地塞米松對(duì)刺鼠基因相關(guān)蛋白神經(jīng)元和阿片促黑素皮質(zhì)素原神經(jīng)元功能活性的影響

吳漢宇，張瑞雪，王麗娜

(廣東省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

采食是動(dòng)物維持生命活動(dòng)的基本生理過(guò)程，也是畜牧業(yè)生產(chǎn)中至關(guān)重要的一環(huán)。畜禽采食量的高低直接影響到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝入量及生產(chǎn)性能的發(fā)揮，而生產(chǎn)中的各種應(yīng)激因素均會(huì)影響畜禽的采食。已有的研究表明，應(yīng)激發(fā)生時(shí)動(dòng)物機(jī)體的下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamus-pituitary-adrenal，HPA)會(huì)被激活，由腎上腺釋放糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)調(diào)控全身的應(yīng)激反應(yīng)[1]。GC是腎上腺皮質(zhì)分泌的一種甾體激素，主要分為皮質(zhì)酮和皮質(zhì)醇。GC作為下丘腦-垂體-腎上腺軸上最末端的調(diào)節(jié)因子會(huì)引起機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)以及一系列的其他生理反應(yīng)。當(dāng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，腎上腺分泌的GC會(huì)顯著增加。現(xiàn)有的研究表明，熱應(yīng)激能夠顯著增加豬血清皮質(zhì)酮水平并顯著降低其采食量[2]。運(yùn)輸應(yīng)激也會(huì)顯著增加豬血清的皮質(zhì)酮水平，并且表現(xiàn)為食欲不振以及精神萎靡[3]。熱應(yīng)激可以將小鼠血清中皮質(zhì)酮的含量在10 min內(nèi)提高至400 ng/mL、40 min內(nèi)提高至700 ng/mL[4]。

采食主要是由下丘腦中能促進(jìn)食欲或抑制食欲的神經(jīng)肽神經(jīng)元調(diào)控的。在下丘腦中，刺鼠基因相關(guān)蛋白(agouti gene-related protein，AgRP)神經(jīng)元的激活會(huì)導(dǎo)致食欲的增加和覓食行為的增加[5]，而阿片促黑素皮質(zhì)素原(proopiomelanocortin，POMC)是抑制食欲形成的神經(jīng)元[6-7]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生應(yīng)激時(shí)，會(huì)抑制動(dòng)物的采食量，血清皮質(zhì)激素水平會(huì)上升[8]。有研究表明，熱應(yīng)激會(huì)顯著降低肉仔雞AgRP的mRNA表達(dá)量[9]。已知AgRP是介導(dǎo)黑皮質(zhì)素致厭食信號(hào)的4型黑皮質(zhì)素(melanocortin 4，MC-4)受體的天然拮抗劑，應(yīng)激誘導(dǎo)AgRP表達(dá)降低，也可能通過(guò)激活黑皮質(zhì)素信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)抑制食物攝入[10]。除此之外，急性束縛應(yīng)激可以激活下丘腦中的POMC神經(jīng)元[11]。然而各種應(yīng)激對(duì)中樞食欲神經(jīng)元的影響是否是GC的直接作用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究選擇小鼠N38和POMC細(xì)胞系為研究對(duì)象，用人工合成的GC——地塞米松(dexamethasone，DXMS)處理食欲相關(guān)神經(jīng)元來(lái)探究其對(duì)下丘腦食欲調(diào)控主要神經(jīng)元的影響。通過(guò)研究DXMS對(duì)兩種食欲相關(guān)細(xì)胞的神經(jīng)元興奮性、細(xì)胞活力、應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)，以及對(duì)食欲激素表達(dá)分泌的調(diào)控，探討DXMS對(duì)兩種食欲神經(jīng)元功能活性的影響及其可能的分子機(jī)制。研究結(jié)果將有助于揭示應(yīng)激對(duì)中樞食欲神經(jīng)元的直接作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

小鼠下丘腦N38細(xì)胞系和POMC細(xì)胞系均購(gòu)自Cellutions Biosystems。

1.2 主要試劑

DXMS購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，胎牛血清、 LG-DMEM購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司，Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購(gòu)自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司，TRIzol總RNA提取試劑盒購(gòu)自廣州美基生物科技有限公司，BCA法總蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司，引物購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)自上海貝博生物科技有限公司， AgRP抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司，c-Fos抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，POMC抗體購(gòu)自Abcam公司，GR抗體購(gòu)自Abclonal公司，β-actin抗體購(gòu)自Bioworld公司。

1.3 細(xì)胞的培養(yǎng)

