牛乳中常見熱敏性生物活性物質的研究進展

扶曉菲，邢倩倩，游春蘋

（乳業生物技術國家重點實驗室上海乳業生物工程技術研究中心光明乳業股份有限公司乳業研究院，上海200436）

0 引 言

牛乳，尤其是牛初乳，營養價值豐富并與人乳組成相似，是一種來源天然且經濟高效的滋補食品[1]。除乳糖，蛋白質（主要是酪蛋白、乳清蛋白），乳脂肪，礦物質（如鈣、鐵），維生素等常規營養素外，牛乳中還存在諸多生物活性物質，例如β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,β-Lg）、α-乳白蛋白(α-lactoalbumin, α-La)、乳鐵蛋白(Lactoferrin, Lf) 、免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig)、乳過氧化物酶(lactoperoxidase, LPO)、溶菌酶(Lysozyme, LZM)、酪蛋白源和乳清蛋白源的生物活性肽，不飽和脂肪酸，如亞油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)、反式脂肪酸(Trans fatty acids , TFA)、激素（如褪黑素）及細胞因子（如白細胞介素）等，這些生物活性物質的攝入對人體健康有益，在抗菌、抗病毒、抗癌、抗氧化，防控慢性病、調節免疫等方面均發揮潛在價值[2]。特別是在兒童常見傳染性疾病的日常防控中，牛乳及其發酵乳制品也一直被備受推崇，牛奶等高蛋白食物的攝入對于提高免疫力而言是必要的[3]。

對生牛乳進行適度的熱處理，有助于殺滅牛乳中的致病微生物，延長產品貨架期。但過度的熱處理，則會導致牛乳中乳糖結構改變，蛋白質變性，β-Lg、α-La、Lf、Ig、LPO、LZM 等活性物質失活，甚至可能產生通過美拉德反應產生糠氨酸、糠醛類化合物、糖基化終產物等有害物質，既改變了乳品的營養和風味，也影響了產品的品質[4]。一般生牛乳經均質（65 ℃）、升溫后進入殺菌階段，較為多見的4 類分別是：低溫長時（Low temperature long time, LTLT）巴氏 殺 菌（61.1～65.6 ℃, 30 min），高溫短時（High temperature short time, HTST）巴氏殺菌（75～85 ℃, 15 s），超巴氏殺菌（125～138 ℃, 2 s）和超高溫滅菌（Ultra high-temperature sterilized, UHT, 135～140 ℃ , 4 s），也有經包裝后再滅菌（115～120 ℃，20～30 min）[5]得到商業無菌產品。牛乳中很多生物活性物質是熱敏性的，不同的熱處理方式對生物活性物質的影響大不相同，既有報道指出均質化處理提高了乳清蛋白的乳化穩定性，巴氏殺菌在有效殺菌的同時對活性物質影響有限，而超高溫滅菌則對活性物質的保留相對不利，因此這些生物活性物質具備成為牛乳熱損指標來衡量乳品質量的潛力[6-7]。本文歸納了牛乳熱敏性的生物活性物質的常見生理功能，探究不同熱處理方式對其產生的影響，嘗試為牛乳熱敏指標的篩選和牛乳加工工藝優化及乳品質量評價指標的完善作出理論參考。

1 常見生物活性物質及其功能特性

1.1 活性蛋白及常見酶類

酪蛋白和乳清蛋白是牛乳中主要的蛋白，pH 為4.6 時，不溶性酪蛋白約占80%，熱變性溫度范圍約為160～200 ℃，在常見的幾種熱處理溫度下相對穩定[8]。而可溶性的乳清蛋白則約占乳蛋白的20%，但更具熱敏性，其中牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)在牛初乳及常乳中均少量存在，本文不再過多討論BSA[9]。乳清蛋白又包含β-Lg、α-La、Lf、Ig 等具有生物活性的乳蛋白，以及與之相互作用的LPO 及LZM等，乳清蛋白多自65 ℃起開始變性，變性率與溫度正相關，變性后的乳清蛋白之間，乳清蛋白與酪蛋白膠束也會發生熱凝聚，進而影響牛乳品質和功能特性[10-11]。

β-Lg 和α-La 是牛乳清蛋白的主要成分，β-Lg 常與脂肪酸或維生素等疏水性配體結合而具備營養特性，其他功能特性尚未完全明確，可能與輸送脂肪酸至腸細胞有關[12]。一項針對白藜蘆醇的功能特性改進的研究指出，在巴氏殺菌的加工工藝條件下，白藜蘆醇和β-Lg 的相互作用，顯示出了β-Lg 對白藜蘆醇熱損傷導致的化學變化的保護作用，進而表現出提高其的抗氧化性和熱穩定性[13]。α-La 則具有最佳的氨基酸配比，作為一種色氨酸含量最為豐富的乳清蛋白，在抗氧化、提升認知，改善癲癇具有明顯作用，它在牛乳和人乳中的含量存在差異，因此也被運用到嬰兒配方食品中來保證嬰兒的生長發育[14-15]。

