龍眼體細胞胚胎發生研究進展

陳裕坤 林曉藝 賴鐘雄

摘? 要：龍眼體胚發生系統是研究木本植物胚胎發生的優良體系，為研究龍眼體胚發生的分子調控機制和龍眼分子育種奠定基礎。本文就龍眼胚性愈傷組織誘導與離體保存、高頻體胚發生與植株再生、體胚同步化調控與組織形態學觀察，體胚發生過程生理生化變化與代謝物積累、蛋白質組和全轉錄組測序分析、DNA甲基化研究，體胚發生相關基因克隆、全基因組鑒定及其表達模式與功能，以及遺傳轉化等相關研究進行綜述，并對其研究前景進行展望。

關鍵詞：龍眼;體胚發生;基因克隆;分子機制;全轉錄組與蛋白質組學;DNA甲基化

中圖分類號：S667.2? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： Longan somatic embryogenesis （SE） system is an excellent system for studying embryogenesis in woody plants， which lays the foundation for studying the molecular regulation mechanism during SE and molecular breeding of longan. Accordingly， the induction of embryogenic callus and in vitro conservation， high-frequency SE and plant regeneration， regulation of synchronization somatic embryo and histomorphological observation in longan， the physiological， biochemical changes， and metabolite accumulation， proteomic and whole transcriptomics analysis by RNA-seq， DNA methylation during SE， SE-related genes cloning and genome-wide identification， expression pattern and function study of SE-related genes， research on genetic transformation of SE system in longan， were reviewed in this paper. Meanwhile， the research prospect of longan SE was analyzed and prospected.

Keywords： Dimocarpus longan Lour.; somatic embryogenesis; gene cloning; molecular mechanism; whole-transcriptomics and proteomics; DNA methylation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.10.006

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是我國著名的熱帶亞熱帶特色木本果樹，龍眼果實富含酚類等次生代謝物，被譽為“南方人參”。龍眼原產于中國和東南亞，在東南亞、南亞、澳大利亞和夏威夷等地均有較大規模的種植[1]。我國栽培龍眼的歷史可追溯到2000多年以前，種植龍眼的?。▍^）包括廣東、廣西、福建、四川、云南和海南，但主產區在廣東、廣西和福建3個省（區）[2]。龍眼合子胚的生長發育狀況與其產量、種子大小、果實品質等生產性狀息息相關，由于龍眼樹體高大，合子胚被果實胚囊包裹在中間，并且在子葉胚形成前合子胚極其細小，無法實時觀測合子胚的發育狀況，導致龍眼合子胚發育中期階段之前的材料取材困難[3]。同時，龍眼具有童期長、遺傳背景復雜、高度雜合的特點，極大限制了分子生物學在龍眼合子胚胚胎發育研究上的應用。植物體細胞胚胎（體胚）發生過程和合子胚胚胎發生過程的發育階段高度相似[4-5]，體胚發生是植物胚胎發生特別是胚胎發育早期分子調控機制研究的模式系統[6]。賴鐘雄等[7-8]建立的龍眼體胚發生系統具有高度同步、高頻率發生和再生能力強等特點，是研究木本植物胚胎發生的優良實驗系統。20多年來，福建農林大學園藝植物生物工程研究所在龍眼體胚發生系統研究的基礎上，對其分子調控機制進行了大量研究，包括龍眼體胚發生相關基因克隆、全基因組鑒定，體胚發生相關基因表達模式與功能研究，蛋白質組學分析，全轉錄組測序分析，DNA甲基化研究，龍眼體胚發生過程lncRNA、microRNA、miPEP、cirRNA研究，龍眼體胚遺傳轉化研究等。Lin等[9]于2017年首次完成了龍眼全基因組測序，建立了無患子科植物的第一個全基因組數據庫，為研究龍眼體胚發生的分子調控機制提供完整的基因組信息。本文就龍眼體胚發生各方面的研究進展進行綜述。

