一種基于聚乳酸-聚組氨酸的新型口服藥物遞送載體

易翠翠， 馬夢雅， 吳超慧， 王金鳳， 張振中， 任雪玲

（鄭州大學 1. 藥物研究院; 2. 河南省腫瘤重大疾病靶向治療與診斷重點實驗室，鄭州 450001）

化學藥物治療（簡稱化療）是目前腫瘤治療的主要手段[1]。盡管口服給藥具有攜帶和服用方便，患者順應性好等優點[2]，但是由于大多數抗腫瘤藥物屬于疏水性分子，不僅在水中溶解度低，而且在胃腸道環境中不穩定，導致口服藥物后血藥濃度和生物利用度低，限制腫瘤治療效果。同時，化療藥物副作用強，容易產生耐藥性[3,4]。因此設計并構建安全、高效的口服藥物遞送載體以提高化療藥物的溶解性和生物利用度，降低化療藥物毒副作用，提高化療藥物治療效率，對于腫瘤治療具有重要意義。

兩親性嵌段共聚物是由親水和疏水兩個不同鏈段組成的一類高分子共聚物，在藥物遞送領域具有重要的應用前景[5]。一方面，這類藥物載體可以在水溶液中自組裝，疏水性的內核或層狀結構可以高效包載疏水性藥物，從而有效改善藥物溶解性；另一方面，藥物載體可以降低機體對藥物的降解和清除作用，提高藥物的生物利用度[6]，通過改變共聚單體的線性長度可調節藥物的釋放速率，延長藥物作用時間，減少給藥次數[7]。但是，兩親性嵌段共聚物大多數應用于靜脈給藥，在口服藥物遞送中因苛刻的胃腸道環境使其穩定性下降[8]。因此，本文希望設計并制備一種新型的口服藥物遞送載體，以期增強化療藥物的生物利用度，減少給藥頻次，降低毒副作用，提高治療效果。

聚乳酸（PLA）是美國食品與藥品管理局批準的生物降解醫用材料，也是兩親性嵌段共聚物常用的疏水性鏈段，具有無毒、無刺激性、可生物降解吸收的特點，常用于藥物載體之一[9,10]。PLA分子鏈中含有酯鍵，易水解產生乳酸、水和二氧化碳，導致載體所在微環境酸性增強，從而影響所載藥物的穩定性[11,12]。為改善PLA作為載體材料存在的缺點，通常使用其他材料對其進行改性。聚組氨酸（PLH）是一種具有良好生物相容性的高分子聚合物，在藥物遞送領域具有重要應用前景[13]。PLH咪唑環的不飽和氮原子上有一對孤電子對，解離常數（pKa）為6.5，可通過質子-脫質子作用實現親疏水性的轉變而具有兩親性特征。在低于pKa條件下，PLH由疏水性轉變為親水性[14,15]，可作為藥物載體的親水端。目前，PLH常用作藥物載體的疏水端，而其作為親水端的研究尚鮮見報道。

本文設計了一種基于PLA-PLH的新型藥物遞送載體，對其進行結構表征；然后以2-甲氧基雌二醇（2-ME）作為模型藥物，以結腸癌細胞株CT26為腫瘤細胞模型考察PLA-PLH/2-ME納米粒的細胞攝取、細胞毒性和細胞遷移；最后在動物水平考察其口服后的體內分布情況，探討其作為口服藥物遞送載體的可行性。結果表明：PLA與PLH通過酰胺鍵連接形成嵌段聚合物，在弱酸性條件下，PLA作為疏水端，PLH可作為親水端，自組裝形成納米粒子；同時PLH降解產生的小分子組氨酸能夠中和PLA載體降解所產生的酸性物質，緩解單一PLA降解所導致的局部pH過低現象。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