Lf 和Ig 是牛乳兩類主要的生物活性物質，Lf 是一種與鐵離子結合的多功能乳活性蛋白，最初于1939 年被發現且在牛初乳中較為豐富的存在，乳鐵蛋白的功能特性有抗菌抗炎、參與局部免疫以及與Ig 發揮協同作用[16]。此外，Svetlana[17]等也首次在7 只不同品種的乳牛中分離并證實了在Lf 具備過氧化物酶、蛋白酶、磷酸酶等催化活性。常見Ig 種類有IgG、IgM、IgA、IgD 及 IgE 5 種，其中 IgA 是人乳中主要免疫蛋白，Ig 作為牛乳中關鍵抗菌蛋白，在免疫防御機制中不可或缺[18-19]。報道指出，Lf 和Ig 類乳抗菌蛋白的水平直接影響著乳牛對乳腺炎的易感性，進而可能影響牛乳品質及貨架期[20]。

LPO 是牛乳抗菌系統中含量最高的基礎酶之一，借助乳過氧化物酶系統的硫氰酸鹽和H2O2，催化多類微生物失活，由于其廣泛的抗菌性能而對免疫系統具有保護作用，并在延長乳品貨架期壽命存在潛在應用前景[21-22]。例如Manabu 等實驗發現，相較單獨作用組，LPO 和Lf 的聯合使用在改變白念珠菌的細胞活性和菌絲形態中都更加顯著，并展現出了良好的協同抗菌活性[23-24]。當然，LZM 作為可與免疫球蛋白和乳鐵蛋白發生協同作用的酶蛋白，也對多種細菌表現出抗菌活性[25]。除了牛乳，人體口腔及淚液中也檢測到LPO 和LZM，一項針對老年人口腔微生物群的研究表明，牙菌斑中革蘭氏陰性菌數量在經干預后顯著減少，提示了LPO 和LZM 添加至口腔衛生制劑用于口腔健康管理的潛在意義[26]。

根據溶解度歸納得到的乳活性蛋白一般變性順序是ALAC、β-Lg、Ig，但也在其他報道中見到不同熱敏性大小排序，如Ig、β-Lg、α-La，既有報道關于常見活性物質及功能特性詳見表1[4]。此外，牛乳中的生物活性物質也會在熱處理過程中發生乳清蛋白之間、乳清蛋白與酪蛋白、乳清蛋白與乳糖的相互結合及凝集，因此對牛乳熱敏性生物活性物質的充分研究，有利于充分保留熱處理過程中的活性物質，從而進一步拓展乳清蛋白在功能性食品配料中的開發和應用[10,27]。

1.2 生物活性肽

酪蛋白和乳清蛋白經水解得到的各類生物活性肽是近些年來備受關注的又一大類生物活性物質，其中以免疫活性肽、降血壓肽、抗血凝肽等為代表的的酪蛋白生物活性肽來源最為豐富和廣泛，此外還包括Ig、Lf 在內的其他乳清蛋白源抗菌肽等[28]。這些乳源性生物活性肽經體外和體內實驗證實在免疫系統、消化系統、心血管系統、神經系統中表現出提高天然免疫、抗氧化抗菌、防控動脈粥樣硬化等慢性疾病的潛在價值，乳蛋白衍生肽也逐漸成為功能性食品和藥物的研發方向[29-30]。

酪蛋白源生物活性肽研究領域多聚焦于4 個方面：（1）抗菌活性、是有效的細菌抑制劑；（2）免疫調節作用，例如酪蛋白水解物對人體T 細胞具有抗炎作用，可降低促炎核心細胞因子IL-6的釋放；（3）降血壓作用，作為血管緊張素轉換酶抑制劑來發揮作用；（4）促進成骨細胞增殖，經水解的多肽表現出顯著的增殖效應[31-33]。除此之外，還包括促進鐵鈣鋅等礦物質吸收、影響神經放松以及抵抗細胞凋亡等潛在功能特性，酪蛋白源生物活性肽的生物活性受水解作用后生成肽的大小和序列影響[32,34]。

表1 常見的活性物質及功能特性

乳清蛋白源生物活性肽同樣表現出諸多類似的生理功能[28]。由于抑制血管緊張素轉換酶和二肽基肽酶是治療糖尿病和高血壓的有效途徑，Lacroix 等[35]借助體外試驗發現乳清蛋白水解物表現出了血管緊張素轉換酶和二肽基肽酶的抑制活性，且對前者的抑制作用更為明顯，體現了乳清蛋白源生物活性肽的藥物應用潛力。Lf 對糞腸球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等一系列細菌和真菌產生抗菌作用，而以Lf 為前體經胃蛋白酶水解生成后的乳源生物活性小肽，抗菌活性更強[28,36]。