在細(xì)胞復(fù)蘇后，加入10%胎牛血清的LG-DMEM完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至25 cm2的培養(yǎng)瓶中并放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待25 cm2培養(yǎng)瓶中細(xì)胞密度達(dá)到 90%后進(jìn)行傳代，傳至75 cm2的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%后，將細(xì)胞接到6孔板中，待板中的細(xì)胞長(zhǎng)至80%后，分別用0 ng/mL，400 ng/mL和700 ng/mL的DXMS處理細(xì)胞，分別在處理后1 h和3 h檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)的變化。

1.4 細(xì)胞活力檢測(cè)

細(xì)胞活力用CCK-8試劑盒檢測(cè)，檢測(cè)具體步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以每孔約8 000個(gè)細(xì)胞的密度接種到96孔板，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)。將細(xì)胞放置在5%CO2，37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到85%，用DXMS分別處理細(xì)胞1 h和3 h后，向每孔中加入10 μL CCK試劑，重新將96孔板放入培養(yǎng)箱中，0.5～4 h后，在酶標(biāo)儀上選定波長(zhǎng)為450 nm并測(cè)定其吸光值OD450，吸光值大小反映細(xì)胞的活力情況。

1.5 總RNA抽提和熒光定量PCR(qPCR)

細(xì)胞使用總RNA抽提試劑盒進(jìn)行抽提，抽提的具體步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定抽提出的總RNA的濃度，取2 μg總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測(cè)RNA完整性。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用qPCR方法檢測(cè)AgRP，POMC，c-Fos，糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)和鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptor，MR)mRNA的表達(dá),以次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶1(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，HPRT1)作為內(nèi)參(具體引物序列見(jiàn)表1)。

表1 引物序列

1.6 蛋白的提取和Western blot

細(xì)胞總蛋白采用RIPA裂解液抽提，在6孔板中加入200 μL RIPA裂解液，并加入10 mol/L的蛋白酶抑制劑，放置在4 ℃冰箱裂解0.5 h，取出后刮板,并將裂解的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管,4 ℃，12 000 r/min離心15 min。蛋白濃度用BCA試劑盒測(cè)定，具體步驟按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)562 nm波長(zhǎng)下的吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算后得到蛋白濃度的數(shù)據(jù)，細(xì)胞蛋白分裝變性后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ占?xì)胞培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移750 μL至離心管，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，去除細(xì)胞碎片后放于真空濃縮儀中，中溫濃縮3 h，取20 μL變性并分裝，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肳estern blot方法檢測(cè)AgRP，c-Fos，POMC和GR的蛋白表達(dá)水平，以及內(nèi)參β-actin的表達(dá)。

1.7 細(xì)胞免疫熒光化學(xué)

步驟為細(xì)胞爬片、細(xì)胞接板、細(xì)胞收板、4%多聚甲醛固定、5%山羊血清封閉、0.4% Triton X-100打孔、一抗4 ℃孵育過(guò)夜、熒光標(biāo)記的二抗室溫避光孵育、DAPI復(fù)染細(xì)胞核、封片，在免疫熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)弱并拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,試驗(yàn)中所有數(shù)值均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,以P<0.05和P<0.01作為差異顯著和差異極顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DXMS對(duì)N38神經(jīng)元和POMC神經(jīng)元興奮性的影響

DXMS處理N38細(xì)胞和POMC細(xì)胞后，神經(jīng)元興奮性標(biāo)志基因c-Fos表達(dá)的變化見(jiàn)圖1。

注：DAPI. 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)細(xì)胞核染色；Merge. c-Fos和DAPI兩個(gè)染色結(jié)果重疊的結(jié)果；A、B. DXMS處理N38細(xì)胞；C、D. DXMS處理POMC細(xì)胞

免疫熒光c-Fos染色結(jié)果表明，用400 ng/mL和700 ng/mL DXMS分別處理N38細(xì)胞1 h和3 h，均能夠顯著降低c-Fos表達(dá)(圖1A、圖1B)。而用相同劑量DXMS分別處理POMC細(xì)胞1 h和3 h后，對(duì)c-Fos的表達(dá)無(wú)顯著影響(圖1C、圖1D)。結(jié)果表明，DXMS處理能夠顯著抑制N38神經(jīng)元的興奮性，且對(duì)POMC神經(jīng)元的興奮性無(wú)顯著影響。

Western blot 結(jié)果同樣表明，DXMS對(duì)N38細(xì)胞c-Fos蛋白表達(dá)有抑制作用(圖2A、圖2B、圖2C)。qPCR結(jié)果顯示，用400 ng/mL和700 ng/mL DXMS處理N38細(xì)胞3 h后，兩種濃度均能夠顯著地降低c-Fos 的mRNA表達(dá)量(圖2D)。

