miR-656-3p靶向ATP10A基因調控阿爾茨海默病模型細胞凋亡的分子機制

朱竹君 祁英杰 于明

(江蘇大學 1附屬金壇醫院神經內科，江蘇 常州 213200；2附屬醫院神經內科)

阿爾茨海默病(AD)又稱老年癡呆，其發生、發展及病理改變過程與環境、遺傳因素等緊密相關〔1,2〕，但其病理演進過程的分子機制尚不明確。AD是一種神經退行性疾病，主要特征為認知功能障礙、記憶損害等〔3,4〕。微小RNAs(miRNA/miR)是一類長18～25 nt、廣泛表達于哺乳動物中的非編碼小RNA分子，具有高度保守性，含有與下游靶基因miR的3′非翻譯區(UTR)互補的堿基序列，可抑制或降解靶基因miR，從而調控轉錄后水平。研究表明，miR異常表達與腫瘤、神經系統疾病等密切相關〔5,6〕。多種miR在AD演進過程中表達量異常，參與AD發生發展過程〔7,8〕。miR-656-3p在AD演進過程中表達量異常〔9〕，調控其發生發展過程，但miR-656-3p具體的作用機制尚不完全清楚。本研究旨在探討miR-656-3p在AD中作用及相關機制，為進一步闡明AD發生發展的分子機制提供理論基礎及臨床新藥的研發提供潛在分子靶點。

1 材料與方法

1.1實驗主要試劑和儀器 SH-SY5Y細胞購自中國科學院上海細胞庫；DMEM培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司，青鏈霉素、細胞裂解液、雙熒光報告基因檢測試劑盒購自中國碧云天公司，胰酶、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、增強化學發光(ECL)試劑盒購自美國Thermo公司，Trizol試劑購自北京康為世紀生物科技有限公司，逆轉錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，噻唑藍(MTT)試劑盒、凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司，Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司，miR-656-3p 模擬物及陰性對照(NC)、anti-miR-432-5p、anti-NC及si-NC和si-ATP10A購自上海吉瑪生物有限公司，聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore公司，兔抗腺苷三磷酸酶(ATP)10A抗體，β-肌動蛋白(β-actin)抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，辣根過氧化物酶標記二抗購自武漢博士德生物科技有限公司，ATP10A野生型(ATP10A-wt)和ATP10A突變型(ATP10A-mut)熒光素酶報告載體購自廣州銳博生物有限公司。細胞培養箱購自美國Thermo公司，超凈工作臺購自上海博翎有限公司，qPCR儀、PCR儀、酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2細胞的培養和分組 SH-SY5Y細胞培養于DMEM培養基，含有10%胎牛血清，放入37℃、5%CO2培養箱中，次日更換培養液，待顯微鏡下觀察到SH-SY5Y細胞長滿培養瓶底部，加入適量0.25%胰酶消化1～3 min，按1∶3比例傳代培養。選取生長狀態良好的SH-SY5Y細胞分為對照組、模型組、NC組、miR-656-3p組、anti-NC組、anti-miR-656-3p組、si-NC組、si-ATP10A組，對照組為正常培養的SH-SY5Y細胞，模型組為采用10 μmol/L的淀粉樣蛋白(Aβ25～35)誘導SH-SY5Y細胞構建的AD模型細胞，NC組、miR-656-3p組為模型組細胞分別轉染NC、miR-656-3p模擬物，anti-NC組、anti-miR-656-3p組為模型細胞分別轉染anti-NC、anti-miR-656-3p，si-NC組、si-ATP10A組為模型細胞分別轉染si-NC、si-ATP10A。

1.3MTT實驗 收集處于對數期的SH-SY5Y細胞，調整細胞密度，吸取200 μl細胞懸浮液接種至96孔板中，每孔含有1×105個SH-SY5Y細胞，將Aβ25～35濃度調整至0、5、10、20 μmol/L，分別加入各組細胞中，每孔設置3個復孔，加入含10%胎牛血清的培養基培養48 h，每孔細胞中加入20 μl無血清培養基稀釋的MTT溶液(5 mg/ml)，37℃孵育4 h，小心棄上清，每孔細胞中加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)孵育10 min，置于酶標儀中檢測每孔細胞在490 nm處吸光值(OD490 nm值)。