1.3 乳脂類及其他

除乳活性蛋白和生物活性肽外，牛乳中的一些其他活性物質也同樣作為調節因子，在機體內表達生理功能。例如激素、多種生長因子，不飽和脂肪酸（CLA、TFA）、細胞因子、核苷和核苷酸等。乳脂類中典型的活性物質是CLA 和TFA，二者含量變化呈現正相關性，CLA 被報道具有抗動脈粥樣硬化和抗癌等特性，但尚有待更多的研究佐證，乳脂肪中還含有許多必需氨基酸以及神經鞘磷脂等脂類，均參與多種生化反應，并在人體心血管系統及神經系統中發揮積極作用[37]。牛乳中激素含量不高但種類豐富，常提及的有雌激素、褪黑素以及由垂體、腺體分泌的各類激素，具有促進生長發育等作用，例如對于不能分泌褪黑素的嬰兒而言，研究發現褪黑素增補具有改善嬰兒的睡眠和減少嬰兒絞痛的潛在效果，當然激素也可以協同各類生長因子來表達特定性能[38-39]。Yuen 等[40]指出胰島素樣生長因子-I 具有類胰島素的特性，在諸如糖尿病等類型的胰島素敏感性的防治中具有應用前景。

2 熱處理對生物活性物質的影響

熱處理導致的活性物質的改變主要體現在結構和性質兩方面的改變，本節主要從均質、巴氏殺菌、超高溫瞬時滅菌、熱噴霧干燥4 個典型熱處理工藝考量活性物質的改變。熱加工過程中，牛乳中發生的一系列變化包括乳清蛋白變性及相互熱凝聚（如α-La 和β-Lg 之間）、酪蛋白與乳清蛋白通過疏水鍵或氫鍵聚集并隨加熱時間的延長而進一步加強、乳糖和蛋白的相互作用導致美拉德褐變、巰基化合物及不溶性物質形成[41]。既有文獻報道中常見熱處理工藝導致的活性物質熱損詳見表2。

2.1 均質

均質是乳品加工過程中必不可少的工藝之一，其目的是得到合適粒徑的乳脂肪球，充分乳化牛乳體系并使之穩定，65 ℃、20 MPa是一個理想的均質工藝參數，一般的預熱和均質條件下僅少數乳清蛋白結構發生變化，即少數蛋白變性，無需擔心過度均質對健康產生不利影響，均質熱損害的相關報道并不多見[42-43]。值得一提的是，Pereda 等[44]通過比較經超高壓均 質（200～300 MPa，30～40 ℃）和高 溫巴 氏殺 菌（90 ℃, 15 s）兩種殺菌工藝得到的奶樣中變性β-Lg和340 nm 的吸光度值，證實前者作為一種非熱或低熱處理工藝，其對牛奶中生物活性物質的熱損害更小，提出了超高壓均質技術代替高溫巴氏殺菌技術的可能性。類似的，一項研究超高壓均質工藝對乳過氧化物酶體系影響的研究也指出，LPO 對超高壓均質表現出耐熱性，即在100 ～250 MPa 的壓力下，觀察到酶活性增加約20%，而當壓力升為300 MPa 時，酶活性減少約30%[45]。

2.2 巴氏殺菌

傳統的熱巴氏殺菌有2 種類型，LTLT 巴氏殺菌和HTST 巴氏殺菌，熱巴氏殺菌對牛乳中各類營養和活性物質具有不同程度的影響。整體可歸納如下，（1）酪蛋白膠束直徑與熱加工溫度呈正相關，并可與變性的乳清蛋白相互作用[4]；（2）Ig 對溫度變化最為敏感，IgG、IgA、IgM的熱穩定性呈遞減趨勢，IgG在pH為5.5 時變性最快，酸介質可能對IgG 變性影響最小[46]；（3）乳清蛋白中β-Lg 對溫度變化敏感，72～75 ℃左右開始去折疊化，暴露巰基的同時伴隨著或輕或重的蒸煮味道[9]；（4）α-La 是一種金屬結合蛋白，熱敏性較β-Lg 弱，經78 ～94 ℃的熱處理，熱損失程度隨溫度和處理時間的增加而增加，油酸可能通過改變α-La的三級結構而對該蛋白的活性產生影響[47]；（5）LPO的變性終點溫度為85 ℃，因此可以作為衡量殺菌強度的熱敏性指標[4]；（6）巴氏殺菌過程一定程度上也會影響Lf，變性趨勢與Ig 較為接近，容易受溫度和pH 的影響，當 pH 為 5.5 時牛乳熱損率最高，Wakabayashi 等人也補充報道了在pH 為4，90～100 ℃熱處理條件下Lf相對穩定[46]，Lf作為一種糖基化蛋白，與之結合的特異聚糖的主要結構也決定了其熱穩定性；（7）對比發現，LTLT 巴氏殺菌較 HTST 巴氏殺菌對β-Lg 和α-La 兩類蛋白的熱損傷小[9]。另外一項比較微波巴氏殺菌和傳統巴氏殺菌的研究，也報道了80 ℃的高溫條件下，仍可以在經微波殺菌的奶樣檢測到過氧化物酶的酶活[48]。