1? 龍眼體胚發生研究進展

1.1? 龍眼胚性愈傷組織誘導與離體保存

在20世紀80年代初，研究人員就已經開始進行龍眼體胚發生與植株再生等方面的研究。魏文雄等[10]以‘東壁和‘紅核子幼胚子葉為外植體首次誘導出愈傷組織，但僅在少數愈傷組織中產生胚性細胞，胚性細胞通過體胚發生途徑獲得完整植株;楊永青等[11]以‘東壁花藥為材料誘導胚性愈傷組織（embryogenic callus， EC），由EC分化的胚狀體再萌發成正?；ǚ壑仓?，經根尖細胞鏡檢獲得單倍體龍眼植株（n=15）;周麗儂等[12]以無菌初生幼苗和自然萌發實生苗的不同組織部位為外植體，誘導獲得愈傷組織，但只有莖段誘導的愈傷組織可分化成芽，以及側芽和頂芽誘導的部分愈傷組織可分化成根;楊永青等[13]從焦核龍眼幼胚的離體培養中獲得胚狀體，通過體胚發生途徑獲得再生植株，實現焦核龍眼的胚胎挽救。此外，Litz[14]從樹齡超過30年的龍眼樹幼葉離體培養中獲得EC，經體胚發生途徑獲得再生植株。因此，已經成功從龍眼的子葉幼胚、花藥和葉片等組織部位誘導出龍眼EC，并經體胚發生途徑獲得了再生植株，但部分胚性愈傷組織的穩定性和體胚發生能力較差，甚至出現畸形胚，體胚發生頻率較低、數量較少，制約了龍眼體胚發生過程的生理生化及分子生物學等系統研究。

20世紀90年代初，賴鐘雄等[1， 8]以‘紅核子‘油譚本‘東壁‘十二月龍眼‘九月烏等龍眼未成熟果幼胚和‘東壁等龍眼的花藥為外植體，誘導出CI類型，CIIa、CIIb類型，CIII類型的愈傷組織，CIIa、CIIb類型愈傷組織經4～5次繼代培養也可選擇出松散型的CIII型愈傷組織，CIIa、CIIb類型和CIII類型的愈傷組織體胚發生能力極強，經過1個月左右的培養，每克鮮樣可分化出約1萬個胚狀體;以MS為基本培養基分別添加1.0 mg/L 2，4-D與1.0 mg/L 2，4-D、0.5 mg/L KT、5.0 mg/L AgNO3對松散型胚性愈傷組織進行交替培養，可達到長期繼代保存松散型胚性愈傷組織的目的。葉煒等[15]參照此法，成功從51份龍眼種質中誘導獲得胚性愈傷組織，并進行長期繼代保存。林秀蓮等[16]通過對離體保存的龍眼EC及其體胚發生過程染色體數目變異的研究，發現二倍體龍眼離體培養物中存在單倍體、三倍體、四倍體、非整倍體等廣泛的變異，這種變異現象從EC誘導開始就存在，并且變異率會隨離體培養時間的增加而升高，但最終趨于穩定。

1.2? 龍眼高頻體胚發生及植株再生

賴鐘雄等[7]在獲得3種類型胚性愈傷組織的基礎上，明確了愈傷組織的類型、蔗糖濃度和光照條件是龍眼體胚發生過程的關鍵調控因子，成功建立了龍眼體胚發生系統。賴鐘雄等[17]從不同龍眼品種外植體中誘導篩選的CIII型龍眼EC通過液體培養方式都能在2周左右建立胚性懸浮細胞系，采用分別附加AgNO3和肌醇的液體培養基交替培養及固體-液體輪回培養的方式實現了胚性懸浮細胞系的長期保持，胚性懸浮細胞轉移至固體培養基或在液體淺層培養均可獲得大量胚狀體，固體培養基上的胚狀體大小不一致，液體淺層培養的大小比較一致，體胚成熟后獲得再生植株。龍眼松散型胚性愈傷組織經過分離獲得單細胞懸浮細胞系，龍眼的單細胞采用液體淺層培養方式，先形成多細胞團，再發育形成早期球形原胚結構、球形胚結構和子葉形胚結構，最終獲得再生植株[18]。此外，龍眼胚性培養細胞及胚性懸浮細胞可獲得高產和高活力的原生質體，與懸浮單細胞培養類似，龍眼原生質體通過體胚發生途徑形成再生植株[19]。賴鐘雄等[20]采用電融合方法將龍眼和荔枝的原生質體進行融合，融合率超過20%，融合產物經初步培養形成多細胞團。黃淺等[21]進行荔枝龍眼原生質體的電融合研究，融合率高達30%以上，建立了荔枝和龍眼原生質體的電融合技術體系，融合產物經初步培養形成多細胞團。龍眼這種極強體胚發生和植株再生能力在木本植物中是十分罕見的，這種優良的體胚發生體系可作為研究植物體胚發生尤其是木本植物體胚發生的模式實驗系統。

