輻照輔助接枝反應(yīng)提高大豆蛋白乳液凍融性質(zhì)

王玉瑩，張安琪，王 琳，周?chē)?guó)衛(wèi)，徐 寧*，王喜波*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）是蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%以上的全價(jià)蛋白質(zhì)，由于其具有兩親性質(zhì)，可以吸附在油-水界面以穩(wěn)定乳液，常被用作乳化劑[1-2]。但是蛋白質(zhì)乳液易受到外界因素的干擾，影響乳液穩(wěn)定性。如乳液在經(jīng)過(guò)凍融循環(huán)后，形成的冰晶會(huì)刺破界面膜，打破油-水的平衡，出現(xiàn)乳析、出油等失穩(wěn)現(xiàn)象[3]。

接枝反應(yīng)是一種常用的蛋白質(zhì)改性方法，加入糖鏈可增加油-水界面的厚度，增加空間位阻，有效地改善蛋白乳液的凍融穩(wěn)定性[4-5]。改性蛋白的疏水側(cè)鏈還能提高溶解性、乳化性等功能特性[6]。輻照作為一種新型的冷加工技術(shù)，具有高效率、低耗能、低成本、環(huán)保等特點(diǎn)，因此具有廣泛的應(yīng)用前景[7]。1980年聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織、國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)、世界衛(wèi)生組織宣布，輻照劑量在10 kGy以下認(rèn)定為沒(méi)有毒理學(xué)危險(xiǎn)；1997年世界衛(wèi)生組織廢除10 kGy的上限劑量；2003年國(guó)際食品法典委員會(huì)宣布在保證食品的感官特性、功能特性、結(jié)構(gòu)完整性和安全性的情況下，食品輻照劑量可高于10 kGy[7]。這從法規(guī)上保證了輻照技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用。輻照除了應(yīng)用于食品的殺菌和保鮮領(lǐng)域外，也能在蛋白質(zhì)制取和貯藏過(guò)程中改變蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的乳化性、持油性、持水性等理化性質(zhì)[8-9]。研究表明，SPI和大豆?jié)饪s蛋白經(jīng)10 kGy的γ射線(xiàn)輻照后，乳化特性均有所改善[10]。花生蛋白經(jīng)輻照后，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變，蛋白分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，疏水基團(tuán)暴露，導(dǎo)致各種功能性質(zhì)均有所改善，但輻照劑量進(jìn)一步增加時(shí)，致敏蛋白抗原性降低[11]。血漿蛋白經(jīng)過(guò)1、5、7、10 kGy的γ輻射后有序結(jié)構(gòu)減少，多肽鏈出現(xiàn)初始斷裂和隨后的聚集，輻射改變了血漿蛋白粉末和溶液的物理化學(xué)性質(zhì)[12]。可見(jiàn)，輻照通過(guò)改變蛋白分子結(jié)構(gòu)來(lái)改善蛋白質(zhì)的功能特性。

輻照技術(shù)由于作用時(shí)間短、耗能低、效率高，逐漸發(fā)展為一種改性修飾方法。同時(shí)糖基化修飾等也可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)改性，將輻照與糖基化相結(jié)合的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用輻照輔助接枝反應(yīng)來(lái)提高SPI乳液的凍融特性，通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、出油率測(cè)定和光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)觀察對(duì)改性產(chǎn)物進(jìn)行性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析，以期拓寬蛋白質(zhì)改性領(lǐng)域，為綜合改性技術(shù)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粉 武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司；麥芽糖（maltose，M） 北京化學(xué)試劑廠；大豆油 九三糧油工業(yè)集團(tuán)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FJ300S-數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī) 上海隆拓儀器設(shè)備有限公司；高壓均質(zhì)機(jī) 北京同和友德科技有限公司；高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘銳離心機(jī)有限公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；恒溫磁力攪拌器 常州市凱航儀器有限公司；MS104TS分析天平上海花潮實(shí)業(yè)有限公司；冷凍干燥機(jī) 江蘇天翎儀器有限公司；DYY-12電腦三恒多用電泳儀 北京君意儀器廠；ST5凝膠成像儀 上海銀澤儀器設(shè)備有限公司；數(shù)顯型恒溫水浴鍋 江蘇金怡儀器科技有限公司；YS-100YS-100生物顯微鏡 上海蔡康光學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