2.3 超高溫瞬時滅菌

超高溫瞬時滅菌處理工藝對活性物質的熱損程度要高于巴氏殺菌，多數常見活性物質熱損率高，熱變性明顯。具體表現為：（1）酪蛋白膠束直徑繼續擴大[4]；（2）乳清蛋白在不同溫度下的變性程度各不相同，一般認為乳清蛋白在60 ℃或65 ℃起開始少量變性，在85 ℃或95 ℃就已完全變性，但也有報道指出α-La 相對而言較為耐熱，有時在超高溫滅菌條件下仍可少量存在，其他乳清蛋白如Ig，Lf 在超高溫條件下熱變性報道不多見，這可能與乳清蛋白在高溫下完全變性有關[4,49]；（3）Datta 等[41]歸納前人關于超高溫處理工藝的報道中提及，相較間接加工，直接加工方式更有利于保留牛乳中非變性的β-Lg。此外也有研究指出，保溫時間相對較長的二次滅菌工藝，盡管熱處理溫度稍低于超高溫滅菌，該工藝對牛乳品質造成的過度褐變等不良影響更甚，因此需要綜合考慮溫度和時間兩因素對活性物質保留的不同影響[8]。

表2 常見熱處理工藝導致的活性蛋白熱損傷 %

2.4 熱噴霧干燥

嬰幼兒配方奶粉常見有濕法、干法、干濕復合3 種加工工藝，熱噴霧干燥一種常見的濕法乳粉最常見加工過程之一，通過霧化液體物料蒸發水分來生產乳粉，熱處理溫相對較高可能導致蛋白質變性，但由于噴霧干燥通常發生在數秒內，產生的熱損害相對有限[50]。一項經 130、160、190 ℃ 3 種不同噴霧干燥溫度來探究的其對乳清蛋白變性率的研究發現，相對噴霧干燥前濃縮液的乳清蛋白變性率，3 種加工溫度均未對乳清蛋白變性率產生顯著性影響，尤其是β-Lg[51]。溶解性是乳清蛋白功能行為的一個重要性質，蛋白質變性及聚集是乳清蛋白溶解度降低的先決條件，進而也會影響牛乳的加工特性特性。另一項研究乳清蛋白經噴霧干燥后溶解度差異的研究表明，低出風溫度(60～80 ℃)下的α-La 和β-Lg 溶解度沒有顯著影響，但在高出風溫度(100～120 ℃)下，二者溶解度有顯著下降，且β-Lg 的溶解度損失明顯高于α-La[52]。此外，wang 等[53]也證實了與液態Lf 物料相比，噴霧干燥后制備的牛乳鐵蛋白粉中粉體變性程度和構象變化可忽略不計。

3 結 論

乳生物活性物質種類豐富，功能特性諸多，目前已借助許多體外、體內實驗證實其具有抗菌、抗炎、防治慢性疾病等潛在生理功能。根據既有報道，牛乳中豐富的活性物質作為潛在新型功能性原料，在嬰兒配方奶粉等功能性乳制品和保健食品、口腔衛生制劑及慢性疾病防治藥物中展現應用前景，但實際應用相對有限，值得進一步推進臨床實驗，深入探究乳活性物質在人體健康方面的應用價值。

相對于酪蛋白，牛乳中的乳清蛋白，尤其是β-Lg、α-La 對熱處理方式更為敏感，可以作為熱敏性指標來反推乳品加工強度和品質，衡量牛乳熱處理強度的熱敏性指標及乳制品質量安全評價指標需要進一步明確和完善。理想的牛乳熱處理方式需要平衡好貨架期和生物活性物質保留這兩大因素，已有報道證實巴氏殺菌工藝活性蛋白熱損相對較低，較為適宜，而近年來的報道指出了蒸汽注入式加工工藝在活性蛋白熱損傷中展現出的優勢，此外諸如超聲波、微波處理等熱替代性殺菌工藝的研究也有待進一步探討和應用。