1.3? 龍眼體胚發生同步化調控與組織形態學觀察

體胚發生的同步化調控是建立龍眼體胚發生系統的關鍵環節，在龍眼EC誘導及高頻體胚發生的基礎上，陳春玲等[22]進行了龍眼體胚發生的同步化調控研究，發現龍眼EC在分別添加0.5、0.3、0.1、0 mg/L 2，4-D的MS培養基（蔗糖2%）中培養，可分別獲得高度同步化的不完全胚性緊實結構、胚性緊實結構、球形胚和非胚性愈傷組織，將龍眼EC轉移至MS基本培養基（蔗糖5%）上培養可獲得高度同步的早期子葉形胚和成熟子葉胚，組織形態學研究表明龍眼體胚發生主要是單細胞內起源。王鳳華等[23]將球形胚接種于蔗糖含量為2%的MS基本培養基上培養，在培養至第8～9天和第10～12天分別獲得大量同步化的心形胚和魚雷形胚;將龍眼EC接種于蔗糖含量為2%的MS基本培養基上培養40 d獲得大量同步化的子葉形胚，子葉形胚接種于蔗糖含量為5%的MS基本培養基上培養約75 d可獲得成熟體胚。方智振等[24]在獲得高度同步化的球形胚（0.1 mg/L 2，4-D）基礎上，將球形胚接種于添加0.07、0.05、0.06、0 mg/L 2，4-D的MS基本培養基中，分別獲得同步化的心形胚、魚雷形胚和子葉形胚。因此，2，4-D濃度、蔗糖濃度以及培養時間對龍眼體胚同步化調控具有重要的影響，通過對這3個因子的調控可獲得同步化的各個發育階段胚性培養物，為龍眼體胚發生過程的生理生化變化與代謝物積累、全轉錄組學分析、蛋白質組學分析、體胚發生相關基因的表達調控和功能分析等研究奠定基礎。

2? 龍眼體胚發生過程生理生化變化與代謝物積累

植物激素的誘導與調節是體胚發生和發育的關鍵因素，而內源激素的代謝與動態平衡對細胞分化至關重要。賴鐘雄等[3]的研究表明，龍眼胚性愈傷組織中內源激素含量高于非胚性愈傷組織內源激素的含量，從龍眼胚性愈傷組織階段至子葉形胚階段內源IAA含量維持在較高水平，且遠高于非胚性愈傷組織階段，而在成熟子葉胚階段則急劇下降;在非胚性愈傷組織階段的內源GA3含量較高，隨著體胚的進一步發育，內源GA3的含量逐漸下降;與內源IAA和GA3相比內源ABA的含量總體較低，在體胚發生過程ABA含量從球形胚階段開始相對較高，內源玉米素含量的變化趨勢與IAA相似，只是在成熟子葉形胚階段其含量仍維持在較高水平;除GA3外，內源激素在胚性愈傷階段II和球形胚階段的含量較高，呈現類“M”的變化趨勢。龍眼體胚發生過程內源多胺含量的研究表明，內源多胺與內源激素含量的變化趨勢相似，都呈現類“M”的變化趨勢[25]。通過對龍眼體胚發生過程的內源激素和多胺的研究表明，胚性愈傷階段II和球形胚是其生理生化變化的轉折階段，雖然胚性愈傷階段I和階段II在組織形態學上沒有差別，但生理生化上已經發生明顯的變化[3]。此外，高濃度蔗糖、光照條件、滲透劑聚乙二醇（PEG）、椰乳和脫落酸等培養因子對龍眼體胚成熟過程中的可溶性糖、淀粉含量也具有明顯的調控作用[26]。陳春玲[27]的研究結果表明，酯酶、過氧化物酶和淀粉酶同工酶酶譜在龍眼體胚發生過程中的規律性變化，反應出龍眼體胚發生過程各個階段遺傳信息表達的選擇性和順序性。乙醇脫氫酶的含量在龍眼體胚發生過程中逐漸降低[28]，而抗壞血酸過氧化物酶同工酶含量在胚性愈傷組織、球形胚、子葉形胚階段逐漸遞增[29]。陳義挺等[30]研究表明，隨著龍眼體胚早期發生（松散型胚性愈傷組織、胚性愈傷II、不完全胚性緊實結構、胚性緊實結構、球形胚）過氧化物酶（POD）活性呈下降趨勢，低溫或高溫處理下POD酶活性顯著高于對照，高溫或低溫均可明顯影響POD同工酶譜帶的出現和表達，POD酶活性及其同工酶譜的規律性變化可能與龍眼體胚發生早期的細胞分化和體胚發育維持具有密切的關系。