1.4熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR) 將細胞密度調整為1.0×103/ml接種至6孔板中，待細胞密度達60%～80%，棄去培養基，每孔細胞中加入500 μl Trizol溶液，混勻，37℃裂解10 min，提取細胞中總RNA，根據逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板，β-actin為對照，根據qPCR試劑盒說明書進行操作，反應條件設置為94℃ 3 min，94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環。實驗重復3次，采用2-ΔΔCt法進行分析目的基因的相對表達量。

1.5細胞的轉染 6孔板中每孔接種5×105個SH-SY5Y細胞，各組SH-SY5Y細胞轉染前，更換為無血清DMEM培養基，吸取5 μl陰性對照及轉染質粒分別與100 μl無血清DMEM培養基混勻，制備質粒稀釋液；5 μl Lipofectamine2000與100 μl無血清DMEM培養基混勻，制備Lipofectamine2000稀釋液；將質粒稀釋液和Lipofectamine2000稀釋液混合混勻，37℃靜置20 min，形成復合物；吸取200 μl復合物加入6孔板中各細胞中，混勻，37℃培養4～6 h，更換為含10%胎牛血清的DMEM培養基繼續培養。

1.6流式細胞術實驗 細胞濃度調整為1×105/ml接種至6孔板中，每組設置3個復孔，吸取500 μl磷脂酰結合蛋白(Annexin)Ⅴ緩沖液加入每組細胞，每組細胞中加入5 μl Annexin Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)和5 μl碘化丙啶(PI)，混勻，暗室中孵育30 min，置于流式細胞儀中檢測各組SH-SY5Y細胞的凋亡率。

1.7雙熒光素酶報告基因 通過TargetScan數據庫預測與miR-656-3p可能結合的靶基因，發現ATP10A作為本實驗的候選研究對象。將購買的ATP10A-wt和ATP10A-mut熒光素酶報告載體分別與過表達或敲低miR-656-3p共轉染入細胞，收集細胞，在多功能酶標儀中檢測每孔海腎熒光素酶的信號及螢火蟲熒光素酶信號強度，以螢火蟲熒光素酶活性作為參照，統計比值，每孔設置3個復孔，實驗重復3次。

1.8蛋白質印跡(Western印跡)實驗 收集1×107個SH-SY5Y細胞，加入500 μl放射免疫沉淀(RIPA)蛋白裂解液，冰上裂解30 min，提取細胞中總蛋白。吸取200 μl二喹啉甲酸(BCA)工作液測定目的蛋白濃度，加入適量4×蛋白上樣緩沖液，100℃加熱5 min促進蛋白質變性；根據目的蛋白分子量大小，配制不同濃度聚丙烯酰胺凝膠，置于電泳槽中，加入電泳液，吸取40 μg蛋白樣品分別加入上樣孔，恒壓80 V，電泳至樣品進入分離膠，將電壓調整至120 V，電泳至目的蛋白遷移至凝膠2/3處，停止電泳；取出攜帶目的蛋白的凝膠，割下目的條帶，蒸餾水進行清洗，剪取相同大小的聚偏氟乙烯(PVDF)膜，進行轉膜，含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉2 h；加入一抗稀釋液，4℃孵育過夜；含吐溫20三羥甲基氨基甲烷緩沖液(TBST)洗滌3次×10 min，加入辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次×10 min，加入電化學發光(ECL)液孵育，顯影、拍照，Image J軟件分析目的蛋白相對灰度，重復3次。

1.9統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗，單因素方差分析及SNK-q檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1miR-656-3p在AD模型細胞中的表達量 不同濃度Aβ25～35顯著抑制SH-SY5Y細胞的增殖(P<0.05)，具有一定的濃度依賴性，在10 μmol/L Aβ25～35作用下SH-SY5Y細胞的增殖活性變化幅度較大；與0 μmol/L組相比，miR-656-3p在不同濃度Aβ25～35作用的SH-SY5Y細胞中的表達量顯著降低(P<0.05)，其中在10 μmol/L Aβ25～35作用下SH-SY5Y細胞中變化幅度較大；miR-656-3p的表達量隨著10 μmol/L Aβ25～35作用時間的增加顯著降低，在24 h變化幅度較大。見表1。

