元素分析法測(cè)定奶粉中蛋白質(zhì)含量及氮含量的不確定度評(píng)定

常偉偉，彭輝，胡冰潔

（山東理工大學(xué)分析測(cè)試中心，山東淄博，255049）

0 引 言

蛋白質(zhì)是奶粉中重要的營(yíng)養(yǎng)成分[1-2]。蛋白質(zhì)含量是衡量奶粉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)之一。由于蛋白質(zhì)是非常復(fù)雜的有機(jī)大分子，目前還沒有直接測(cè)定方法[3-4]。最常用的測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法為凱氏定氮法[5-6]，需要經(jīng)過硝化、蒸餾、滴定等步驟，才能測(cè)定出氮含量，測(cè)定的氮含量乘以換算系數(shù)6.38（參照國(guó)標(biāo)GB5009.5-2016）[7]，從而計(jì)算出粗蛋白的含量。但該方法操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而且使用大量溶劑，造成溶劑浪費(fèi)和環(huán)境污染，并且還會(huì)產(chǎn)生有毒氣體，如果操作不當(dāng)，還會(huì)對(duì)操作者的身體造成一定程度的損害。

元素分析儀是20 世紀(jì)60 年代出現(xiàn)的，1960 年以后，隨著物化分析及電子技術(shù)的飛速發(fā)展，元素分析儀的自動(dòng)化也日趨成熟。近年來，元素分析法廣泛應(yīng)用于化工產(chǎn)品、食品及藥品中有機(jī)元素C、H、N、S、O的定量分析[8-11]。元素分析法測(cè)定N 元素含量的原理是依據(jù)杜馬定氮法[12]，樣品在高溫下，氧氣助燃條件下燃燒，N 元素轉(zhuǎn)變?yōu)镹2和氮氧化物被高純載氣帶到還原管，被還原銅還原后，全部轉(zhuǎn)變?yōu)镹2，最后被載氣吹到檢測(cè)器，通過測(cè)量含氮載氣和純載氣的信號(hào)差，得出氮的含量。氮含量乘以換算系數(shù)可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。元素分析法具有操作簡(jiǎn)便、樣品用量少、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點(diǎn)。近年來，采用元素分析法測(cè)定N元素含量，以間接測(cè)定食品中蛋白質(zhì)的研究也日益增加。如：鐘虹敏等[13]分別用元素分析法和凱氏定氮法測(cè)了16 種粉狀食品中蛋白質(zhì)的含量，兩種方法測(cè)定的結(jié)果相近。蔡紅燕等[14]的研究表明元素分析法測(cè)定面粉中粗蛋白含量，比凱氏定氮法準(zhǔn)確度和精密度高。由此可見，元素分析法可以作為凱氏定氮法的替代和補(bǔ)充方法，是測(cè)定食品中蛋白質(zhì)含量的一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

測(cè)量不確定度是表征合理賦值與被測(cè)值（真值）的分散性與測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)[15]，測(cè)量不確定度的大小反映了測(cè)量結(jié)果的可信程度。因此為了說明測(cè)量結(jié)果的質(zhì)量，必須評(píng)定測(cè)量不確定度。通過測(cè)量不確定度的評(píng)定，還可以知道各種測(cè)量誤差對(duì)不確定度分量的貢獻(xiàn)[16]，從而控制對(duì)測(cè)量不確定度貢獻(xiàn)較大的分量，確保測(cè)量結(jié)果的質(zhì)量符合規(guī)定的用途。本文用元素分析法測(cè)定了11 種成人及嬰幼兒奶粉中的蛋白質(zhì)含量，并以實(shí)例對(duì)元素分析法測(cè)定N 含量的不確定度進(jìn)行了評(píng)定，為更系統(tǒng)合理的評(píng)定元素分析法測(cè)定蛋白質(zhì)含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備與材料