2-ME（純度≥99.5%）：鄭州大學藥物研究院提供；PLA（Mw=5×103）：濟南岱罡生物科技有限公司；L-組氨酸鹽酸鹽（His·HCl）、2,4-二硝基氟苯、氯甲酸芐酯（CBZ-Cl）、亞硫酰氯（SOCl2）、正己胺：分析純，上海麥克林試劑有限公司；四氫呋喃（THF）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）、1,4-二氧六環：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；β-巰基乙醇：分析純，美國Genview公司；異硫氰酸熒光素（FITC）：分析純，美國Sigma公司；熒光染料1,1'-二十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚并花青碘化物（DIR）：北京中生瑞泰科技有限公司；氯仿、乙醚、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）、鹽酸（HCl）、氫氧化鈉（NaOH）、碳酸氫鈉（NaHCO3）：分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司。

小鼠結腸癌細胞株CT26：鄭州大學藥物研究院保存；BALB/c小鼠：（18±2） g，無特定病原體（SPF）級，雌性，河南省實驗動物中心提供，許可證號為SCXK（豫）2017-0001。

1.2 測試與表征

核磁共振分析儀（德國布魯克AVAVCE III型）；傅里葉變換紅外光譜儀（日本島津RF-5301pc型）：溴化鉀壓片，光譜掃描范圍500 ～4 000 cm-1；馬爾文納米粒度儀（英國馬爾文Nano-ZS90型）：溶液體積為1 mL，25 ℃，平行掃描3次；熒光顯微鏡（日本Nikon Eclipse 80i型）；酶標儀（美國DYNEX Spectra MR型）：波長490 nm；小動物活體成像儀（德國布魯克In Vivo FX PRO型）。

1.3 實驗步驟

1.3.1 PLA-PLH的制備 PLA-PLH的合成路線如圖1所示，首先采用文獻[16～18]報道的酸酐開環反應合成PLH，然后再與PLA縮合而成PLA-PLH。

圖1 PLA-PLH的合成路線Fig. 1 Synthetic route of PLA-PLH

cbz-His的合成：將 2.100 0 g His·HCl溶于 NaOH 溶液（25 mL，1 mol/L）中，0 ℃ 條件下，滴加 1.41 mL cbz-Cl，接著升至室溫繼續反應2 h，然后向上述反應體系中加入20 mL乙醚，反應3 h后以鹽酸調節pH至產物析出，經過濾、干燥得到白色固體cbz-His。

cbz-His（DNP）的合成：將0.500 0 g cbz-His與0.600 0 mg NaHCO3溶于10 mL蒸餾水中，在冰浴條件下，依次加入 NaOH 溶液（1.2 mL，0.5 mol/L），1 mL 2,4-二硝基氟苯（216 μL）的 1,4-二氧六環溶液，在 0 ℃ 攪拌反應 8 h后，用鹽酸酸化析出沉淀，過濾、干燥得黃色固體cbz-His（DNP）。

His-NCA（DNP）的合成：將0.030 0 g cbz-His（DNP）溶于25 mL 無水THF 中，加入10 μL SOCl2，室溫反應40 min后，加入過量無水乙醚以沉淀產物，經過濾、真空干燥得到His-NCA（DNP）。

PLH（DNP）的合成：將 0.020 0 g His-NCA（DNP）溶于 30 mL 無水 DMF中，加入 5 μL 引發劑正己胺，在氮氣保護下室溫反應72 h后，以鹽酸酸化析出沉淀，經過濾、干燥得黃色固體PLH（DNP）。

PLA-PLH（DNP）的合成：將 1.000 0 g PLA 溶于 50 mL CHCl3中，加入 0.115 0 g NHS、0.192 0 g EDC·HCl，室溫、氮氣保護下攪拌反應4 h后，向上述反應體系中加入0.756 0 g PLH（DNP），室溫反應48 h后，反應液先用DMSO透析3 d，再用超純水透析3 d，凍干即得產物PLA-PLH（DNP）。

PLA-PLH的合成：稱取0.500 0 g PLA-PLH（DNP）溶于20 mL DMF中，加入7.5 mL β-巰基乙醇，在氮氣保護下，室溫反應24 h，將反應液用超純水透析72 h，冷凍干燥即得目標產物PLA-PLH，轉化率為26%，產率為17%。