表1 不同濃度Aβ25～35及10 μmol/L Aβ25～35作用不同時間對SH-SY5Y細胞增殖活性及miR-656-3p表達量的影響

2.2過表達miR-656-3p對AD模型細胞增殖、凋亡的影響 與對照組(1.000±0.069)相比，模型組、NC組、miR-656-3p組細胞中miR-656-3p表達量顯著降低(0.262±0.035、0.271±0.039、0.859±0.078，均P<0.05)；與模型組相比，NC組miR-656-3p的表達量無顯著影響；與NC組相比，在細胞模型中轉染miR-656-3p模擬物可顯著增加miR-656-3p的表達量(P<0.05)；模型組細胞較對照組增殖活性顯著降低、凋亡率顯著增加(P<0.05)，模型組和NC組細胞的增殖、凋亡無顯著差異；但過表達miR-656-3p較NC組顯著增加細胞的增殖活性(F組間=464.163，P組間=0.000；F時間=3 831.94，P時間=0.000；F組間×時間=157.416，P組間×時間=0.000)、降低細胞的凋亡率(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 各組細胞凋亡流式細胞檢測

表2 轉染miR-656-3p mimics對細胞增殖凋亡的影響

2.3miR-656-3p靶基因的預測和驗證 在線數據庫TargetScan預測miR-656-3p與ATP10A 3′UTR部分堿基可互補結合，提示ATP10A可能是miR-656-3p的下游靶基因；進一步通過雙熒光素酶報告基因驗證顯示，與共轉染ATP10A-wt和NC/anti-NC載體相比，共轉染ATP10A-wt和過表達miR-656-3p/anti-miR-656-3p載體顯著降低或提高SH-SY5Y細胞的雙熒光素酶活性(P<0.05)；與共轉染ATP10A-mut和NC/anti-NC載體相比，共轉染ATP10A-mut和過表達miR-656-3p/anti-miR-656-3p載體對SH-SY5Y細胞中的雙熒光素酶活性均無明顯的影響。與NC組相比，過表達miR-656-3p顯著降低ATP10A在AD細胞模型中的蛋白水平(P<0.05)；相反，下調miR-656-3p顯著增加ATP10A蛋白水平(P<0.05)。見表3和圖2。

表3 雙熒光素酶報告基因驗證miR-656-3p與ATP10A的靶向關系及蛋白表達

圖2 miR-656-3p下游靶基因的預測及過表達或下調miR-656-3p對ATP10A蛋白水平的影響

2.4下調ATP10A對AD模型細胞增殖、凋亡的影響 與0 μmol/L組相比，ATP10A蛋白在不同濃度Aβ25～35作用的SH-SY5Y細胞中的表達量顯著增加(0、5、10、20 μmol/L分別為0.126±0.009、0.228±0.013、0.569±0.042、0.731±0.051，P<0.05)；ATP10A蛋白水平隨著10 μmol/L Aβ25～35 作用時間的增加顯著增加(0、12、24、48 h分別為0.119±0.012、0.259±0.018、0.516±0.037、0.706±0.055，P<0.05)。見圖3。與si-NC組相比，下調ATP10A顯著促進細胞的增殖(F組間=1 622.468，P組間=0.000；F時間=10 751.252，P時間=0.000；F組間×時間=1 315.756，P組間×時間=0.000)，抑制其凋亡(P<0.05)，與過表達miR-656-3p具有相似的作用。見表4。

圖3 下調ATP10A對AD模型細胞增殖、凋亡的影響

表4 下調ATP10A對AD模型細胞增殖、凋亡的影響

2.5過表達miR-656-3p和ATP10A對AD模型細胞增殖、凋亡的影響 與NC組相比，miR-656-3p組及miR-656-3p+pcDNA組均顯著降低ATP10A的蛋白表達量，顯著促進細胞的增殖，顯著抑制細胞凋亡(P<0.05)；miR-656-3p+ATP10A組較miR-656-3p+pcDNA組顯著增加ATP10A蛋白的表達量，抑制細胞增殖(F組間=1 014.546，P組間=0.000；F時間=11 366.086，P時間=0.000；F時間×時間=288.583，P組間×時間=0.000)，促進細胞凋亡(P<0.05)。見圖4和表5。

1～4:NC組、miR-656-3p組、miR-656-3p+pcDNA組、miR-656-3p+ATP10A組圖4 過表達miR-656-3p和ATP10A對AD模型細胞增殖、凋亡的影響