將100 g脫脂豆粉溶于1 000 mL去離子水中，攪拌均勻后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5，離心后收集上清液，用HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5，4 ℃靜置過(guò)夜。棄去上清液后離心得沉淀。用去離子水洗滌3 次，將洗滌得到的沉淀用去離子水復(fù)溶后，再用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，然后進(jìn)行冷凍干燥得SPI[13]，凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.23%。

1.3.2 輻照糖基化SPI的制備

將SPI與麥芽糖按照質(zhì)量比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1溶解于0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液，25 ℃下攪拌4 h，配成一定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2%、3%、4%、5%、6%）的溶液（SPI＋M）。加入少量的疊氮鈉（終質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%）以防滋生微生物，置于4 ℃冰箱中水化過(guò)夜。第2天取出后室溫下攪拌直至液體溫度至25 ℃，取樣品溶液100 mL置于輻照裝置（輻射源60Co γ）下進(jìn)行輻照反應(yīng)（輻照劑量為2.5、5、7.5、10、12.5 kGy）。輻照后樣品，冷凍干燥制成干粉即為輻照糖基化SPI（SPI-M）。

1.3.3 接枝度測(cè)定

取2 0 0 μ L樣品加入4 m L鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）試劑中混合均勻后于35 ℃水浴鍋中反應(yīng)2 min，于340 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度A340nm，另取200 μL去離子水加入OPA試劑中作為空白對(duì)照。OPA試劑現(xiàn)用現(xiàn)配（取80 mg OPA、2 mL甲醇溶液、5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的SDS溶液、50 mL硼砂溶液、100 μL β-巰基乙醇混合均勻，定容至50 mL）。接枝度按式（1）計(jì)算。

式中：A0為空白對(duì)照溶液吸光度；A1為接枝反應(yīng)后溶液吸光度。

1.3.4 褐變程度測(cè)定

配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL樣品溶液，以去離子水為空白對(duì)照，于420 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以吸光度表征褐變程度。

1.3.5 SDS-PAGE分析

分別使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的濃縮膠和13%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE。取20 μL樣品溶液與5 μL上樣緩沖液混合，沸水浴5 min。冷卻至室溫，取9 μL樣品溶液注入點(diǎn)樣孔。濃縮膠電壓設(shè)置為90 V，進(jìn)入分離膠后改為120 V，直至溴酚藍(lán)距離凝膠底部0.5 cm左右結(jié)束電泳，關(guān)閉電源，起膠。分別用考馬斯亮藍(lán)染色液和Schiff試劑進(jìn)行蛋白質(zhì)和糖蛋白染色[14]。

1.3.6 乳液制備及凍融循環(huán)

配制質(zhì)量濃度為20 mg/mL樣品溶液，將樣品溶液與大豆油按體積比9∶1混合，11 000 r/min均質(zhì)3 min形成粗乳液，再通過(guò)60 MPa高壓均質(zhì)形成微乳液。將乳液加入10 mL塑料管內(nèi)，于-18 ℃冰箱中冷凍24 h后在水浴鍋中解凍2 h，如此連續(xù)進(jìn)行3 次凍融循環(huán)[15-16]。

1.3.7 乳析指數(shù)測(cè)定

乳析指數(shù)按式（2）計(jì)算。

式中：HS表示乳清層高度/cm；HT表示乳液總高度/cm。

1.3.8 出油率測(cè)定

參考Palanuwech等[17]的方法，略作改動(dòng)。取8 g樣品乳液與2 g蘇丹III油溶液混勻，10 000×g離心20 min，取上層液于508 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，大豆油為空白，調(diào)零吸光度。出油率按式（3）計(jì)算。

式中：m0為蘇丹III油溶液質(zhì)量/g；me為乳液質(zhì)量/g；a為蘇丹III油溶液吸光度與離心后蘇丹III油溶液吸光度的比值；ωd為乳液中油相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%。