1.3.2 PLA-PLH/2-ME的制備 將藥物2-ME（激發波長為290 nm，發射波長為 318 nm）與藥物載體PLA-PLH以不同質量比（0.2∶1、0.4∶1、0.6∶1、0.8∶1、1.0∶1）溶于 DMSO。隨后，在攪拌條件下，將上述混合溶液緩慢滴加到pH=6.5的超純水中。最后，經透析、冷凍干燥得到PLA-PLH/2-ME，其制備示意圖如圖2所示。稱取5 mg PLA-PLH/2-ME納米粒，用甲醇溶解，定容至25 mL，經超聲裂解、超速離心分離得到上清液，采用熒光分光光度計測定熒光強度。按下列公式分別計算包封率（RE）與載藥量（RL）：

圖2 PLA-PLH在水溶液中的自組裝Fig. 2 Self-assembly of PLA-PLH in aqueous solution

1.3.3 PLA-PLH的體外細胞攝取 參照PLA-PLH/2-ME的制備方法制備PLA-PLH/FITC（FITC與PLA-PLH的質量比為0.6∶1）。將對數生長期的CT26細胞接種于12孔板中（每孔1.5×105個），常規培養過夜，移除舊培養基，更換為含有PLA-PLH/FITC的培養基，同時設置FITC對照組，每組設3個復孔。繼續培養8 h后，棄去上清液，磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，采用熒光顯微鏡觀察熒光分布情況。

1.3.4 PLA-PLH/2-ME的細胞抑制率 將對數生長期的CT26細胞接種于96孔細胞培養板（每孔5.0×103個）培養至細胞匯合度約為80%，棄去原培養基，加入含有PLA-PLH/2-ME納米粒（2-ME濃度分別為2.5、5.0、10、20、40、80、160 μmol/L，2-ME與 PLA-PLH的質量比為 0.6∶1）的培養基，同時設置 2-ME對照組，每個濃度設5個復孔。培養48 h后，每孔加入20 μL噻唑藍（5 mg/mL），置于培養箱中繼續培養4 h，棄去上清液，每孔再加入150 μL的DMSO，低速振蕩（1.0×102r/min）至孔內紫色結晶溶解完全，采用酶標儀測定490 nm波長處的吸光度[19]，計算細胞抑制率（RI）并進行顯著性分析（**P＜0.01, ***P＜0.001）。

1.3.5 PLA-PLH/2-ME抑制細胞遷移 將對數生長期的CT26細胞接種于12孔細胞培養板，每孔2.0×105個，培養至細胞匯合度約為80%，用10 μL槍頭在細胞板底部劃出一條筆直的橫線，磷酸鹽緩沖溶液洗滌，除去漂浮細胞，加入含有PLA-PLH/2-ME（2-ME濃度為80 μmol/L，2-ME與PLA-PLH質量比為0.6∶1）的培養基，同時設置2-ME對照組和NC對照組，置于CO2培養箱繼續培養至特定時間（0、12、24、36 h）于顯微鏡下觀察細胞遷移情況并拍照。

1.3.6 PLA-PLH的體內組織分布 按照PLA-PLH/2-ME的制備方法制備PLA-PLH/DIR(m (DIR)/m (PLAPLH)=0.6∶1)，DIR載藥量為33.7%。分別將DIR、PLA-PLH/DIR（DIR質量濃度為1.00 mg/mL）按每只小鼠200 μL的劑量，經口飼喂BALB/C小鼠，隨后在不同時間點（1、8、24 h）用小動物活體成像儀拍照，并在24 h脫頸處死小鼠，解剖主要臟器（心、肝、脾、肺、腎、胸腺與結腸），觀察熒光分布情況。