光調控是一種改變植物細胞功能性代謝產物合成的重要方法，采用不同光質處理龍眼EC結果表明，藍光和白光可以促進龍眼EC中多糖、生物素、生物堿和類黃酮的積累，其中藍光的效果最明顯;與白光和黑暗處理相比，藍光處理下龍眼EC中超氧化物歧化酶、過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶活性和過氧化氫酶含量顯著升高，說明光照能激活龍眼EC中的抗氧化系統[31]。李漢生等[32]采用生物反應器放大培養龍眼懸浮細胞，

研究藍光和黑暗培養下類黃酮的積累，發現藍光培養9 d后類黃酮含量增長了0.77 mg/g。廖斌等[33]研究不同光照條件對生物反應器中龍眼懸浮細胞生長及柯里拉京代謝合成的影響，結果表明黑暗條件利于龍眼胚性懸浮細胞生長及細胞內柯里拉京的積累，培養液pH和溶氧是龍眼胚性懸浮細胞生長及柯里拉京合成的重要調控因子。崔彤彤[34]研究發現不同培養時間、溫度和水楊酸（SA）濃度及SA的添加時間對龍眼EC中類黃酮和類胡蘿卜素積累具有顯著的影響，且在不同溫度和SA濃度下培養第30天時龍眼EC中SOD、CAT、POD細胞保護酶活性也發生顯著變化。研究表明，基本培養基和植物生長調節劑可影響龍眼EC中類黃酮和類胡蘿卜素的積累[35];真菌誘導子種類、誘導時間和濃度影響龍眼EC中多糖的積累，100 mg/L龍眼擬莖點霉誘導子誘導15 d時龍眼EC多糖含量最高，比對照提高了61.34%[36];此外，真菌誘導子的種類、誘導時間和濃度影響龍眼EC中類黃酮、類胡蘿卜素和單寧的含量[37]。因此，在龍眼體胚不同發育階段、培養時間、培養方式、培養基成分、光照條件、植物生長調節劑和真菌誘導子等培養條件與龍眼胚性細胞內代謝物質的積累具有密切的關系。

3? 龍眼體胚發生分子調控機制

3.1? 龍眼體胚發生蛋白質組學研究

陳春玲等[38]采用IEF和SDS-PAGE技術分析NEC、EC-Ⅰ、EC-Ⅱ、ICpEC、CpEC、GE、pro-CE、CE 8個階段的差異表達蛋白，在等電點pI差異上，EC、pro-CE階段分別檢測出pI 5.1、pI 5.4和pI 4.4特異蛋白;在蛋白質相對分子量差異上，8個階段的蛋白質相對分子量分布在6～110 kDa之間，13.9 kDa蛋白是NEC階段的特異蛋白，分子量為6.2 kDa和6.9 kDa的蛋白質為CE階段新發現的特異表達蛋白。參照此法，王鳳華[39]研究了龍眼體胚發生過程的差異表達蛋白，在胚性愈傷組織、球形胚、魚雷形胚、子葉形胚、成熟胚階段分別檢測出1、2、6、4、4個階段特異表達蛋白。李冬梅[26]研究表明，龍眼體胚成熟過程和每個成熟階段均能檢測到特異表達蛋白，龍眼體胚成熟過程蛋白質合成在黑暗+低糖+ABA共同培養條件下最活躍。安娜等[40]研究表明，龍眼體胚發生過程pI 4～5的酸性蛋白逐漸減少，而pI 5～6的酸性蛋白逐漸增加，在體胚成熟階段，分子量大的蛋白質數量明顯減少，而分子量小的蛋白質數量逐漸增多。郭玉瓊[41]分析龍眼球形胚低溫預培養過程的蛋白質，鑒定了特異表達蛋白LLT1、LLT2、LLT3、LLT4;何園[42]在龍眼子葉胚成熟過程中鑒定出29個差異表達蛋白，涉及蛋白質合成、能量和糖類代謝、脅迫應答和抗氧化等過程的相關蛋白;賴呈純[43]進行龍眼體胚發生早期蛋白質組學研究，獲得148個差異表達的蛋白質，最終從118個差異蛋白質的質譜鑒定中鑒定出45個差異表達蛋白質;方智振[44]在龍眼體胚發生中期蛋白質組學研究中發現，蛋白質的種類隨著龍眼體胚的發育進程逐漸減少，從76個差異表達蛋白質中選取66個進行質譜分析，共鑒定出35個差異表達蛋白質，其中51%的蛋白質都涉及代謝途徑，說明龍眼體胚發生中期蛋白質的代謝比較活躍;隨著體細胞胚的發育，細胞不斷分化，體細胞胚中表達的蛋白種類減少，氧化脅迫相關蛋白、RAN2和GTPase ObgE與龍眼體細胞胚發生的調控有關[45];李然等[46]研究表明，龍眼EC生長過程蛋白質點數總體升高，pI介于4～7，蛋白分子量介于14～97 kDa，30～66 kDa的蛋白質在龍眼EC生長過程具有相對較高的表達量。因此，基于雙向電泳技術的蛋白質組學研究，揭示了龍眼體胚發生過程的差異表達蛋白質，共鑒定了162個差異表達蛋白質，分析了差異表達蛋白所涉及的相關代謝過程，說明差異表達蛋白參與龍眼體胚發生過程的調控。