表5 過表達miR-656-3p和ATP10A對AD模型細胞增殖、凋亡的影響

2.6下調miR-656-3p和ATP10A對AD模型細胞增殖、凋亡的影響 與anti-NC組相比，anti-miR-656-3p組及anti-miR-656-3p+si-NC組均增加ATP10A的蛋白表達量，抑制細胞的增殖，促進細胞凋亡，差異具有顯著性(P<0.05)；anti-miR-656-3p+si-ATP10A組較anti-miR-656-3p+si-NC組顯著降低ATP10A蛋白的表達量，促進細胞的增殖(F組間=1 518.042，P組間=0.000；F時間=2 168.350，P時間=0.000；F組間×時間=152.894，P組間×時間=0.000)，抑制細胞的凋亡，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表6和圖6。

表6 下調miR-656-3p和ATP10A對阿爾茨海默病模型細胞增殖、凋亡的影響

1～4:anti-NC、anti-miR-656-3p、anti-miR-656-3p+si-NC、anti-miR-656-3p+si-ATP10A圖6 下調miR-656-3p和ATP10A對阿爾茨海默病模型細胞增殖、凋亡的影響

3 討 論

miR在人類基因表達量的調控具有舉足輕重的作用，近年來的研究結果表明其表達量與多種疾病其中包括神經退行性疾病的演進密切相關。多種miR在心血管〔10,11〕、糖尿病〔12,13〕、腫瘤〔14,15〕、AD〔16〕等的表達量顯著異常。Bekris等〔17〕研究發現AD患者腦組織、腦脊液及血液中miR-15a表達量下調。miR-34a在APPswe/PSΔE9模型小鼠中表達量顯著增加，可能通過調控Bcl-2參與AD發生〔18〕。miR-124-3p可以通過靶向下調Caveolin-1表達，抑制AD細胞凋亡，降低細胞中游離鈣離子濃度，從而發揮神經保護作用，為AD防治提供新的思路和靶點〔19〕。miR-153可負調控靶基因下游信號分子糖原合成酶激酶(GSK)-3β的表達；過表達miR-153可降低細胞增殖活性，增加其凋亡水平〔20〕。上述研究結果均表明miR可通過調控下游靶基因mRNA的表達量影響AD的發生發展過程。其中，miR-656在神經膠質瘤進展過程發揮抑制作用，miR-656在神經膠質瘤組織及細胞系中的表達量顯著降低；體內和體外實驗結果顯示miR-656可抑制神經膠質瘤的惡性生長，抑制動物模型中腫瘤的生長，其作用機制主要通過調控骨形成蛋白受體(BMPR)1A參與神經膠質瘤的生長、發展〔21〕。研究發現miR-656在AD中的表達量顯著異常，提示miR-656可能參與AD發生發展過程〔9〕。

AD是人類神經系統疾病，研究樣品來源有限，病因尚不清楚，因此構建良好的研究模型具有重要的意義。AD動物模型主要有損傷型、自然衰老型、轉基因型，每一類動物模型均可在一定程度模擬AD的臨床病理特征，但均具有各自的局限性。對于探究AD分子機制的相關研究，細胞模型優于動物模型。體外培養的細胞模型具有簡單、實用的特點，因此被廣泛應用于AD神經毒性機制研究中。實驗常用的體外培養的神經細胞，經過Aβ AD進行誘導構建細胞模型最常見，是AD較為理想的細胞模型。

本實驗結果提示miR-656-3p在AD中起誘導細胞增殖、抑制凋亡的作用，從而抑制AD進一步惡化；ATP10A是miR-656-3p的下游靶基因之一，且二者表達量呈負相關；ATP10A在細胞模型中表達量顯著增加，與過表達miR-656-3p的作用相似，敲低ATP10A可顯著促進模型細胞的增殖，抑制細胞的凋亡，在AD中發揮保護作用；共轉染過表達miR-656-3p 和ATP10A顯著恢復miR-656-3p對ATP10A蛋白表達量的抑制作用，逆轉miR-656-3p對細胞模型增殖的促進及細胞凋亡的抑制作用；相反，共轉染敲低miR-656-3p 和ATP10A顯著逆轉anti-miR-656-3p對ATP10A蛋白表達量的促進作用，恢復anti-miR-656-3p對細胞模型增殖的抑制及細胞凋亡的誘導作用；表明miR-656-3p調控AD模型細胞的生長、凋亡，其作用機制是直接靶向ATP10A。