上海地區犬細小病毒病流行情況調查與病毒的分離鑒定

沈海瀟, 李鑫，楊德全，鞠厚斌，劉健，龔國華，趙洪進

(上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103)

犬細小病毒(canine parvovirus，CPV)屬于細小病毒科細小病毒屬，是危害犬類的最主要的烈性傳染病之一，從發現至今已在世界各地均有流行。該病毒傳播速度快、對幼犬有很高的致病性和致死率，給世界養犬業帶來巨大的災難。CPV 可感染犬科動物包括犬、貓和其他易感動物，且具有發病急、病程短、傳染性強、死亡率高的特點。CPV-2存在3種亞型，即 CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c，近些年來又進化為 new CPV-2a、CPV-2c(a)、CPV-2c(b)[1-2]。雖然犬細小病毒是DNA病毒，但卻有著與 RNA 病毒類似的高突變率，值得引起我們的重視。

犬細小病毒病發病具有明顯的季節性，即冬季高發，夏季發病較少，其原因可能是寒冷季節導致犬的抵抗力下降，發病率明顯增加[4-5]。CPV所致的臨床癥狀表現取決于病毒的毒力、感染程度和宿主抵抗力，按臨床癥狀可分為腸炎型和心肌炎型[6]。本病最初 24～48 h內一般不出現腹瀉，若發生腹瀉也很少出現便血。炎癥會繼發腸道蛋白質減少，造成低蛋白血癥。嘔吐是常見癥狀，嚴重時可引起食管炎，還會引起骨髓干細胞破壞，導致暫時性或長期性中性粒細胞減少，使動物發生嚴重的細菌感染，尤其是腸道損傷使得細菌易于進入機體。病情嚴重的犬可見體溫升高、全身炎性反應綜合征。幼犬可經子宮感染本病，在 8 周齡前的幼犬常常表現為心肌炎[7-10]。

本研究初步調查了2019年上海地區家養犬及流浪犬CPV感染的流行情況并對流行毒株進行分離培養、進化分析、以及形態學鑒定，以闡明上海地區CPV感染的流行率，病原遺傳變異及分子特征等，為該病的防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料采集與處理

定期收集來自上海犬類留驗場以及各寵物免疫點犬的糞便。采集的新鮮糞便樣本第一時間送回實驗室處理。

處理過程：取陽性病料0.5 g，用DMEM細胞營養液10倍稀釋，振蕩器充分混勻，5 000 r/min離心10 min，取上清，經0.22 μm微孔濾膜過濾后，4 ℃保存備用或-80 ℃保存。

1.2 細胞系

貓腎傳代細胞(F81)購自中國科學院細胞庫；細胞按常規消化傳代，37 ℃靜置培養。

1.3 主要試劑

TaqDNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司；MagPure Viral RNA Kit購自Magen公司；DMEM、胎牛血清購自Gibco公司；犬細小病毒熒光定量試劑盒購自書扁科技有限公司；PEG 8000購自Scientan公司。

1.4 犬細小病毒的檢測

1.4.1 核酸提取

取0.25 g的糞便樣品加入含1 mL PBS的EP管中，溶解混勻后，按MagPure Viral RNA Kit說明書進行核酸提取。

1.4.2 熒光定量PCR

根據犬細小病毒熒光PCR檢測試劑盒說明書進行操作，對于每一個反應體系：PCR預混液20 μL，Taq酶0.25 μL，DNA 5 μL。程序設置如下：94 ℃ 3 min；94 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s(收集熒光)，40個循環。

1.5 病毒的分離與鑒定

1.5.1 病毒的分離

取陽性病料0.5 g，用DMEM細胞營養液10倍稀釋，振蕩器充分混勻，5 000 r/min離心10 min，取上清，經0.22 μm微孔濾膜過濾后，置-30 ℃凍存備用。選擇剛剛長滿單層的F81細胞，倒掉培養液，用PBS浸洗，加入600 μL病毒懸液，置于5% CO2，37 ℃培養箱中吸附 60 min，之后取出培養瓶，用無血清培養基清洗細胞，然后加入 10 mL 含2%胎牛血清的DMEM培養基，置溫箱中繼續培養3～5 d，每日觀察細胞生長狀態是否出現細胞病變；對不同代次培養物進行熒光定量PCR檢測，連續3代未檢出陽性且沒有細胞病變者，判為陰性。將接毒細胞液置于-80 ℃冰箱中保存備用。利用Reed-Muench法計算病毒的TCID50。

1.5.2 病毒的鑒定

將分離到的病毒使用PEG 8000進行濃縮后，在透射電鏡下進行病毒形態的觀察。

1.6 基因片段的cDNA克隆、鑒定和測序

根據GenBank上已發表的犬細小病毒VP2基因序列，進行引物的設計及合成，提取病毒基因，具體步驟按照說明書進行。得到片段大小相符的PCR產物送桑尼生物有限公司測序。

