H5N6亞型禽流感病毒HA和NA基因核酸標準物質的制備及分析

楊帆，馬玲，王瑋琳，李玥，劉金華，王偉利,*

(1. 長春海關技術中心，吉林 長春 130062；2. 吉林農業(yè)大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118)

H5N6亞型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)于1975年首次從美國綠頭鴨體內分離出來，曾以低致病性狀態(tài)在美國、德國、瑞典等國家的水鴨中流行，很少對禽類動物產生影響[1]。2013年12月，江蘇省一活禽市場首次監(jiān)測到H5N6亞型AIV[2]。不久，該疫情在老撾、越南、韓國、日本及東南亞等國的禽類中廣泛流行[3]。2015年8月，廣東清遠一家養(yǎng)殖場禽鳥患H5N6亞型禽流感，近3萬只禽鳥被撲殺處理[4]。2017年3月江西省約有1.5萬只雞發(fā)病；同年10月，甘肅、湖北等地發(fā)病家禽3.4萬多只。2018年3月廣西省發(fā)病禽數量達2.8萬只，同年下半年陸續(xù)發(fā)生5起H5N6亞型高致病性禽流感，共有8萬多只家禽被撲殺，監(jiān)測數據顯示，我國長三角以南地區(qū)疫情比較嚴重[5]。2014年5月，全球首例人感染H5N6亞型AIV的病例出現在中國四川省，隨后我國多個省市報告了人感染新型H5N6亞型AIV的情況[6]。2013年前，我國主要流行的H5亞型AIV有H5N1、H5N2亞型。2013年之后，H5亞型AIV流行的勢態(tài)呈現出以H5N1、H5N6和H5N8多種NA基因亞型共存的現象[7]。H5N6亞型AIV不僅對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經濟損失，還對公眾健康造成威脅，所以加強對H5N6亞型AIV快速、準確檢測非常重要。由于H5N6亞型AIV核酸檢測用的標準物質缺乏統(tǒng)一定量標準，為了保證PCR、熒光定量PCR及其他分子生物學核酸檢測的準確性，本研究針對H5N6亞型AIV的HA和NA基因進行擴增，構建出體外轉錄標準物質，為H5N6亞型AIV的HA和NA基因核酸檢測提供了有效的質控標準。

1 材料與方法

1.1 毒株

H5N6亞型滅活毒株A/Duck/GuangXi/1/2018(H5N6)、A/chicken/Guangdong/GD1602/2016(H5N6)和H5N8亞型滅活毒株A/Bar-headed-goose/Qinghai/2/2016(H5N8)，均由哈爾濱獸醫(yī)研究所動物流感基礎與防控研究團隊惠贈。H9N2亞型毒株A/Environment/Jilin/C186/2017(H9N2)，由長春海關技術中心禽與經濟動物疫病檢測實驗室保存。

1.2 主要試劑

Reverse Transcriptase M-MLV、JM109大腸桿菌化學感受態(tài)細胞、ScaⅠ限制性內切酶均為大連寶生物技術有限公司產品；pGEM-T Easy Vector SystemⅠ、RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-T7體外轉錄試劑盒為Promega公司產品；質粒提取試劑盒為Axygen公司產品；DNA凝膠回收試劑盒為北京四正柏生物科技公司產品；流感病毒H5N6亞型熒光RT-PCR檢測試劑盒為北京森康生物技術有限公司產品。

1.3 毒株的選定

參照禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測方法[8]，對H5N6亞型滅活毒株A/Duck/GuangXi/1/2018(H5N6)進行鑒定，同時對毒株的HA和NA基因進行序列分析，并與GenBank上發(fā)表的H5N6亞型流感病毒比對同源性，作為H5N6亞型禽流感病毒核酸檢測標準物質研制的參照毒株。

1.4 引物設計

從GenBank中下載已收錄的H5N6亞型禽流感代表毒株HA和NA基因的全長序列，采用DNAstar軟件進行同源性比對，選擇保守區(qū)域，使用Primer Premier 5軟件設計引物，并由吉林庫美生物科技有限公司合成(表1)。

表1 引物序列信息

1.5 HA、NA基因擴增和克隆

根據RNA提取試劑盒的使用說明書對H5N6亞型毒株的RNA進行提取，然后反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系：2×Es Taq MasterMix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL、加ddH2O補足至25 μL。反應條件:94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 2 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將獲得的產物純化回收后連接至pGEM-T Easy載體，轉化到JM109感受態(tài)細胞，取菌液加入含有X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)，選擇白色單一菌落用質粒提取試劑盒提取陽性質粒，PCR驗證后測序鑒定。