注：*表示差異顯著，P<0.05，**表示差異極顯著，P<0.01

2.2 DXMS對(duì)N38和POMC細(xì)胞功能的影響

通過(guò)DXMS處理AgRP神經(jīng)元，進(jìn)一步探索其對(duì)AgRP分泌和表達(dá)的影響。Western blot檢測(cè)AgRP蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),DXMS對(duì)AgRP蛋白表達(dá)有顯著的抑制作用；細(xì)胞分泌AgRP的結(jié)果顯示，在用DXMS處理N38細(xì)胞1 h后，能夠顯著降低AgRP的分泌，而在處理3 h后細(xì)胞分泌的AgRP僅有顯著下降的趨勢(shì)(圖3A和圖3B)。qPCR檢測(cè)細(xì)胞AgRP mRNA表達(dá)的結(jié)果顯示，在1 h時(shí)，400 ng/mL的DXMS能夠顯著降低AgRP的mRNA表達(dá)量，在3 h時(shí)，兩種濃度的DXMS均能夠顯著降低AgRP的mRNA表達(dá)量(圖3C)。以上說(shuō)明DXMS能夠顯著抑制AgRP的表達(dá)和分泌。另外，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，DXMS對(duì)POMC神經(jīng)元分泌POMC無(wú)顯著影響(圖4)。

A、B. 分別是DXMS處理N38細(xì)胞1 h和3 h， Western blot檢測(cè)AgRP蛋白表達(dá)和分泌；C. qPCR檢測(cè)DXMS處理N38細(xì)胞AgRP mRNA表達(dá)和分泌

圖4 DXMS處理POMC細(xì)胞1 h和3 h后POMC蛋白分泌的變化

2.3 DXMS對(duì)N38細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體和鹽皮質(zhì)激素受體表達(dá)的影響

qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，用兩種濃度的DXMS處理1 h，均能顯著降低GR的mRNA表達(dá)，處理3 h，僅400 ng/mL的DXMS能顯著降低GR的mRNA表達(dá)；兩種濃度的DXMS均對(duì)MR的mRNA表達(dá)量無(wú)顯著影響(圖5A、圖5B)。Western bolt檢測(cè)結(jié)果顯示，DXMS能夠顯著抑制N38細(xì)胞GR的蛋白表達(dá)量(圖5C、圖5D)。

A、B. qPCR檢測(cè)DXMS處理N38細(xì)胞后GR、MR mRNA的表達(dá)；C、D. Western blot檢測(cè)DXMS處理N38細(xì)胞后GR蛋白的表達(dá)

2.4 DXMS對(duì)N38神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響

CCK-8試劑盒結(jié)果顯示，在DXMS處理1 h，僅400 ng/mL DXMS能夠顯著降低細(xì)胞活力，而在DXMS處理3 h，兩種濃度的DXMS均能夠顯著降低N38細(xì)胞的活力(圖6)。

圖6 DXMS處理N38細(xì)胞1 h(A)和3 h(B)后細(xì)胞活力的變化

3 討論

c-Fos是神經(jīng)元激活的一個(gè)標(biāo)志基因。在本研究中，DXMS處理AgRP神經(jīng)元后，c-Fos表達(dá)量的下降提示DXMS抑制AgRP 神經(jīng)元的激活，而DXMS處理POMC神經(jīng)元對(duì)其c-Fos的表達(dá)無(wú)顯著影響。已有研究表明，斷奶應(yīng)激能顯著增加仔豬血清皮質(zhì)酮水平，并抑制下丘腦c-Fos的表達(dá)[12]；運(yùn)輸應(yīng)激能夠顯著降低豬室旁核中c-Fos的表達(dá)[13]；高水平的循環(huán)皮質(zhì)酮會(huì)抑制室旁核中c-Fos的表達(dá)[14]；在反復(fù)束縛應(yīng)激下，杏仁核、皮層、海馬和腦干內(nèi)的神經(jīng)元的c-Fos激活顯著降低[14]；在社會(huì)心理應(yīng)激下會(huì)顯著降低伏隔核中c-Fos的激活[15]。除此之外，足部刺激后終紋床核的c-Fos水平會(huì)顯著升高[16]；強(qiáng)迫游泳應(yīng)激并不改變視上核中c-Fos的表達(dá)[14]。在以往的研究中可以發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激對(duì)中樞c-Fos的作用是復(fù)雜的，不同的刺激強(qiáng)度、刺激類型以及不同腦區(qū)會(huì)導(dǎo)致c-Fos表達(dá)的不同，而其中具體的機(jī)制還有待研究。相似的是，在本研究中用DXMS處理3 h能在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)水平上抑制N38細(xì)胞c-Fos的表達(dá)，而用DXMS處理N38細(xì)胞1 h，僅能在翻譯水平上抑制c-Fos 的表達(dá)，說(shuō)明在處理時(shí)間較短的狀態(tài)下，c-Fos 在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的調(diào)節(jié)過(guò)程中存在差異。