2 結果與討論

2.1 PLA-PLH的結構表征

反應原料、中間體及目標產物的FT-IR譜圖如圖3所示。與His·HCl相比，cbz-His的FT-IR譜圖中，3 412 cm-1處的氨基伸縮振動峰消失，并新增了1 738 cm-1處的羰基伸縮振動峰，說明cbz-His制備成功。與cbz-His相比，cbz-His（DNP）的FT-IR譜圖在2 930 cm-1處出現了苯環的伸縮振動峰，說明cbz-His（DNP）制備成功。與 cbz-His（DNP）相比，His-NCA（DNP）的譜圖出現了羰基峰（1 785 cm-1），證明 His-NCA（DNP）的合成。與 His-NCA（DNP）相比，在 PLH（DNP）的譜圖上觀察到酸酐羰基峰（1 785 cm-1）的消失，證明 PLH（DNP）的合成。與PLH（DNP）相比，PLA-PLH（DNP）的FT-IR譜圖中，在3 442 cm-1處出現了PLH（DNP）的氨基伸縮振動峰，在1 631 cm-1處出現了苯環的伸縮振動峰，且在 1 759 cm-1處出現了羰基伸縮振動峰，證明PLA-PLH（DNP）合成成功。PLA-PLH的FT-IR譜圖與PLA-PLH（DNP）相比并沒有明顯變化，需要進一步進行核磁表征。

圖3 樣品的紅外光譜圖Fig. 3 FT-IR spectra of samples

樣品的1H-NMR表征結果如圖4所示。與PLA相比，PLA-PLH（DNP）在化學位移8～9處出現了新質子峰，PLA-PLH（DNP）在4～5處出現了CH—NH—CO的質子峰，表明成功合成PLA-PLH（DNP）。在PLA-PLH的1H-NMR譜圖中，可以明顯看到在8～9處2,4-二硝基氟苯基團峰消失，證明脫保護成功。1H-NMR進一步驗證FT-IR結果，表明PLA-PLH成功合成。

2.2 PLA-PLH的粒徑與電位表征

PLA-PLH具有兩親性，因此理論上PLA-PLH在水溶液中會自組裝成親水性PLH在外、疏水性PLA在內的結構。利用動態光散射法進行粒徑與電位的測定，實驗結果如圖5所示。PLA-PLH納米粒的粒徑為（224.93±13.05） nm，電位為（5.42±1.01） mV，表明 PLA-PLH 可以形成納米結構，同時 ζ-電位的電正性也進一步驗證了PLH在外的結構特征，這是因為PLH咪唑環的不飽和氮具有電正性。

2.3 PLA-PLH/2-ME納米粒的制備

圖4 樣品的1H-NMR譜圖Fig. 4 1H-NMR spectra of samples

圖5 PLA-PLH 的（a）粒徑與（b）電位Fig. 5 (a)Particle size and (b) potential of PLA-PLH

采用溶劑交換法制備得到的PLA-PLH/2-ME的載藥量與包封率如圖6（a）所示。隨著藥物與載體投料比的增加，PLA-PLH的載藥量逐漸增大。當投料比為0.6∶1時，PLA-PLH的載藥量增加到（27.86±0.19）%，包封率達到最大（（64.38±0.50）%）；當投料比繼續增加時，PLA-PLH的載藥量沒有明顯提高，包封率顯著降低。因此，后續實驗中投料比均為0.6∶1。以上實驗結果說明，PLA-PLH能夠有效負載2-ME。

PLA-PLH負載2-ME后粒徑與電位如圖6（b）所示，2-ME負載前后，PLA-PLH的粒徑與電位均沒有明顯變化，表明2-ME包裹至納米粒內部，且PLA-PLH負載2-ME后，依然能夠維持良好的納米結構。

2.4 PLA-PLH/2-ME的體外細胞實驗研究

采用PLA-PLH負載FITC考察CT26細胞對PLA-PLH的攝取情況，結果如圖7（a）所示。攝取8 h后，游離FITC組與PLA-PLH/FITC組的CT26細胞內均能觀察到綠色熒光，但是與游離FITC組相比，PLA-PLH/FITC組細胞內熒光強度顯著增強，表明PLA-PLH納米粒能夠顯著提高CT26細胞對FITC的攝取效率。