1.7 繪制系統發育樹

借助MEGA6軟件，確定這4株犬細小病毒VP2基因的遺傳分類情況。參考菌株信息見表1。

表1 參考毒株背景信息

續表1

2 結果

2.1 上海地區犬細小病毒病流行情況

對上海地區犬類留驗場、養殖場以及各免疫點采取定期的集中監測，共采集糞便樣品796份，陽性率為30.65%。其中，流浪犬的糞便樣品675份，陽性率為34.52%；家養犬的糞便樣品121份，陽性率為9.10%。不同月份的犬細小抗原陽性率見圖1。

圖1 上海地區犬細小病毒病流行情況

2.2 病毒分離和細胞病變

將檢測陽性的犬糞便樣品處理后，接種F81細胞，其中4個組在接毒細胞的前2代沒有出現明顯病變，但是經過熒光定量PCR檢測發現Ct值明顯下降，傳至第3代細胞出現脫落、崩解和破碎及腫脹圓縮、拉網等細小病毒特有的細胞病變(CPE)。在細胞培養96 h時出現明顯的CPE，陰性對照未出現CPE(圖2)。選擇其中一株繼續傳代，傳至第17代后測定其滴濃度為107.0TCID50/mL。

圖2 CPV在F81細胞中產生的CPE(200×)

2.3 病毒形態

在電子顯微鏡下觀察，病毒呈現二十面體立體對稱，無囊膜，直徑為20 nm左右的典型細小病毒樣粒子(圖3)。

2.4 繪制系統發育樹以及氨基酸序列分析比較

將CPV/CHINA/SH-1進行了全基因測序， GenBank登錄號為：MN840830。使用MEGA6對分離到4株CPV VP2基因進行遺傳演化分析(圖4),表明分離到的毒株既有2c型，也存在2b型。通過分析可以看出，本次分離到的毒株與同一亞型的在我國分離到的毒株親源關系較近。此外，在2c亞型中，我國國內分離的CPV-2c已經與國外分離得到的CPV-2c形成了明顯的兩個分支，說明我國的CPV在進化過程中呈現出一定的地域特性。另外，從結果上看犬細小病毒的疫苗株與本次分離到的毒株親緣性較遠，提示現有疫苗對目前所流行的犬細小病毒的保護效果需要進行新的評估。

圖3 分離到的CPV電鏡形態學觀察

● 本研究中得到的分離株

3 討論

犬細小病毒病是臨床上最常見的犬類疾病之一，我國曾經主要流行的是CPV-2a亞型[11]，但在2010年以后，開始陸續報道CPV-2c的出現[12]。目前世界各地許多地區均報道了CPV-2c的出現，韓國也于最近首次報道了感染CPV-2c的病例[13]。這說明犬細小病毒不僅在持續變異，同時還以很快的速度傳播，并具有跨區傳播的能力。在臨床上普遍認可的治療方法是對癥治療，在最近的幾項臨床研究中發現，用重組貓干擾素治療，可以降低死亡率，更快地改善臨床癥狀[14]。而在預防方面，CPV由于可以在環境中長期存在，且能夠在很長的一段時間內保持感染性[15]，因此定期的疫苗接種格外重要。現有的針對CPV的疫苗類型有弱毒苗、亞單位疫苗、滅活苗以及核酸疫苗。市面上流行的CPV疫苗以弱毒苗為主，其在防控犬細小病毒病的過程中起到了重要的作用。只是目前在全世界范圍內，對于疫苗的接種還并未有一個明確、科學的標準，而幼犬由于受母源抗體的干擾，在疫苗接種的時間上也存在爭議。研究表明，幼犬在初次免疫后隔5周或6周應當重新接種一次疫苗，其原因是，加強免疫有助于高水平抗體保持較長時間并減少母源抗體的干擾，從而起到較好的保護效果[16]；而成年犬則至少應該每3年接種一次疫苗[17]。

在CPV的持續變異的壓力下，對區域內犬細小病毒的持續監測，仍是第一時間對其進行有效防控的前提。本研究對2019年上海地區犬類留驗場以及各寵物免疫點進行了CPV的定期集中監測，結果表明，CPV在流浪犬中的陽性率明顯高于家養犬(分別為34.52%和9.10%)，此外不同月份CPV的陽性率也存在一定差異，這提示我們，氣候、溫度等環境因素也是防控過程中需要注意的。

對陽性糞便樣品進行了CPV的分離，成功獲得4株CPV毒株，隨后對4株毒株的VP2基因進行測序，并繪制基因進化樹。結果顯示，本次分離到的犬細小病毒中，1株屬于CPV-2c型，其余3株屬于CPV-2b型，而且CPV的疫苗株與本次分離到的毒株親緣性較遠，提示現有疫苗對上海地區所流行的CPV的保護效果需要進行重新評估。

本次研究結果提示，上海地區CPV呈現出多亞型的混合流行，并且在長期進化和免疫壓力下正在發生持續的變異，從而導致了防控難度進一步加大，這可能也是目前臨床上CPV感染病例逐漸增多和免疫犬發病的重要原因之一[18]。對CPV的長期持續監測，不僅能夠第一時間了解目前上海地區CPV的流行與變異情況，還能夠以此來實時調整防控手段，改進防控技術，對上海地區養犬業有著重大意義。