1.6 體外轉錄HA及NA基因

對測序正確的質粒用ScaⅠ限制性內切酶線性化處理，然后用Riboprobe System-T7試劑盒體外轉錄，反應體系：T7 Transcription 5× Buffer 20 μL、rNTPs (25 mmol/L ATP，CTP，GTP，UTP) 30 μL、Linear DNA template 30 μL、Enzyme Mix (T7) 10 μL、Nuclease-Free Water補足至100 μL。放入37 ℃恒溫箱4 h，然后加RQ1 RNase-Free DNase 2 μL，去除DNA模板，37 ℃孵育15 min，得到含有HA和NA基因的產物。用RNA提取試劑盒純化轉錄產物，純化后溶于1 mL無RNA酶的DEPC水中，得到含有HA和NA基因的cRNA溶液，即為陽性標準物質，命名為HA-cRNA和NA-cRNA。

1.7 測定標準物質含量、純度及分裝

HA-cRNA和NA-cRNA溶液的濃度和純度用酶標儀測定，OD260/OD280比值在1.8～2.0之間為純度高的RNA，比值低于1.8，說明RNA樣品有蛋白質或酚的污染，高于2.0表明可能有異硫氰酸殘存，需要重新抽提。根據所測濃度，計算溶液拷貝數，拷貝數/μL=6.02×1014×樣品濃度(ng/μL)/(RNA length×340)。最后將其分裝至0.2 mL離心管中，每管10 μL，共100管，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.8 標準物質檢測分析

1.8.1 體外轉錄產物驗證

對HA-cRNA和NA-cRNA溶液用去離子水進行梯度稀釋，取各自稀釋液為模板，用流感病毒H5N6亞型熒光RT-PCR檢測試劑盒進行驗證鑒定，繪制標準曲線。反應體系：cRNA模板10 μL，熒光RT-PCR反應液15 μL，酶混合物1 μL。反應條件：42 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min，94 ℃ 10 s，54 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40循環(huán)。

1.8.2 均勻性試驗

從-80 ℃取出HA-cRNA和NA-cRNA標準物質溶液各10管，置于冰盒上融化，然后用熒光RT-PCR試劑盒檢測，每管樣品為1組，重復3次檢測，10管樣品共檢測30次，一次上機操作完成。利用統(tǒng)計學方法中的單因素方差分析，對每管核酸物質的組間、組內均勻性做出評價。

1.8.3 穩(wěn)定性試驗

隨機抽取分裝好的HA-cRNA和NA-cRNA標準物質溶液各20份，進行10倍梯度稀釋。然后置于不同條件保存，每種條件存放5份為一批次。保存條件：25 ℃恒溫培養(yǎng)箱，1個月；4 ℃冰箱冷藏室，3個月；-20 ℃冷凍室，6個月；-80 ℃長期保存，為對照組。最后用AIVH5N6亞型熒光RT-PCR試劑盒對每種保存條件的5份樣品進行檢測，標定Ct值，采取兩樣本均數差異t檢驗分析其穩(wěn)定性。

1.8.4 特異性試驗

用流感病毒H5N6亞型熒光RT-PCR檢測試劑盒對HA-cRNA、NA-cRNA核酸標準物質、H5N8亞型滅活毒株A/Bar-headed-goose/Qinghai/2/2016(H5N8)、H5N6亞型滅活毒株A/chicken/Guangdong/GD1602/2016(H5N6)、H9N2亞型毒株A/Environment/Jilin/C186/2017(H9N2)核酸進行熒光RT-PCR擴增，驗證制備的HA和NA基因核酸標準物質HA-cRNA、NA-cRNA的特異性。

1.8.5 聯合標定與不確定度分析

將制備的HA-cRNA和NA-cRNA標準物質送往3家不同的實驗室，進行聯合定值。用熒光RT-PCR試劑盒對標準物質和已知核酸含量的病毒樣品進行檢測。利用已知樣品核酸含量的Ct值和拷貝數的對數值，制作標準曲線回歸方程，對未知含量的標準物質Ct值代入回歸方程，求出拷貝數。最后按照統(tǒng)計學方法分析3家實驗室檢測的結果，計算出標準物質的總不確定度。

2 結果

2.1 H5N6亞型AIV序列比對

用DNAstar軟件比對H5N6亞型禽流感毒株A/Duck/GuangXi/1/2018(H5N6)和14株GenBank中國內有代表性的H5N6亞型AIV HA和NA基因序列的同源性(圖1)。