1.3.9 光學(xué)顯微鏡觀察

將待測(cè)樣品乳液搖勻后取10 μL置于載玻片，蓋上蓋玻片后置于顯微鏡觀察區(qū)，將目鏡調(diào)為400 倍進(jìn)行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示結(jié)果，運(yùn)用SPSS Statistics 20軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，采用Origin 8軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPI與麥芽糖質(zhì)量比對(duì)接枝物凍融特性的影響

固定SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，輻照劑量5 kGy，研究m（SPI）∶m（M）對(duì)接枝物凍融特性的影響。乳析指數(shù)是反映乳液凍融特性的重要指標(biāo)之一，乳液乳析指數(shù)越低，凍融特性越穩(wěn)定[18]。由圖1可知，糖的引入明顯降低了乳析指數(shù)，并且經(jīng)歷了3 次凍融循環(huán)后，m（SPI）∶m（M）為4∶1的乳液乳析指數(shù)最低，這是因?yàn)楫?dāng)反應(yīng)體系中糖的含量適量時(shí)，糖分子移動(dòng)空間變大，適量的糖與蛋白分子充分接觸發(fā)生接枝反應(yīng)，乳析指數(shù)降低。這與圖2的褐變程度和接枝度變化成反比，接枝度越高，乳析指數(shù)越低，凍融穩(wěn)定性增加。隨著麥芽糖含量的降低，褐變程度和接枝度均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，說(shuō)明美拉德反應(yīng)程度逐漸增加，但隨著麥芽糖含量的減少，較少的糖不足以與蛋白分子發(fā)生反應(yīng)，糖基化反應(yīng)程度降低[19]。考慮到凍融穩(wěn)定性，選取m（SPI）∶m（M）為4∶1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，與同類(lèi)研究[20-21]相比，糖的添加量減少了71%和77.8%，節(jié)約成本。

圖1 m （SPI）∶m（M）對(duì)輻照SPI-M乳析指數(shù)的影響Fig. 1 Effect of m(SPI)/m(M) ratio on creaming index of irradiated SPI-M

圖2 m （SPI）∶m（M）對(duì)輻照SPI-M接枝度和褐變程度的影響Fig. 2 Effect of m(SPI)/m(M) ratio on grafting reaction and browning degree of irradiated SPI-M

2.2 SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)接枝物凍融特性的影響

固定m（SPI）∶m（M）4∶1，輻照劑量5 kGy，研究SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)接枝物凍融特性的影響。由圖3可知，隨SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，乳析指數(shù)與對(duì)照組相比均明顯降低，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)乳析指數(shù)最低，表現(xiàn)出最佳的凍融特性，這與王喜波等[22]的研究結(jié)果類(lèi)似。由圖4可知，接枝度在質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%時(shí)最大，為29.7%，褐變程度也適中。可能是因?yàn)殡S著SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，自由氨基濃度增大，提高了自由氨基與糖分子的碰撞幾率，更易發(fā)生接枝反應(yīng)，但濃度過(guò)高時(shí)蛋白質(zhì)聚集，使得自由氨基含量降低[23]。適量的濃度促進(jìn)了接枝反應(yīng)，增加了界面膜的厚度，有效抵御了外界因素的干擾，乳液最穩(wěn)定[24]。考慮到凍融穩(wěn)定性，選取SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖3 SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)輻照SPI-M乳析指數(shù)的影響Fig. 3 Effect of SPI concentration on creaming index of irradiated SPI-M

圖4 SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)輻照SPI-M接枝度和褐變程度的影響Fig. 4 Effect of SPI concentration on grafting degree and brown degree of irradiated SPI-M

2.3 輻照劑量對(duì)接枝物凍融特性的影響

圖5 輻照劑量對(duì)輻照SPI-M乳析指數(shù)的影響Fig. 5 Effect of irradiation dose on creaming index of irradiated SPI-M

圖6 輻照劑量對(duì)輻照SPI-M接枝度和褐變程度的影響Fig. 6 Effect of irradiation dose on grafting degree and browning degree of irradiated SPI-M