元素分析儀（帶80 位自動(dòng)進(jìn)樣器）Vario EL cube，德國(guó)Elementar 公司；XP6 型微量電子天平，分度值0.001 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

對(duì)氨基苯磺酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（sulfanilamide,C6H8N2O2S）N: 16.25%，德國(guó) Elementar 公司；測(cè)試樣品：11 種成人及嬰幼兒奶粉（見表1），市售；錫舟4×4×11 mm，德國(guó)Elementar公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)條件

CHNS 模式: 燃燒管溫度: 1 150 ℃; 還原管溫度:850 ℃; TCD 溫度：60 ℃ 。載氣：高純 He 氣（體積分?jǐn)?shù)≥99.999%），流速：120 mL/min，工作壓力：0.0110～0.0115 MPa; 助燃?xì)猓焊呒僌（2體積分?jǐn)?shù)≥99.999%），氧氣的減壓閥調(diào)節(jié)為0.22 MPa。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

（1）儀器開機(jī)，打開軟件，選擇模式為CHNS 模式，檢漏完成后，設(shè)定燃燒管溫度: 1 150 ℃; 還原管溫度: 850 ℃，TCD 溫度：60 ℃，升溫至各溫度達(dá)到工作溫度。

（2）先做 n 個(gè)空白實(shí)驗(yàn)，至C、H、N、S 的空白峰積分面積小于100。

（3）用微量電子天平精確稱量2～3 mg 對(duì)氨基苯磺酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用錫舟包好壓實(shí)。平行2～3 個(gè)Run in（對(duì)氨基苯磺酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）以使系統(tǒng)達(dá)到平衡，系統(tǒng)穩(wěn)定后，再測(cè)量3 次平行的對(duì)氨基苯磺酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，計(jì)算日校正因子。

（4）用微量電子天平精確稱量2～3 mg 待測(cè)樣品，用錫舟包好壓實(shí)，依次放到自動(dòng)進(jìn)樣器對(duì)應(yīng)的位置。每個(gè)樣品做3 次平行。每測(cè)試20 個(gè)樣品后，重復(fù)測(cè)量?jī)纱螛?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

（5）全部測(cè)試完成后，降溫，待燃燒管和還原管降到100 ℃以下后，關(guān)閉氦氣和氧氣，關(guān)閉軟件，關(guān)閉主機(jī)。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度和方法精密度考察

采用元素分析法對(duì)11 種奶粉中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品均重復(fù)測(cè)定3 次。測(cè)定結(jié)果見表1。從表1 中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，蛋白質(zhì)測(cè)定值與產(chǎn)品標(biāo)示值基本一致，相對(duì)誤差小于7.2%，符合蛋白質(zhì)測(cè)定要求。重復(fù)3次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于0.36%，說明元素分析法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的精密度良好。

2.2 測(cè)定不確定性評(píng)估

以荷蘭乳牛（中老年脫脂高鈣益生菌）奶粉為例，對(duì)N 含量測(cè)定結(jié)果的不確定度進(jìn)行了評(píng)定。

2.2.1 建立測(cè)量數(shù)學(xué)模型

奶粉中N 元素的含量的測(cè)量數(shù)學(xué)模型為：

式（2），（3）中：x 為元素分析儀測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（對(duì)氨基苯磺酰胺）中N 元素的絕對(duì)峰面積；y 為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中N 元素的絕對(duì)質(zhì)量（mg）；a 為校準(zhǔn)曲線的斜率；b為校準(zhǔn)曲線的截距。

2.2.2 不確定度的來源

由式（1）（3）可繪制氮元素測(cè)定的因果關(guān)系圖（圖1），由圖1 可見測(cè)量N 元素含量的不確定度的來源主要包括：稱量過程產(chǎn)生的不確定度、對(duì)氨基苯磺酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度、工作曲線擬合的不確定度及測(cè)量重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度。

