蘇姜豬組織中SIRT4蛋白表達分布分析

王潔,黃欣愛，2,王利紅*

(1. 江蘇農牧科技職業學院， 江蘇 泰州 225300;2. 揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009)

SIRT4是沉默調節蛋白(sirtuin，sirt)家族中的一員，其在動物機體組織中的分布較為廣泛，具有NAD+依賴的蛋白脂酰胺酶、ADP-核糖體轉移酶和賴氨酸激酶的活性。在細胞生存、衰老和代謝等生物過程中，SIRT4通過谷氨酸脫氫酶(GDH)ADP核糖基化，限制GDH活性，影響谷氨酸代謝和細胞能量代謝，減少氨基酸刺激的胰島素顆粒分泌。此外，SIRT4還具有抑制丙酮酸脫氫酶活性，繼而影響脂肪酸氧化的功能[1-4]。在疾病防治方面，SIRT4具有調控低氧誘導的心肌凋亡，降低慢性阻塞性肺病的發病率，抑制腫瘤形成和增殖等功能[3]。桂林生[5]對秦川肉牛SIRT4基因SNPs及其與生長性狀和肉質性狀進行了關聯分析，在3′UTR區域檢測到g.16195C>A和g.16247A>G的 2個突變位點，g.16195C>A位點存在2種基因型，g.16247A>G 位點存在3種基因型，g.16247A>G以及 H4H3組合單倍型均與部分秦川肉牛生長發育和肉質性狀顯著關聯，表明SIRT4可以作為候選基因應用于秦川肉牛改良育種工作中。Jin等[6]對通城豬SIRT家族基因序列進行了檢測分析，在腦、心臟、腎臟、肺臟、胃、腸、腹脂、肌肉等組織中檢測到SIRT4 mRNA的表達。然而，截至目前，尚未見SIRT4蛋白在豬不同臟器組織中表達定位的研究。本研究以蘇姜豬為試驗對象，通過免疫組織化學和ELISA檢測方法分析不同臟器組織中SIRT4蛋白的表達與定位，為深入研究SIRT4蛋白在豬各組織中的功能，進而為蘇姜豬優質性狀的持續選育與提高提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及主要試劑

試驗動物：來自江蘇姜曲海種豬場。選取健康無病、系譜清楚、體重(25±0.65) kg左右的蘇姜豬公豬(去勢)和母豬各3頭，飼喂4個月，試驗豬的飼養管理方式和防疫措施均一致。

主要試劑：一抗SIRT4抗體(ab231137)、二抗羊抗兔(ab6721)均為英國ABCAM公司產品；SIRT4豬ELISA檢測試劑盒(Angle Gene, ANG-E31372P)購自南京奧青生物技術有限公司。

1.2 樣品采集

試驗豬飼喂4個月后屠宰，屠宰后立即采集豬的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、大腸、小腸等臟器組織和心肌、背最長肌、腿肌等肌肉組織。分別取上述各組織樣品，修整成約2 cm×2 cm的組織塊，置于甲醛溶液中固定，用于免疫組織化學檢測。另分別取每種組織樣品，并分成3份(用于重復試驗)，分裝在Eppendorf(EP)管中，置于液氮中，用于后續試驗的ELISA檢測。

1.3 免疫組織化學檢測

將各組織樣石蠟切片經脫蠟和水化處理后，用Tris-EDTA(pH=9)作為抗原修復液，微波高溫加熱進行熱修復，自然冷卻至室溫，用TBS洗滌3次后，3% H2O2封閉內源性過氧化物酶，室溫中孵育30 min，用TBS緩沖液(pH 7.4)浸泡后洗滌3次，以5%胎牛血清(BSA)均勻覆蓋組織，37 ℃血清封閉40 min，棄掉封閉液，使用5%goat-3%BSA-PBST稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜，取出切片室溫復溫1 h，用PBST浸泡5 min，清洗后加入酶標二抗，室溫孵育1 h；二氨基聯苯胺(DAB)顯色液顯色，以蘇木精復染細胞核后，梯度酒精脫水，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察染色結果。

1.4 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)