固定SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，m（SPI）∶m（M）為4∶1，研究輻照劑量對(duì)接枝物凍融特性的影響。輻照提供的能量促使蛋白分子中的氫鍵、二硫鍵等配位鍵發(fā)生斷裂或重建，使蛋白分子發(fā)生脫氨、脫羧等一系列反應(yīng)，進(jìn)而改變蛋白分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)及聚集程度，使蛋白分子的功能特性發(fā)生變化[25-26]。由圖5可知，輻照處理后樣品的乳析指數(shù)明顯降低，7.5 kGy處理組的乳液表現(xiàn)出最佳的凍融特性。由圖6可知，隨輻照劑量增加，接枝度先增加后降低，在7.5 kGy處理組接枝度最大，為34.56%。可能是因?yàn)檩椪仗幚砗螅鞍追肿诱归_(kāi)程度增加，柔性變大，釋放出更多的疏水基團(tuán)，從而增強(qiáng)油-水界面的吸附作用，使得蛋白分子展開(kāi)，形成較厚的保護(hù)膜，阻止了尖銳的冰晶破壞油-水界面的平衡，進(jìn)而提高了乳液的凍融穩(wěn)定性[27]。由圖6可知，褐變程度隨輻照劑量的增加而變大，樣品的顏色變深，積累過(guò)多類(lèi)黑精會(huì)影響產(chǎn)物感官品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。綜合考慮，選取輻照劑量為7.5 kGy進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.4 相關(guān)性分析結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用SPSS Statistics 20軟件對(duì)接枝度和乳析指數(shù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，由表1可知，接枝度與凍融后的乳析指數(shù)具有顯著相關(guān)性。表明樣品乳析指數(shù)降低與發(fā)生接枝反應(yīng)有關(guān)。

表1 接枝度和乳析指數(shù)間相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation coefficient between grafting degree and creaming index

2.5 接枝物性質(zhì)分析結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化的SPI-M的最佳制備條件為m（SPI）∶m（M）為4∶1、SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%和輻照劑量7.5 kGy，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)并設(shè)對(duì)照組。

2.5.1 SDS-PAGE分析結(jié)果

圖7 SPI及SPI＋M、輻照SPI、輻照SPI-M的SDS-PAGE圖譜Fig. 7 SDS-PAGE of SPI and SPI + M, radiated SPI, and radiated SPI-M

SPI與糖發(fā)生接枝反應(yīng)形成共價(jià)復(fù)合物可以通過(guò)分析考馬斯亮藍(lán)和Schiff試劑染色形成的電泳圖譜得到證實(shí)[28]。由圖7可知，泳道2和泳道1條帶類(lèi)似，說(shuō)明SPI單純地與麥芽糖混合不會(huì)發(fā)生接枝反應(yīng)。泳道3與泳道1條帶類(lèi)似，說(shuō)明輻照基本不會(huì)改變蛋白分子質(zhì)量。泳道4亞基組分條帶顏色變淺，這是因?yàn)榭捡R斯亮藍(lán)與自由氨基形成非共價(jià)鍵而呈現(xiàn)顯色反應(yīng)，當(dāng)SPI與麥芽糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后，自由氨基含量減少，剩余較少的氨基不足以與考馬斯亮藍(lán)發(fā)生顯色反應(yīng)，從而證實(shí)SPI與麥芽糖發(fā)生接枝反應(yīng)。Schiff試劑染色對(duì)糖蛋白比較敏感，能夠表征美拉德反應(yīng)[29]，糖染色原理為高碘酸氧化糖基化蛋白糖鏈上相鄰兩個(gè)碳上的羥基為醛基，醛基與Schiff試劑生成顏色絡(luò)合物。泳道5與泳道6相比，泳道5糖染色各亞基條帶幾乎消失，而泳道6出現(xiàn)糖染色條帶，表明發(fā)生接枝反應(yīng)。這是因?yàn)檩椪沾偈沟鞍捉Y(jié)構(gòu)打開(kāi)，暴露出更多的氨基與糖發(fā)生反應(yīng)形成接枝物[30]。

2.5.2 出油率分析結(jié)果

圖8 SPI及SPI＋M、輻照SPI、輻照SPI-M凍融循環(huán)3 次的出油率Fig. 8 Oil release rates of SPI, SPI + M, radiated SPI and radiated SPI-M after 1, 2 and 3 freeze-thaw cycles