表1 元素分析法測(cè)定奶粉中蛋白質(zhì)含量（n=3）

圖1 氮元素含量測(cè)定的因果關(guān)系圖

2.2.3 不確定度評(píng)定

不確定度的評(píng)定區(qū)分為A 類評(píng)定和B 類評(píng)定[17]。A 類不確定度評(píng)定是通過對(duì)規(guī)定測(cè)量條件下獲得的測(cè)量值的統(tǒng)計(jì)分析評(píng)定測(cè)量不確定度分量。B 類不確定度是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和資料及假設(shè)的概率分布估計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)偏差表征，只能用非統(tǒng)計(jì)分析的方法進(jìn)行評(píng)定。

（1）稱量過程產(chǎn)生的不確定度um

樣品的質(zhì)量的不確定度是由稱量過程帶來的。樣品的質(zhì)量m，實(shí)際上是用配衡體稱量法通過2 次稱量所得，即有一次去皮（回零）所得：

式中：m皮=m1：沒有裝樣品時(shí)空錫舟的質(zhì)量（mg）；m總=m2：樣品與錫舟總質(zhì)量（mg）。

（a）沒有裝樣品的空錫舟質(zhì)量m1的不確定度u（m1）評(píng)定

m1的不確定度來自兩方面：第一，由天平稱量不準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uB1（m1），按B 類方法評(píng)定；第二，天平分辨力引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uB2（m1），也是按B 類方法評(píng)定。

在本實(shí)驗(yàn)中使用的電子天平的最大允許誤差±0.001 mg，服從均勻分布，則包含區(qū)間半寬度am01=0.001 mg，包含因子由此引起的不確定度uB1（m1）為

由天平說明書可知其分辨力為0.001 mg，服從均勻分布，區(qū)間半寬度am02=0.0005 mg，包含因子km02=由此引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uB（2m1）為：

則m1稱量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

(b) 質(zhì)量m2的不確定度 u（m2）評(píng)定

質(zhì)量m2的標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評(píng)定與質(zhì)量m1的標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定方法相同。因此質(zhì)量m2的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u（m2）為：

(c) 質(zhì)量m 的不確定度um評(píng)定

質(zhì)量m1和m2是用同一臺(tái)電子天平測(cè)量的，是相關(guān)量。但是m 是m1和m2差值，其系統(tǒng)偏差被抵消，m 的不確定度采用方和根的方法進(jìn)行合成，即：

（2）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度us

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)生的不確定度屬于B 類不確定度，本實(shí)驗(yàn)使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)氨基苯磺酰胺按照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書上給出的N 元素百分含量wstd=16.25% ± 0.04%，由于沒有關(guān)于不確定度的其他說明，按均勻分布處理，其區(qū)間半寬度astd= 0.04%，則由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)氨基苯磺酰胺引起的N 元素的不確定度為：

（3）工作曲線擬合的不確定度uw

本次校準(zhǔn)采用一次線性方程式(2)：y=ax+b，另外，證書中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)氨基苯磺酰胺的N 元素百分含量為16.25%，對(duì)氨基苯磺酰胺中N 元素絕對(duì)質(zhì)量y 還可以通過N 元素百分含量乘以稱量質(zhì)量mstdi得到，即：

式中mstdi為i 次稱量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量；wstd為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中N 元素的百分含量（16.25%）。

在日常分析中，需要用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)得的日校正因子f 對(duì)校準(zhǔn)曲線進(jìn)行調(diào)整。f 是日常測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)后，理論值wthe與日常測(cè)試值wact之比，即

因此，計(jì)算實(shí)際樣品中N 元素的絕對(duì)質(zhì)量時(shí)，實(shí)際使用的校準(zhǔn)曲線為式（3）：y=f×(ax+b)。

通過測(cè)量一系列的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)xstdi，繪制標(biāo)準(zhǔn)方程為：

式中yi是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)于xi的用式（13）計(jì)算得到的值，為x=xi時(shí)用式（16）計(jì)算得到的值；n 為繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)數(shù)（n=20）。