將組織樣用pH 7.0～7.2，0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液洗凈后，取約1.0 g 組織塊移至10 mL EP管中，加入適量磷酸鹽緩沖溶液和蛋白酶抑制劑PMSF，勻漿3次，13 000 r/min離心5 min，取上清，按照SIRT4 ELISA檢測試劑盒說明書操作，最后在450 nm波長下依序測量各孔的吸光度(OD 值)。

1.5 數據分析

試驗數據用“平均數±標準差”表示，用SPSS 19.0單因素方差分析(ANOVA)進行差異顯著性檢驗，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 SIRT4蛋白在蘇姜豬組織中的表達定位分布

通過免疫組織化學方法對蘇姜豬肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、胃、大腸、小腸等臟器以及心肌、背最長肌和腿肌組織中SRIT4蛋白表達分布進行檢測，結果見圖1。SIRT4蛋白免疫陽性顆粒主要分布于肺臟組織的肺泡上皮層和支氣管的黏膜層細胞(圖1A)，肝臟組織的肝細胞(圖1B)，脾臟組織的紅髓區細胞(圖1C)，腎臟組織的近曲小管和遠曲小管細胞(圖1D)，胃(圖1H)、大腸(圖1I)和小腸(圖1J)組織的腺細胞，心肌(圖1E)、背最長肌(圖1F)和腿肌(圖1G)組織的肌細胞質中。

A. 肺臟(100×)；B. 肝臟(200×)；C. 脾臟(100×)；D. 腎臟(200×)；E. 心肌(200×)；F. 背最長肌(200×)；G. 腿肌(200×)；H. 胃(100×)；I. 大腸(100×)；J. 小腸(100×)

2.2 蘇姜豬組織中SIRT4蛋白表達水平

通過ELISA方法檢測SIRT4蛋白在蘇姜豬肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、大腸、小腸的臟器組織，以及心肌、背最長肌、腿肌的肌肉組織中的表達水平，試驗結果見表1。統計分析公豬(去勢)和母豬各組織中SIRT4蛋白的表達量，分析結果顯示，公豬(去勢)胃和小腸組織中的表達量相對較高，顯著高于其他組織(P<0.05)，其次是大腸組織中的表達量(P<0.05)；母豬組織中，大腸和小腸組織中的表達量相對最高，顯著高于其他組織(P<0.05)。用豬組織中SIRT4蛋白表達量從高到低依次為大腸、小腸、腎臟、肝臟、背最長肌、腿肌、心肌、脾臟、胃、肺臟組織。

SIRT4蛋白除了在公豬(去勢)腎臟和大腸組織中表達量稍低于母豬外，其他組織中公豬SIRT4蛋白的表達量均高于母豬，在肝臟、脾臟、肺臟、胃、小腸、心肌、背最長肌、腿肌組織中SIRT4蛋白的表達量分別是母豬組織中表達量的1.02、1.24、1.48、1.80、1.04、1.48、1.09、1.27倍。統計分析公母蘇姜豬同一組織樣中SIRT4蛋白表達量，蘇姜公豬(去勢)肺臟、腿肌、胃和脾臟組織中SIRT4蛋白的表達量顯著高于母豬相應組織中表達量(P<0.05)。

表1 蘇姜豬組織樣中SIRT4蛋白表達量 pg/mL

3 討論

SIRT4蛋白作為sirtuins家族中的一員，在調控動物機體脂肪酸的氧化和能量代謝過程中發揮者至關重要的作用[7]。SIRT4是一種NAD+依賴的ADP核糖基化酶，抑制SIRT4基因表達可以在線粒體和核仁中刺激逆行信號的發生，其中涉及腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase， AMPK)、乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase)以及線粒體呼吸機能相關的因子，表明SIRT4基因在維持 ATP 的平衡中發揮關鍵的作用[8]。在豬的腦、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、胃、腸、腹脂、肌肉等組織中已檢測到SIRT4 mRNA的表達[6]。本研究通過ELISA和免疫組織化學方法在蘇姜豬的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、大腸、小腸等臟器組織，以及心肌、背最長肌、腿肌等肌肉組織中，均檢測到SIRT4蛋白的表達，進一步表明SIRT4基因在豬組織中的表達具有廣泛性。本試驗的研究結果也驗證了Jin等[6]有關SIRT4 mRNA基因在豬臟器組織中的表達的研究結果。