乳液經(jīng)凍融處理后，脂肪的不穩(wěn)定作用會(huì)使乳液油相與水相分離，通過(guò)出油率來(lái)表征乳液的穩(wěn)定性[31]。由圖8可知，經(jīng)過(guò)凍融循環(huán)后，SPI和SPI+M樣品乳液的出油率明顯增加，可見(jiàn)單純地混入糖并不能明顯改善樣品乳液的凍融特性。在歷經(jīng)凍融循環(huán)后，只經(jīng)過(guò)輻照處理的SPI出油率比對(duì)照雖有所改善，但效果并不理想。而輻照處理得到的SPI-M接枝物樣品乳液經(jīng)過(guò)1、2、3 次凍融循環(huán)后出油率與SPI乳液相比分別降低了9.7%、21.2%和26.4%。可能是因?yàn)榻尤氲奶歉纳屏说鞍讟悠啡榛裕偈褂?水表面形成具有彈性的界面膜，同時(shí)增加了黏度，減緩油滴的運(yùn)動(dòng)速度，避免了油滴之間的聚集，降低了出油率。Zhang Zeyu等[32]利用超聲協(xié)同接枝反應(yīng)處理乳液得到了類(lèi)似結(jié)果，說(shuō)明輻照輔助接枝反應(yīng)能改善乳液的凍融特性。

2.5.3 光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

由圖9可知，在經(jīng)歷凍融循環(huán)后，由SPI和SPI+M制備的乳液微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了較為明顯的改變，出現(xiàn)大而圓的油滴和不規(guī)則的團(tuán)塊。經(jīng)過(guò)輻照的SPI乳液較SPI和SPI+M乳液出現(xiàn)了較小的油滴，而輻照處理得到的SPI-M接枝物的乳液更穩(wěn)定，在經(jīng)過(guò)凍融循環(huán)后蛋白形狀完整，表面光滑圓潤(rùn)，邊界明顯，只出現(xiàn)較少的小油滴。可能是因?yàn)檩椪沾龠M(jìn)糖的接入，形成了致密的保護(hù)膜，減少了外界因素對(duì)乳液的損壞，分子柔性也隨之增加，乳化性提高，進(jìn)而降低了油滴之間的碰撞幾率，減少了絮凝和聚結(jié)[33]。因而SPI-M制備的乳液結(jié)構(gòu)變化穩(wěn)定，說(shuō)明輻照輔助接枝反應(yīng)處理蛋白樣品乳液能表現(xiàn)出良好的凍融特性。

圖9 SPI及SPI＋M、輻照SPI、輻照SPI-M凍融循環(huán)3 次的微觀結(jié)構(gòu)Fig. 9 Microstructure of SPI, SPI + M, radiated SPI and radiated SPI-M after 1, 2 and 3 freeze-thaw cycles

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)輻照輔助接枝反應(yīng)制備的SPI乳液進(jìn)行凍融特性研究，探究SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)、m（SPI）∶m（M）、輻照劑量對(duì)改性產(chǎn)物的接枝度、褐變程度和乳析指數(shù)的影響。通過(guò)SDS-PAGE、出油率測(cè)定和光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)觀察對(duì)改性產(chǎn)物進(jìn)行性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明，SPI-M最佳反應(yīng)參數(shù)為m（SPI）∶m（M）為4∶1、SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%和輻照劑量7.5 kGy，輻照輔助接枝反應(yīng)不僅降低了糖的比例，還改善了凍融特性。SDS-PAGE結(jié)果表明SPI與麥芽糖發(fā)生接枝反應(yīng)。優(yōu)化的SPI-M樣品乳液經(jīng)過(guò)1、2、3 次凍融循環(huán)后出油率與SPI乳液相比分別降低了9.7%、21.2%和26.4%。微觀結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果也證實(shí)了SPI-M樣品乳液比較穩(wěn)定。說(shuō)明輻照作為一種冷加工技術(shù)協(xié)同接枝反應(yīng)改善蛋白乳液凍融特性是可行的。