本次實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品荷蘭乳牛（中老年脫脂高鈣益生菌）奶粉進(jìn)行了10 次測(cè)量，以式（3）為定量依據(jù)，得到樣品中N 元素的絕對(duì)質(zhì)量y0。最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)得出x0時(shí)，所產(chǎn)生的的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

式(18)-(20)中，i 為測(cè)試編號(hào)；絕對(duì)質(zhì)量的平均值；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線所用全部 ystdi的平均值；為全部xstdi的平均值；a 為校準(zhǔn)曲線的斜率（a=3.059×10-5）；b 為校準(zhǔn)曲線的截距(b=9.212×10-4)；p 為樣品測(cè)試次數(shù)（p=10）；n為繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)數(shù)（n=20）；日校準(zhǔn)因子f=1.009。

由校準(zhǔn)曲線引起的相對(duì)不確定度uw,rel為：

（4）測(cè)量重復(fù)性引起的不確定度ur

在相同條件下，稱取10 份荷蘭乳牛（中老年脫脂高鈣益生菌）奶粉，進(jìn)行N 元素含量測(cè)定（測(cè)定結(jié)果見表2），測(cè)量重復(fù)性引起的不確定度屬于A 類不確定度，可以用統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算其不確定度。因此，由測(cè)量重復(fù)性帶來的不確定性u(píng)r為：

其中，sr為樣品測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差；p 為樣品的測(cè)量次數(shù)（p=10）。

wN為測(cè)量的樣品奶粉中N 元素百分含量的平均值。計(jì)算結(jié)果見表2。

（5）測(cè)定奶粉中N 含量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc

以荷蘭乳牛（中老年脫脂高鈣益生菌）奶粉為例，采用元素分析儀測(cè)定奶粉中N 元素含量的相對(duì)合成不確定度為：

將有關(guān)數(shù)據(jù)代入公式（24）可以得出N 元素的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，見表3。

（6）測(cè)定奶粉中N 含量的擴(kuò)展不確定度UN

擴(kuò)展不確定度是用來評(píng)判測(cè)量方法或測(cè)量結(jié)果是否值得相信的量化參數(shù)。相對(duì)擴(kuò)展不確定度用合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以一個(gè)大于1 的包含因子（k）表示，置信（包含）水平P 為95%時(shí)，取包含因子k=2, N 元素含量的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為：

表2 測(cè)量重復(fù)性引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量

表3 元素分析法測(cè)定荷蘭乳牛奶粉中N元素含量的不確定度評(píng)定結(jié)果

采用元素分析法測(cè)定荷蘭乳牛奶粉的N 元素含量的擴(kuò)展不確定度為：

則本實(shí)驗(yàn)中所測(cè)荷蘭乳牛（中老年脫脂高鈣益生菌）奶粉中N 元素含量及不確定度表示為(3.560 ±0.15)%，k=2, 置信水平P=95%

3 結(jié) 論

采用元素分析法測(cè)定了11 種奶粉中蛋白質(zhì)含量，測(cè)量結(jié)果表現(xiàn)出很好的準(zhǔn)確度和精密度。并以荷蘭乳牛（中老年脫脂高鈣益生菌）奶粉為例，評(píng)定了元素分析儀測(cè)定N 元素含量的不確定度，不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，其他不確定度貢獻(xiàn)從大到小依次為測(cè)量重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、及稱量過程。元素分析儀測(cè)定N 元素含量的擴(kuò)展不確定度為0.15%（k=2, 置信水平P=95%）。在使用元素分析儀測(cè)試元素含量時(shí)，選用元素含量與待測(cè)物含量盡可能接近的校準(zhǔn)物質(zhì)、增加標(biāo)準(zhǔn)曲線中的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)數(shù)、使用誤差小的天平等有助于減小不確定度，增加測(cè)試結(jié)果的可信度。