雖然前期研究已經鑒定了部分與體胚發生相關的蛋白，揭示了它們在龍眼體胚發生過程的潛在調控作用，但所鑒定的蛋白質數量有限，無法全面挖掘差異表達蛋白在龍眼體胚發生過程的調控網絡。因此，陳裕坤[47]進行了iTRAQ標記的龍眼體胚發生早期蛋白質組學測序分析，在NEC、EC、ICpEC、GE 4個階段中共鑒定了5035個蛋白質，代謝途徑與次級代謝物的合成是所鑒定蛋白質主要富集的KEGG代謝通路;在NEC與EC、ICpEC、GE成對比較中分別鑒定出82、78、103個差異表達蛋白質，在EC與ICpEC、GE成對比較中分別鑒定了73、160個差異表達蛋白質，在ICpEC_與GE成對比較中鑒定了116個差異表達蛋白質;龍眼體胚發生早期階段差異表達的LEC1-like、幾丁質酶CHI5/-4、阿拉伯半乳聚糖AGP8和糖蛋白EP1等蛋白可能對體胚發育早期具有調控作用;同時，糖類與能量代謝相關蛋白質在龍眼體胚發生早期的差異性表達極為顯著，糖酵解、酒精發酵、戊糖磷酸途徑、三羧酸循環的差異表達蛋白質在球形胚階段基本都表現出顯著上調的趨勢，糖類與能量代謝相關蛋白質可能參與龍眼體胚發生早期的調控。生長素、脫落酸和赤霉素等激素相關蛋白，脅迫應答蛋白CAT、POD、APX、GPX等，脂質代謝、蛋白質代謝、以及細胞骨架結構相關蛋白在龍眼體胚發生早期均發生顯著的差異表達，可能與龍眼體胚發生和體胚早期的發育有著密切的關系?；趇TRAQ技術的龍眼體胚發生早期蛋白質組高能量測序分析，鑒定出的蛋白質數量遠高于之前的研究，也能更精確地獲得不同發育階段間蛋白質的變化，從蛋白質水平解析龍眼體胚發生早期的分子調控機制。

