大蒜素對小鼠腹腔巨噬細胞的抗炎作用

金鑫，李鴻洋，李敬雙，郭曉麗，于洋

(錦州醫科大學食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121001)

大蒜為百合科蔥屬，二年生草本植物。大蒜營養豐富，嫩苗、花莖和鱗莖均可食用，用途廣泛，加工產品種類多樣，在國際貿易市場上占有重要地位，也是我國重要的出口創匯蔬菜。大蒜素是大蒜中含硫有機化合物的主要活性成分，對心血管疾病[1]和腫瘤疾病[2]有較好的治療作用，還有抗氧化[3]、抗菌[4]、抗炎[5]作用。建立小鼠炎性痛模型，大蒜素能降低腫脹，增強組織中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性, 降低丙二醛(MDA)含量，減弱白細胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、核轉錄因子κB(NF-κB)蛋白表達。表明大蒜素具有緩解疼痛作用，作用機制是抑制NF-κB信號通路和抗氧化應激反應[6]。建立大鼠腦缺血再灌注模型，發現大蒜素可能通過抑制小膠質細胞活化、釋放IL-1β來發揮抗炎作用[7]。然而，大蒜素對巨噬細胞抗炎作用的研究鮮有報道。

本研究體外建立脂多糖(LPS)誘導小鼠腹腔巨噬細胞炎癥模型，檢測大蒜素對腹腔巨噬細胞吞噬功能、白細胞介素6(IL-6)分泌、炎癥介質一氧化氮(NO)和環氧合酶2(COX-2)產生的影響，闡明大蒜素對巨噬細胞的抗炎活性。為大蒜素抗炎機制的深入研究奠定基礎，為大蒜素的開發，以及大蒜素在醫藥和飼料領域中的利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Balb/c小鼠(SPF級)，雄性，體重(20±2)g，8周齡，錦州醫科大學實驗動物中心飼養。

1.2 藥品及主要試劑

大蒜素(純度≥98%)為上海源葉生物科技生產；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)為天津浩連科技生產；胎牛血清(FBS)為鄭州九龍生物生產；RPMI-1640培養液、氯化銨(NH4Cl)和三羥甲基氨基甲烷(Tris)為南京安培化工科技生產；臺盼藍(Trypan Blue)和二甲基亞砜(DMSO)為上海展云化工生產；地塞米松為山西諾成制藥生產；COX-2、IL-6、NO試劑盒均為上海嵐派生物生產；LPS和四甲基偶氮唑鹽(MTT)為北京索萊寶科技生產。

1.3 制備巨噬細胞懸液

將小鼠頸部斷髓致死，用75%酒精浸泡消毒3 min。在超凈工作臺內無菌操作，腹腔注射PBS 4 mL，輕輕按摩腹部3 min。用注射器將腹腔液抽出放入離心管中，以1 500 r/min離心5 min，棄上清。加入Tris-NH4Cl 1 mL，靜置5 min，1 500 r/min離心5 min，棄上液，重復操作直至紅細胞全部裂解。沉淀細胞用RPMI-1640完全培基液懸起，并染色，計數，使活細胞活力達到95%以上，在5% CO2培養箱中37 ℃培養18 h，棄上清和未貼壁細胞，用RPMI-1640完全培養基將細胞密度調整至5×106個/mL。