圖6 PLA-PLH/2-ME的（a）載藥量與包封率以及（b）粒徑與電位Fig. 6 (a)Drug loading and encapsulation efficacy,(b)particle size and potential of PLA-PLH/2-ME

圖7 （a）CT26細胞攝取成像（200×）；（b）PLA-PLH對 CT26 細胞的細胞毒性測定結果；（c）2-ME 和 PLA-PLH/2-ME 對 CT26 細胞的細胞抑制率測定結果Fig. 7 (a)Cell uptake imaging of CT26 cells (200×);(b)Cytotoxicity results of CT26 cells with PLA-PLH;(c)Cell inhibition results of CT26 cells with 2-ME and PLA-PLH/2-ME

藥物載體PLA-PLH的細胞毒性結果如圖7（b）所示。當作用時間為24 h或48 h時，隨著PLA-PLH質量濃度的不斷增加，CT26細胞的存活率有所下降；然而，即使PLA-PLH的質量濃度增加到160 μg/mL，CT26腫瘤細胞的存活率仍然高于85%。表明空白載體PLA-PLH對CT26細胞增殖率的影響具有劑量和時間依賴性，但未表現出明顯的增殖抑制作用。PLA-PLH/2-ME的細胞毒性實驗結果如圖7（c）所示。當作用48 h后，隨著藥物質量濃度的增加，游離藥物2-ME與PLA-PLH/2-ME對CT26細胞的增殖均具有抑制作用，且具有濃度依賴性。與2-ME組相比，PLA-PLH/2-ME組CT26細胞的抑制率顯著增加，表明PLA-PLH可以提高2-ME對腫瘤細胞的殺傷作用，增強2-ME的抗腫瘤活性。

利用細胞劃痕實驗考察納米粒PLA-PLH/2-ME對CT26細胞遷移的影響，結果見圖8。隨著培養時間的延長，各組CT26細胞均逐漸向劃痕間隙遷移。與NC組和2-ME組相比，PLA-PLH/2-ME組的細胞遷移顯著減慢，說明PLA-PLH能夠顯著提高2-ME對細胞遷移的抑制作用。

圖8 PLA-PLH/2-ME抑制CT26細胞遷移情況Fig. 8 PLA-PLH/2-ME suppressed the migration of CT26 cells

2.5 PLA-PLH的體內組織分布

用DIR染料作為熒光標記物，使用活體成像對口服灌胃后的DIR、PLA-PLH/DIR體內分布情況進行考察，結果如圖9（a）所示。經口給藥后，隨著時間的延長，DIR組與PLA-PLH/DIR組小鼠體內總熒光強度均不斷降低。但是與游離DIR組相比，PLA-PLH/DIR組小鼠體內熒光強度顯著增加。口服給藥24 h后，脫頸處死小鼠，解剖主要臟器進行熒光成像，結果見圖9（b），相比于DIR組在各臟器均有熒光分布，PLA-PLH/DIR組的熒光主要集中于結腸。實驗結果表明，PLA-PLH可以顯著延長DIR在小鼠體內的滯留時間。更為重要的是，PLA-PLH/DIR可以高效進入小鼠腸組織，說明PLA-PLH是一種高效的口服遞送載體，可以降低機體對DIR的降解和清除作用，提高DIR的生物利用度。

圖9 DIR與PLA-PLH/DIR的體內分布Fig. 9 Distribution of DIR and PLA-PLH/DIR in vivo

3 結 論

（1）基于聚組氨酸與聚乳酸成功構建了兩親性嵌段共聚物PLA-PLH，并將其作為納米藥物載體。

（2）PLA-PLH納米粒可以提高藥物的細胞攝取，增強藥物對腫瘤細胞的增殖與遷移的抑制作用。

（3）PLA-PLH可以降低藥物在胃腸道的降解，提高藥物的生物利用度。