下丘腦在食欲的形成中有著重要的作用，它主要通過(guò)兩種相反的神經(jīng)元分支來(lái)調(diào)控食欲。一種神經(jīng)元是促進(jìn)食欲的神經(jīng)元，有神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y, NPY)和AgRP；另一種神經(jīng)元是厭食神經(jīng)元，有POMC、可卡因安非他明調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(cocaine and amphetamine regulated transcript，CART)[9]。已有研究表明，AgRP的神經(jīng)元的激活會(huì)導(dǎo)致食欲過(guò)高并增加覓食行為，相反當(dāng)AgRP神經(jīng)元被抑制時(shí)食欲會(huì)減退[5]。除此之外，皮下注射皮質(zhì)酮能使蛋雞的AgRP mRNA表達(dá)降低，并導(dǎo)致蛋雞采食量的下降[17]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生應(yīng)激時(shí)，會(huì)抑制動(dòng)物的采食量，血清皮質(zhì)激素水平會(huì)上升，抑制AgRP的表達(dá)和分泌，如急性和反復(fù)束縛會(huì)減少表達(dá)AgRP的細(xì)胞數(shù)量[18]；短暫的足部電擊會(huì)降低大鼠下丘腦弓狀核中的AgRP mRNA水平[19]。而這與本研究的結(jié)果一致，本研究用DXMS處理能夠顯著抑制N38細(xì)胞AgRP的表達(dá)和分泌。N38細(xì)胞是小鼠下丘腦AgRP神經(jīng)元細(xì)胞系，主要分泌AgRP，能夠促進(jìn)食欲。

POMC是抑制食欲形成的神經(jīng)元，當(dāng)機(jī)體發(fā)生應(yīng)激時(shí)，會(huì)促進(jìn)POMC的表達(dá)和分泌。熱應(yīng)激會(huì)顯著提高肉仔雞POMC mRNA的表達(dá)量[9]；皮質(zhì)酮給藥顯著增加肉雞POMC mRNA的表達(dá)量，但對(duì)蛋雞的POMC mRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響[17]；電刺激能增加大鼠和小鼠下丘腦中MC-4受體和POMC mRNA的表達(dá)[20]；強(qiáng)迫游泳引起POMC神經(jīng)元活化[11]。除此之外，也有研究認(rèn)為，當(dāng)下丘腦GC增多時(shí)， POMC的表達(dá)卻無(wú)顯著差異[21]。而在本研究中用DXMS處理POMC細(xì)胞對(duì)其POMC的分泌無(wú)顯著影響，而這與后者的研究的結(jié)果是相符的。

已有的研究表明，10 μmol/L和100 μmol/L的DXMS處理人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系會(huì)顯著降低其細(xì)胞活力[22]；皮質(zhì)酮處理豬海馬神經(jīng)元6 d，能夠顯著降低其神經(jīng)元活力[23]。而本研究的結(jié)果同樣也表明，DXMS處理能夠顯著抑制AgRP神經(jīng)元的活力，除此之外，熱應(yīng)激會(huì)顯著增加大鼠大腦皮層神經(jīng)元的細(xì)胞死亡率[24]，該研究也同樣支持了本文的結(jié)果。綜上，DXMS可能會(huì)通過(guò)損傷AgRP細(xì)胞活力來(lái)影響其功能的發(fā)揮。

GR和MR是GC下游的兩種受體。在本研究中，DXMS處理會(huì)導(dǎo)致AgRP神經(jīng)元的GR表達(dá)的顯著下調(diào)。而先前已有研究表明應(yīng)激后，GC能與GR結(jié)合形成復(fù)合物從而下調(diào)GR[25]，這與我們的研究是一致的。已知GR與AgRP基因的啟動(dòng)子區(qū)域中有糖皮質(zhì)激素受體效應(yīng)原件的結(jié)合位點(diǎn)[21,26]，表明GR可能在DXMS處理后引起的AgRP神經(jīng)元功能活性改變中起著重要的作用，而DXMS具體如何通過(guò)GR調(diào)節(jié)AgRP神經(jīng)元的機(jī)制尚未清楚。

總之，本研究結(jié)果表明DXMS不僅抑制了AgRP神經(jīng)元的興奮性，也影響了AgRP神經(jīng)元的功能發(fā)揮，而DXMS處理對(duì)POMC神經(jīng)元的功能活性無(wú)顯著影響。但是DXMS是否通過(guò)GR和AgRP啟動(dòng)子上的糖皮質(zhì)激素受體效應(yīng)原件發(fā)揮作用，或者是否通過(guò)細(xì)胞損傷介導(dǎo)AgRP神經(jīng)元功能的活化發(fā)揮作用，以及其作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。