1.4 中性紅吞噬試驗法檢測大蒜素對巨噬細胞吞噬功能的影響

參考甄慶潔等[8]方法進行試驗。設空白組、LPS組、地塞米松組(陽性對照組)、大蒜素單藥組、地塞米松和LPS復合藥組、大蒜素和LPS復合藥組，細胞培養用96孔板，每孔加入100 μL細胞懸液，每組設5個重復。空白組每孔加入100 μL RPMI-1640完全培養基，LPS組每孔加入100 μL含LPS的RPMI-1640完全培養基(LPS的終濃度為1 μg/mL)，地塞米松組每孔加入100 μL含地塞米松的RPMI-1640完全培養基(地塞米松終的濃度為80 μg/mL)，大蒜素單藥組每孔分別加入100 μL含不同濃度大蒜素的RPMI-1640完全培養基(大蒜素的終濃度為40、80、160和240 mg/mL)。37 ℃ 5% CO2培養24 h。地塞米松和LPS復合藥組每孔加入100 μL含地塞米松的RPMI-1640完全培養基(地塞米松的終濃度為80 μg/mL)。大蒜素和LPS復合藥組每孔分別加入100 μL含不同濃度大蒜素的RPMI-1640完全培養基(大蒜素終濃度為40、80、160和240 mg/mL)，37 ℃ 5% CO2培養2 h，再分別加入LPS(LPS終濃度為1 μg/mL)，培養22 h。每孔細胞用PBS洗滌后，加入1 g/L的中性紅生理鹽水100 μL，培養30 min，吸棄上清并用PBS洗滌3次，每孔加入細胞裂解液(醋酸和乙醇為1∶1)100 μL，4 ℃裂解12 h，酶標儀檢測570 nm處OD值。

1.5 ELISA法檢測大蒜素對巨噬細胞炎性介質及細胞因子的影響

參考安妮[9]方法進行試驗。用24孔細胞培養板，每孔加入l mL巨噬細胞懸液。設空白組、LPS組、地塞米松組(陽性對照組)、大蒜素單藥組、地塞米松和LPS復合藥組、大蒜素和LPS復合藥組，每組均設3個重復孔，與上述同樣方法給藥。培養細胞24 h后，4 ℃ 3 000 r/min離心15 min取細胞上清液，采用ELISA 試劑盒檢測COX-2、NO的產生和IL-6的分泌量，按試劑盒說明書進行操作。

1.6 統計學分析

SPSS 20.0統計軟件對試驗數據進行一維方差分析，數值以平均值±標準差表示。不同字母表示組間差異極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)，無統計學意義用相同字母表示(P>0.05)。

2 結果與分析

2.1 大蒜素對巨噬細胞吞噬功能的影響

吞噬功能檢測結果見表1。空白組與地塞米松組、大蒜素單藥組比較，空白組巨噬細胞的OD值極顯著(P<0.01)低于地塞米松組、大蒜素單藥組，表明大蒜素能夠提高巨噬細胞吞噬功能。大蒜素為濃度240 μg/mL時效果優于其他濃度組。

表1 大蒜素對巨噬細胞吞噬功能的影響(n=5)

空白組與LPS組比較：空白組巨噬細胞的OD值極顯著(P<0.01)低于LPS組，表明LPS能夠引起巨噬細胞炎性反應。

LPS組與地塞米松+LPS復合藥組、大蒜素+LPS復合藥組比較，LPS組巨噬細胞的OD值極顯著(P<0.01)低于地塞米松+LPS復合藥組、大蒜素+LPS復合藥組，表明大蒜素對脂多糖誘導小鼠腹腔巨噬細胞炎癥反應具有抑制作用。大蒜素濃度為240 μg/mL時效果優于其他濃度組。

2.2 大蒜素對巨噬細胞COX-2、NO的生成和IL-6分泌的影響

大蒜素對巨噬細胞COX-2、NO的生成和IL-6分泌的影響見表2和表3、表4。

表2 大蒜素對巨噬細胞COX-2生成的影響(n=3) IU/L

表3 大蒜素對巨噬細胞NO生成的影響(n=3) pg/mL

表4 大蒜素對巨噬細胞IL-6分泌的影響(n=3) pg/mL

空白組巨噬細胞COX-2、NO的生成和IL-6分泌與大蒜素40 μg/mL濃度組比較差異不顯著(P>0.05)；但空白組極顯著地高于地塞米松組、大蒜素80、160、240 μg/mL濃度組(P<0.01)，說明大蒜素能夠抑制巨噬細胞COX-2、NO的生成和IL-6分泌，大蒜素濃度為240 μg/mL時效果優于其他濃度組。