圖1 H5N6亞型AIV HA基因、NA基因序列比對結果

圖1結果顯示，HA基因同源率為91.8%～99.8%，NA基因同源率為85.7%～99.5%，毒株A/Duck/GuangXi/1/2018(H5N6)可以作為研制H5N6亞型AIV核酸標準物質的參考毒株。

2.2 HA和NA基因擴增

用設計好的引物對H5N6亞型流感病毒的HA和NA基因全長片段PCR擴增。1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，HA、NA基因片段大小約為1 704 bp、1 413 bp，與預期相符(圖2)。

M. DL2000DNA分子質量;1. HA基因;2. NA基因;3. 陰性對照

2.3 重組質粒PCR鑒定

將擴增產物連接轉化后，得到含有HA和NA基因的重組質粒。經PCR鑒定，片段大小并無改變(圖3)。

M. DL2000 DNA分子質量;1. HA基因;2. NA基因;3. 陰性對照

2.4 標準物質純度、含量測定

用酶標儀對體外轉錄的HA-cRNA和NA-cRNA溶液測定，得出HA基因OD260/OD280為1.93，濃度為11.32 ng/μL；NA基因OD260/OD280為1.99，濃度為86.3 ng/μL。根據拷貝數換算公式計算出HA基因4.18×109拷貝數/μL，NA基因1.08×1011拷貝數/μL。

2.5 體外轉錄產物驗證

取濃度為108～104拷貝數/μL的HA、NA基因體外轉錄產物為模板，用熒光RT-PCR檢測試劑盒驗證鑒定，分別繪制標準曲線(圖4、圖5)。HA基因標準曲線回歸方程為：y=-3.593 2x+25.867，R2=0.997 1(x代表模板拷貝數的對數值，y代表Ct值,R2為相關系數)。NA基因標準曲線回歸方程為：y=-3.723x+35.174，R2=0.994 3。此結果表示Ct值與標準物質濃度呈現出良好的線性相關，具備可靠定量。

1～5. 4.18×108～4.18×104拷貝數/μL;6. 陰性對照

1～5. 1.08×108～1.08×104拷貝數/μL；6. 陰性對照

2.6 均勻性試驗

對隨機取出的10支HA-cRNA和NA-cRNA標準物質溶液，每個樣品用熒光RT-PCR檢測試劑盒檢測3次(圖6)，檢測所得數據用Excel工作表做單因素方差分析。表2結果顯示，HA和NA基因標準物質的F值均小于F臨界值，表明管內和管間差異不顯著，每管樣品中的核酸含量均可滿足標準物質對均勻性的要求。

表2 H5N6亞型AIV核酸標準物質單因素方差分析

2.7 穩(wěn)定性試驗

根據不同保存條件，測定濃度為4.18×107拷貝數/μL和1.08×107拷貝數/μL的HA-cRNA、NA-cRNA標準物質的Ct值，-80 ℃為對照組。采用兩樣本均數差異t檢驗的方法處理數據。表3、表4結果顯示，不同溫度條件下，自由度=4時，t單尾臨界值為2.132，根據自由度及顯著性水平(α=0.05)，得出|t|≤t0.1/2,4，因各檢測組P值均大于0.05，故相較于對照組，檢測組結果差異無統(tǒng)計學意義即差異不顯著。表明檢測組內的核酸含量穩(wěn)定性好且在不同溫度時間內無大幅度改變。

表3 HA-cRNA標準物質穩(wěn)定性試驗結果

表4 NA-cRNA標準物質穩(wěn)定性試驗結果

2.8 特異性試驗

HA-cRNA和NA-cRNA核酸標準物質特異性試驗結果見圖7。HA-cRNA和NA-cRNA、H5N6亞型滅活毒株、試劑盒中的陽性對照有S型擴增曲線，H9N2亞型毒株、H5N8亞型滅活毒株、試劑盒中的陰性對照無擴增曲線。即制備的HA和NA基因核酸標準物質可以應用于H5N6亞型AIV檢測試劑盒，并且不與其他亞型流感病毒產生交叉污染。

1.陽性對照；2.HA-cRNA；3.H5N6 AIV；4.NA-cRNA；5.H5N8 AIV；6.H9N2 AIV；7.陰性對照

2.9 聯合標定和不確定度分析

為得到獨立有效的結果，對協作標定的3家單位采取統(tǒng)一的試驗方案和結果分析方法。用熒光定量PCR標定Ct值，通過標準曲線來計算標準物質的具體含量(表5、圖8)。不確定度為3家單位標定結果計算的標準差，最后HA-cRNA、NA-cRNA標準物質含量的定值分別為(4.13±0.18)×109拷貝數/μL和(1.12±0.11)×1011拷貝數/μL。

