利用便攜式運輸箱實現豬卵母細胞體外成熟

徐明珠，陶瑞鑫 ，賈超，牛培培，李娟*

(1. 南京農業大學動物科技學院，江蘇 南京 210095；2. 淮安市南農大新農村發展研究有限公司，江蘇 淮安 223005)

我國是養豬大國，不僅養豬數量和種豬市場世界第一，而且豬的遺傳資源豐富[1]。卵母細胞體外成熟、體外胚胎生產以及胚胎移植是保存和傳遞優質資源的重要技術環節。采用合適的方法保存卵巢、運輸卵巢和卵母細胞及可移植胚胎對于更好的利用資源尤為重要[2]。在實際生產中，受到運輸距離、方式和溫度變化等因素影響，最終從卵巢中采集的卵母細胞質量也會受到影響[3]，而卵母細胞的質量直接影響后續胚胎發育，極大地限制了卵巢資源的利用。若能提高母豬卵巢體外運輸質量或使得卵母細胞在運輸過程中實現體外成熟，將能更好的利用優質保種資源。目前，關于豬卵巢運輸溫度、運輸時間對卵母細胞的體外成熟率、體外授精率、胚胎發育率的影響已有較多報道[4-6]，但少有研究對運輸過程中卵母細胞能否實現體外成熟以及胚胎在運輸箱中的發育效率進行報道。

胚胎移植是輔助生殖技術中最重要的環節之一[7]。輔助生殖過程中的多種因素決定其成功效率，其中就包括了胚胎的質量、植入前胚胎保存與運輸方式、胚胎移植過程中受體母豬生理狀況[8]以及胚胎運輸容器等[9]。如果移植足夠數量的優質胚胎，受體母豬將會獲得更高的妊娠機會[10]。然而，體外生產所得胚胎均需置于恒溫運輸箱中運輸到豬舍進行胚胎移植。通常實驗室距離豬舍距離較遠，長距離和長時間運輸將影響最終用來移植的胚胎質量。因此，運輸箱的設計若能在保持恒溫的同時滿足胚胎體外培養條件，則能夠提高可用優質胚胎數量。因此，本研究旨在使用一種能夠維持運輸箱內溫度恒定且滿足各類型存放容器的便攜式運輸箱，并探究在運輸箱中卵母細胞成熟效率和胚胎發育潛力。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

除另有說明外，所有試劑均購于Sigma公司(St. Louis, MO, USA)。

1.2 運輸箱選擇

選用如圖1所示的便攜式運輸箱。其含兩種類型插孔以容納1.5 mL和0.5 mL離心管且中間部分設有凹槽用來固定0.25 mL麥管。

A.插孔與凹槽標記；B. 放入離心管與麥管

1.3 運輸箱溫度穩定性評估

運輸箱外接電源后，每隔2 h用溫度計讀取運輸箱內1.5 mL、0.5 mL離心管及0.25 mL麥管的溫度，并分別記為1.5 mL T、0.5 mL T和0.25 mL T。運輸箱未外接電源時，同樣每隔2 h使用溫度計讀取箱內溫度，直至電源耗盡，1.5 mL、0.5 mL離心管及0.25 mL麥管的溫度分別記為1.5 mL T′、0.5 mL T′ 和0.25 mL T′。

1.4 卵母細胞成熟率及質量評估

從后備母豬卵巢中，采集具有良好形態特征的卵丘-卵母細胞復合物(COCs)，并在IVM培養基中進行體外成熟(TCM-199中添加10%慶大霉素、10%卵泡液、0.8 mmol/L L-谷氨酰胺、75 μg/mL青霉素、50 μg/mL硫酸鏈霉素、15 IU/mL孕馬血清以及15 IU/mL人絨毛促性腺激素。所用COCs隨機分為以下4組：A組(對照組)，四孔板每孔放入約60個COCs，置于38.5℃、5% CO2、20% O2的培養箱(Thermo Scientific, American)中連續培養42～44 h；B組，在1.5 mL離心管(Axygen, Mexico)中放入約60個COCs；C組和D組，分別在0.5 mL離心管(Axygen, Mexico)中放入約30個COCs、0.25 mL麥管中放入約20個COCs，置于38.5 ℃運輸箱中進行體外培養42～44 h。