空白組與LPS組比較，空白組巨噬細胞COX-2、NO的生成和IL-6分泌極顯著低于LPS組(P<0.01)，表明LPS能夠引起巨噬細胞炎性反應。

LPS組與地塞米松+LPS復合藥組、大蒜素+LPS復合藥組比較，LPS組巨噬細胞COX-2、NO的生成和IL-6分泌極顯著高于地塞米松+LPS復合藥組、大蒜素+LPS復合藥組(P<0.01)，表明大蒜素對脂多糖誘導小鼠腹腔巨噬細胞炎癥反應具有抑制作用。大蒜素濃度為240 μg/mL時優于其他濃度組。

3 討論

巨噬細胞具有強大的吞噬功能，它可以吞噬入侵機體的各種有害異物。未活化的巨噬細胞吞噬作用有限，受到刺激的巨噬細胞進一步分化成熟，成為活化巨噬細胞，吞噬功能增強。巨噬細胞分泌多種細胞因子、干擾素和炎性介質。IL-6在急性炎癥反應中對多種細胞具有促炎作用，同時誘導肝組織產生急性反應蛋白[10]。NO的合成能力與抗炎作用密切相關，NO在巨噬細胞內合成，為干擾素或第二信號單獨作用時合成少量NO，對細胞不產生毒性作用，當干擾素和第二信號共同作用時合成大量NO，對細胞的毒性作用增強。炎癥反應產生多種細胞因子，可激活NO的產生，NO又促進多種細胞因子產生，引發瀑布式炎性反應[11]。COX主要分為COX-1和COX-2，其中COX-2為誘導型酶。炎性因素可誘導COX-2迅速合成，促進炎癥反應的發生和發展[12]。陳秀春等[13]證實大蒜素能夠提高巨噬細胞吞噬紅細胞數，提高巨噬細胞吞噬率和吞噬指數。楊慶輝等[14]探討大蒜素對于前列腺癌患者機體免疫功能的影響及其作用機制，發現大蒜素治療后前列腺液的COX-2、p38MAPK及血漿TNF-α、IL-6明顯降低。

本研究結果顯示，大蒜素對LPS誘導小鼠腹腔巨噬細胞炎癥反應時能夠增強巨噬細胞的吞噬功能，降低巨噬細胞COX-2、NO的生成和IL-6分泌，與上述研究結果相一致。大蒜素可能通過激活靜止的巨噬細胞，增強吞噬功能。活化的巨噬細胞分泌干擾素(IFN)，IFN和LPS共同作用巨噬細胞，誘導細胞內的一氧化氮合酶(iNOS)表達，iNOS催化精氨酸產生大量NO，NO與氧自由基(O2-)結合生成具有強氧化性的過氧化亞硝基(ONOO-)，增強對細胞的毒性作用，引發細胞炎性反應。NO又促進多種細胞因子產生，引發瀑布式炎性反應。活化的巨噬細胞分泌IL-6等細胞因子和COX-2等炎性介質，促進炎癥反應的發生和發展。通過iNOS與COX-2之間存在的“交叉感應”，共同參與炎癥的發生和發展。本研究LPS組COX-2、NO的生成和IL-6分泌均極顯著高于其他組，說明LPS誘導小鼠腹腔巨噬細胞炎癥反應是成功的。大蒜素各濃度組COX-2、NO的生成和IL-6分泌均極顯著低于LPS組，說明大蒜素對巨噬細胞的抗炎作用是有效的，但其抗炎作用機制還有待于深入研究。

4 結論

大蒜素可通過提高小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能、影響細胞因子分泌和炎癥介質的產生，從而發揮抗炎作用。大蒜素對其他細胞因子和炎癥介質的影響及抗炎機理有待于進一步研究。