表5 H5N6亞型AIV核酸標準物質定值結果 拷貝數/μL

A. 實驗室1；B. 實驗室2；C. 實驗室3

3 討論

近年來，我國多個省份的家禽養(yǎng)殖場暴發(fā)新型H5N6亞型高致病性禽流感，已經撲殺上百萬只家禽。周邊國家韓國、日本的養(yǎng)殖場、候鳥中也發(fā)生了H5N6亞型禽流感感染情況；隨后，老撾、越南等國家也相繼在家禽中檢測到這種病毒，H5N6亞型高致病性AIV已經在亞歐各國呈廣泛傳播趨勢，新出現的H5N6亞型流感病毒已經成為家禽和人群中的流行毒株[9]。有研究表明，H5N6亞型AIV是H5N1和H6N6亞型AIV基因重組的結果，其中至少6個基因來自于H5N1亞型高致病性禽流感[10]。H5N6亞型AIV的突變性和高死亡率，對禽類養(yǎng)殖業(yè)以及公共衛(wèi)生安全，乃至社會的穩(wěn)定造成了很大的影響[11]。因此，加強研究H5N6亞型AIV特異性，對AIV快速準確檢測和診斷非常重要。目前，國內外針對禽流感快速檢測最常采用RT-PCR、熒光定量PCR等分子生物學檢測方法，這些方法特異、敏感，能夠快速鑒定亞型，但是在檢測過程中需要設有陽性對照樣品，這是判斷該檢測反應成功與否的重要依據[12]。如果使用全病毒制備核酸標準物質會造成病原污染及生物安全問題，所以需要標準化和規(guī)范化使用核酸檢測用標準物質[13]。

本研究通過擴增出H5N6亞型AIV的HA和NA基因全長序列，避免了由于基因片段不完整導致檢測結果出現局限性的問題。采用基因克隆技術，將HA和NA基因連接至含T7聚合酶啟動子的pGEM-T Easy載體上，構建重組質粒，并通過體外轉錄獲得不具有生物感染性的HA-cRNA和NA-cRNA，作為H5N6亞型AIV HA、NA基因片段的核酸標準物質。利用熒光RT-PCR鑒定體外轉錄產物，并對標準物質進行初步定值。從檢測結果看HA-cRNA和NA-cRNA核酸標準物質的相關系數均大于0.99，且不同濃度與循環(huán)數之間呈現良好的線性相關。研究發(fā)現，HA-cRNA和NA-cRNA標準物質溶液組分均勻，檢測結果計算出的F值均小于F臨界值，即保存在同一PCR管內的標準溶液和保存在不同PCR管內的標準溶液之間的含量(拷貝數)，不存在明顯差異，組間組內精密度好。為了驗證HA-cRNA和NA-cRNA核酸標準物質的穩(wěn)定性，對檢測組和對照組的含量變化進行了監(jiān)測。數據分析表明，HA-cRNA和NA-cRNA核酸標準物質可以保存在25 ℃ 1個月、4 ℃ 3個月和-20 ℃ 6個月，且含量(拷貝數)沒有因為環(huán)境溫度的升高而降解，符合標準物質基本要求。特異性試驗結果表明，HA-cRNA和NA-cRNA可以用于檢測H5N6亞型AIV，與試劑盒中的陽性對照相比，擴增曲線無明顯差異，與其他亞型流感病毒同時擴增，其他亞型流感病毒未產生擴增曲線，表明制備的HA-cRNA和NA-cRNA核酸標準物質，在檢測過程中不受其他亞型流感病毒影響，無交叉污染發(fā)生。同時為了避免試驗誤差對核酸標準物質定值結果產生影響，本研究對不確定度進行了評定。由于B類不確定度主要來自加樣及樣品稀釋過程產生的誤差，定值結果中包含了這類不確定度，所以僅評定A類不確定度，即每家實驗室定值結果產生的標準差。HA-cRNA和NA-cRNA的定值結果和不確定度結果表明，制備的H5N6亞型AIV HA基因和NA基因核酸標準物質符合國家二級標準物質的制備要求。面對國內尚缺乏的H5N6亞型AIV核酸檢測標準物質，本研究研制出H5N6亞型AIV HA基因和NA基因核酸標準物質，既能保證實驗室生物安全，又可以避免實驗環(huán)境與儀器之間的交叉污染，在實際檢測中具有良好的適用性，為國內H5N6亞型AIV的核酸檢測提供了有效質控品，更好地滿足了臨床診斷中對核酸檢測標準物質的需要，同時也為其他亞型流感病毒核酸檢測標準品的研制打下了基礎。