為進一步評估在運輸箱中成熟的卵母細胞質量，將不同組別優質成熟卵母細胞進行孤雌激活(PA)生產胚胎。具體步驟如下：體外培養42～44 h后，用透明質酸酶(1 mg/mL)吹打去除卵丘細胞，統計卵母細胞死亡率、MII期成熟率。挑選已排出第一極體的成熟卵母細胞，在0.5 mm融合槽中使用0.86 kV/cm的單直流脈沖,持續80 μs電激活 (model 450, BTX, San Diego, CA, USA)，隨后轉移至含10 μg/mL放線菌酮(CHX)和5 μg/mL 細胞松弛素B (CB)的PZM-3培養基中，置于38.5 ℃、5% CO2、20% O2的培養箱內繼續4 h化學激活。根據成熟卵母細胞來源，將所生產PA胚胎被分為4組，既A-A′，B-B′，C-C′，D-D′。激活的PA胚胎繼續以其來源的卵母細胞對應的環境體外培養，分別于24 h和48 h統計其分裂率。因運輸箱在未外接電源時，60～64 h電量耗盡，因此未能繼續PA胚胎體外培養到囊胚期。

1.5 數據分析

試驗數據采用SPSS軟件(IBM SPSS Statistics 20.0)進行統計分析。通過卡方檢驗對數據進行差異性分析，P<0.05時差異顯著，P>0.05時差異不顯著。

2 結果

2.1 運輸箱溫度維持

如圖2所示，無論運輸箱是否外接電源，1.5 mL T與1.5 mL T′、0.5 mL T與0.5 mL T′、0.25 mL T與0.25mL T′ 之間溫度無顯著差異，溫度均維持在38 ℃，且T與T′ 溫差保持在±0.2 ℃內。而0.25 mL T與0.25 mL T′ 相對較低，維持在37.3 ℃。由圖1可知，運輸箱內1.5 mL、0.5 mL離心管及0.25 mL麥管放置結構不同，使得0.25 mL麥管與空氣接觸面積更大，這可能是導致0.25 mL麥管溫度維持恒定但相對較低的原因。

圖2 運輸箱內溫度變化情況

2.2 卵母細胞在運輸箱中能夠進行體外成熟

不同培養條件下COCs體外成熟44 h后卵丘細胞擴散情況如圖3所示。B組和C組與A組相比，其卵丘細胞擴散表型一致。而D組卵丘細胞擴散相對較差。卵母細胞死亡率、MII期成熟率統計情況如表1所示，盡管D組卵丘細胞擴散情況不如其他組別好，但A，B，C和D組卵母細胞死亡率與成熟率均無顯著差異。

選擇含有第一極體且細胞膜完整，細胞質致密均勻的優質成熟卵母細胞(圖4)，生產孤雌激活胚胎。各組胚胎發育能力如表2所示， B-B′組胚胎2-細胞分裂率顯著高于C-C′和D-D′組，但4組胚胎繼續發育到4-細胞階段時分裂率無顯著差異。

A.培養箱條件下，COCs置于四孔板中體外成熟；B. 運輸箱條件下，COCs置于1.5 mL離心管中體外成熟；C. 運輸箱條件下，COCs置于0.5 mL離心管中體外成熟；D. 運輸箱條件下，COCs置于0.25 mL 麥管中體外成熟；E. 未成熟卵母細胞

