從運動功能的角度評價腦I/R損傷的程度〔9〕。TTC染色法常用于評估組織的梗死體積〔10〕。本研究結(jié)果提示，延齡草中4個甾體皂苷類單體成分均能顯著降低腦I/R大鼠翻正反射恢復(fù)時間、減輕I/R部位的病理損傷，降低腦組織含水量、減少腦梗死體積，減緩腦組織的損傷。

氧化應(yīng)激是指機體中活性氧(ROS)產(chǎn)生過多或者清除能力下降，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的平衡一旦受到破壞，會導(dǎo)致機體發(fā)生潛在的病理性損傷〔11〕。研究發(fā)現(xiàn)〔12〕，腦I/R損傷時，機體可產(chǎn)生大量ROS，這些ROS不能被內(nèi)源性的抗氧化系統(tǒng)及時清除，導(dǎo)致DNA氧化，引起膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等一系列的連鎖反應(yīng)。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，可以改變細胞膜的通透性和流動性，是研究抗氧化能力的常用指標。SOD是自由基清除劑，是對抗ROS過多產(chǎn)生的兩種主要酶，其活力能夠間接反映機體清除氧自由基的能力〔13〕。腦缺血后引起突觸末梢谷氨酸釋放，激活突觸后膜親離子受體，導(dǎo)致膜去極化，膜興奮性增高，陽離子通道開放，引起Ca2+大量內(nèi)流，導(dǎo)致細胞內(nèi)Ca2+超載，啟動一系列酶引起細胞損傷，其中活化的一氧化氮合酶可催化產(chǎn)生過量NO，與超氧陰離子形成過氧亞硝酸根離子和羥基，損傷線粒體膜，致使離子平衡紊亂〔14〕，引起神經(jīng)元的損傷。本研究提示延齡草中4個甾體皂苷類單體成分能明顯升高MCAO大鼠血清中SOD活性，降低MDA含量，抑制谷氨酸的合成和分泌，減少NO和Ca2+的釋放，來減弱機體的氧化損傷程度，增加機體的抗氧化應(yīng)激能力，減少神經(jīng)元的損傷。

促炎性細胞因子是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的重要炎性介質(zhì)。腦缺血可刺激內(nèi)皮細胞和白細胞中黏附分子的表達，產(chǎn)生大量的促炎性細胞因子，從而導(dǎo)致白細胞的黏附及向大腦軟組織外滲〔15〕。本研究結(jié)果表明延齡草中4個甾體皂苷類單體成分能使MCAO大鼠抑制激活小膠質(zhì)細胞釋放 TNF-α、IL-1β、IL-6 等多種炎癥因子，提示其對腦I/R損傷的保護作用與其抗炎作用有關(guān)。