通過免疫組織化學檢測方法，在蘇姜豬的心肌、背最長肌、腿肌組織的肌細胞中檢測到明顯的SIRT4免疫陽性顆粒，經ELISA測定，結果也顯示SIRT4蛋白在肌肉組織中表達量相對較高，表明SIRT4在肌肉組織收縮運動過程中發揮著重要的作用。Liu等[9]研究表明，心臟中SIRT4還能夠影響前體半胱天冬酶向半胱天冬酶轉化的比率，進而發揮調控低氧誘導心肌凋亡的作用[9]。本試驗除肌肉組織外，在消化系統如胃、大腸、小腸的腺細胞中也檢測到明顯的SIRT4蛋白免疫陽性顆粒，表明SIRT4與腺細胞的功能密切相關。ELISA測定結果也顯示，消化系統中SIRT4蛋白表達量相對高于其他組織，表明SIRT4蛋白參與蘇姜豬消化系統的物質消化代謝過程。

腎臟的主要功能包括維持機體內水、電解質和酸堿平衡；產生多種激素，參與調節血壓、造血等生理活動；參與維生素D的活化；通過生成尿液，排泄體內的代謝產物等。通過免疫組織化學方法，在蘇姜豬腎臟組織的近曲小管和遠曲小管細胞中檢測到豐富的SIRT4免疫陽性顆粒，但在腎小球中分布極少，表明SIRT4在原尿的重吸收和離子的交換過程中具有重要作用。肝臟組織中SIRT4與過氧化物酶體增殖物激活受體-α(hepatic peroxisome proliferator activated receptor,PPAR-α)表達呈負相關，敲除SIRT4基因小鼠的肝臟中PPAR-α表達量升高，脂肪酸分解速度受到抑制，而過表達SIRT4則結果相反[10]。肺組織中，SIRT4的表達與部分炎癥因子的活性存在關聯，如Chen等[11]在香煙煙霧提取物處理過的人肺微血管內皮細胞中，發現 SIRT4 表達量明顯下降，在這些細胞中過表達SIRT4 后，能夠減弱血管細胞黏附分子1和選擇蛋白 E-selectin 的誘導，同時抑制 NF-κB、IL-1β和 TNF-α等炎癥因子的活性，說明SIRT4可能具有減緩慢性阻塞性肺病的發生率[11]。本試驗經免疫組織化學方法，在蘇姜豬肝細胞和肺組織肺泡上皮層和支氣管的黏膜層細胞中均檢測到豐富的SIRT4免疫陽性顆粒，表明SIRT4在蘇姜豬的肝功能和肺組織的氣體交換功能中具有重要的作用。

對比公(去勢)母蘇姜豬各組織中SIRT4蛋白表達量，結果顯示，除腎臟和大腸組織的表達量稍有不同外，公豬組織中SIRT4的表達量均相對高于母豬，特別是在胃、肺臟、脾臟和腿肌中的表達量顯著高于母豬。這表明，SIRT4在動物組織中的表達水平可能與性別、不同組織的物質和能量代謝強弱程度有關。

4 結論

通過ELISA和免疫組織化學檢測，SIRT4在蘇姜豬組織中的表達具有廣泛性，且SIRT4主要定位于肌肉組織的肌細胞、肺組織肺泡上皮和支氣管黏膜層細胞、肝臟肝細胞、脾臟紅髓區細胞、腎臟近曲小管和遠曲小管細胞、胃和腸組織腺細胞。不同組織之間SIRT4表達量存在一定差異，公豬(去勢)多數組織中SIRT4表達量相對高于母豬，特別是在物質和能量代謝旺盛的組織(如小腸、大腸、肝臟、腎臟)中有相對較高的表達量，表明SIRT4在蘇姜豬各臟器的物質能量代謝過程中具有重要的作用。