圖4 優質成熟卵母細胞

表1 運輸箱中卵母細胞的體外成熟效率

表2 不同成熟條件下PA胚胎發育效率

3 討論

無論以何種技術體外生產所得豬胚胎都需通過運輸箱儲存運送至豬舍后進行胚胎移植手術[11]。可移植胚胎質量很大程度受卵母細胞質量影響。成熟卵母細胞質量與早期胚胎發育能力密切相關，優質卵母細胞生產所得胚胎具有更高的發育潛力。影響豬卵母細胞核質成熟的因素除了成熟時間和使用的成熟培養基類型外，還包括培養濕度、氣體組分和溫度等微環境，其中溫度是維持胞質正常成熟最重要的微環境因素[12-13]。母豬經超數排卵后回收所得的卵母細胞或屠宰場回收的卵巢均需要在短時間內運輸到實驗室以降低損傷[2,14]。在運輸過程中卵母細胞的質量會受到培養基類型和體積、運輸容器以及運輸中溫度的穩定性等因素的影響[15]。胚胎在液體環境中被運輸直到移植到受體母豬體內的過程也需要維持一個相對穩定的微環境，而運輸過程中溫度穩定性是關鍵因素，不穩定的溫度會影響移植前胚胎的質量[16]。如果在運輸過程溫度不斷變化則會導致胚胎或卵母細胞后續發育異常甚至死亡[17]。已有研究報道，卵母細胞可在一種便攜式培養箱中完成體外成熟[18]。我們的研究結果同樣顯示，運輸箱在外接或不接電源情況下均能維持豬卵母細胞發育所需恒定溫度，并且卵母細胞在運輸箱中能夠完成體外成熟，且成熟率與培養箱成熟率相比不存在顯著差異。因此，運輸箱可用于體外成熟培養卵母細胞且能夠支持早期PA胚胎發育。

完全生長COCs外周包裹多層卵丘細胞，卵丘細胞通常被認為是卵母細胞胞質與卵泡液直接的屏障，但卵丘細胞可借助間隙連接通過透明帶與卵母細胞發生聯系，為卵母細胞發育提供所需營養物質[19-23]。卵母細胞體外成熟過程中，卵丘細胞的擴散程度常作為判斷卵母細胞成熟及成熟質量的主要標準。本研究結果顯示，各組卵丘細胞均正常擴散，且卵母細胞體外成熟率無顯著差異。另外，豬卵母細胞中含有大量內源性脂，內源性脂是卵母細胞成熟過程中的重要能量來源[24-25]。已有研究表明，卵丘細胞與卵母細胞的互作[26]、內源性脂[27]以及PZM3[28]中的營養物質已足夠促使卵母細胞發育成熟。但卵母細胞成熟和胚胎發育不僅所需要培養基中化學物質的支持以及各成分合適的比例，也需要考慮培養溫度、氣體組分等微環境因素對卵母細胞和胚胎質量的影響[29]。哺乳動物植入前胚胎對環境改變十分敏感，并且培養條件會直接影響其后續生長和發育潛力。因此，培養環境的物理條件對于胚胎質量同樣至關重要。在研究中，盡管在運輸箱中成熟的卵母細胞后續胚胎早期發育能力并未表現出顯著缺陷，但在運輸箱內體外成熟過程中一些分子機制的改變可能會對胚胎后續發育及其質量存在潛在影響[30-31]。在我們的研究中，無論是在培養箱還是在運輸箱中培養，卵母細胞成熟液和胚胎培養基相同，并且在一定時間內運輸箱可以保持相對穩定的溫度供卵母細胞成熟和胚胎早期發育，但仍需考慮培養箱與運輸箱之間存在氣體含量、濕度等不可控差異，這些潛在的物理條件差異可能會導致卵母細胞和胚胎的質量的發育潛力存在差異。

綜上所述，在溫度維持穩定的運輸箱中可實現卵丘卵母細胞復合體體外成熟，以及支持孤雌激活胚胎完成至少兩次卵裂，且體外成熟效率以及4-細胞階段卵裂率并未受到顯著影響。