3.2? 龍眼體胚發生全轉錄組學研究

Lai等[48]對龍眼胚性愈傷組織進行Solexa測序分析，在龍眼胚性愈傷組織中共有17 306個基因，共涉及199個KEGG途徑，其中基因序列長度高于1000 bp的體胚發生相關基因有328個，對所篩選的23個基因在體胚發生過程的表達分析表明，候選基因在龍眼體胚發生過程差異表達，差異表達基因是龍眼體胚發生的潛在調控因子。雖然從龍眼胚性愈傷組織轉錄組測序中挖掘了一些體胚發生相關基因，但未能闡明體胚發生過程差異表達或發育階段特異表達基因及其代謝途徑等調控作用，龍眼體胚發生過程分子調控網絡還有待構建。因此，Chen等[49]開展了龍眼體胚發生早期轉錄組分析，獲得大量差異表達基因，初步構建了龍眼體胚發生早期的分子調控網絡;轉錄組分析發現，生長素和細胞分裂素等激素信號途徑在龍眼體胚發生過程的重要調控作用，類黃酮主要在非胚性愈傷組織中富集，而脂肪酸則主要富集在體胚發生早期，胚性愈傷組織中表達最高，隨后略有降低;LTP、CHI、GLP、AGP、EP1等胞外蛋白編碼基因、DNA復制和細胞周期相關基因在龍眼體胚發生早期差異表達顯著，可能與龍眼體胚發生具有密切的關系;將龍眼體胚發生早期轉錄組與龍眼9個組織部位轉錄組聯合分析，發現LEC1、L1L、PDF1.3、GH3.6、AGL80、PIN1、BBM、WOX9、WOX2、ABI3、FUS3、LEC2等27個基因僅在EC、ICpEC、GE階段表達量極高，在NEC階段表達量極低或不表達，可作為龍眼體胚發生早期的分子標記基因;此外，還鑒定了LEA5、CNOT3、DC2.15、PR1-1、NsLTP2等28個在NEC階段特異表達的分子標記基因，這些發育階段特異表達的分子標記基因可能是龍眼體胚發生的關鍵調控因子。在龍眼EC和體胚發生早期轉錄組測序基礎上，該實驗室還開展了不同光質、5-氮胞苷（5-azac）處理的轉錄組測序分析。Li等[31]研究了藍光、白光處理下龍眼胚性愈傷組織中功能性代謝產物積累的轉錄組學，初步構建了影響龍眼功能性代謝產物的藍光信號網絡：在黑暗+藍光和黑暗+白光中分別鑒定出4463和1639個差異表達基因，基于次級代謝圖譜分析發現，差異表達基因主要富集在“莽草酸途徑”“苯丙烷類化合物途徑”“單酚途徑”“木質素和木脂素類途徑”“類黃酮途徑”;差異基因成對比較也說明了藍光比白光更顯著地影響龍眼EC代謝途徑和其它過程;同時，PIF4、AFR、MYC2是龍眼EC中受光照影響最為顯著的轉錄因子。陳榮珠[50]研究了5-氮胞苷處理的龍眼EC轉錄組測序，共獲得1617個差異表達基因，其主要富集在植物病原互作、植物激素信號轉導、植物MAPK信號通路、淀粉和糖代謝及丁酸鹽代謝等通路;5-氮胞苷處理可降低龍眼的DNA甲基化水平，促進龍眼體胚發生相關基因（FUS3、ABI3、FT1、GABA-T3、CAS、GLP等）和AGO4基因的表達，從而促進龍眼早期體胚發生。

Lin等[51]進行了龍眼體胚發生過程miRNA組學分析，鑒定了643個保守miRNA和29個新的miRNA，從其中272個miRNA預測出2063個靶基因，龍眼體胚發生過程qRT-PCR表明dlo- miR156家族及dlo-miR166c*與龍眼體胚早期的發育關系密切，dlo-miR26、dlo-miR160a、dlo-miR159等可能參與心形胚和魚雷形胚的形態建成，dlo-miR4a、dlo-miR24、dlo-miR167a、dlo-miR168a*等小RNA可能參與子葉胚發育過程的調控，其中dlo-miR167a、dlo-miR808、dlo-miR5077可能是胚胎成熟所必需的基因。Xu等[52]對龍眼體胚發生早期進行miRNA測序，從106個不同的miRNA家族和1087個新miRNA中共鑒定出289個已知miRNA，這些已知的miRNA集中在GE階段表達;許多miRNA在EC、ICpEC、GE階段大量且特異性地表達，一些miRNA及其預測的靶基因主要富集在木質素代謝途徑;通過RNA連接酶介導的cDNA末端快速擴增進一步明確了dlo-miR166a- 3p和DlHD-zip8、dlo-miR397a和DlLAC7、dlo-miR408-3p和DlLAC12之間存在相互調控的關系。Li等[53]對不同光質處理的龍眼EC進行miRNA測序分析，從30個miRNA家族中鑒定111個miRNA，miRNA靶基因KEGG富集分析表明，光對龍眼功能性代謝產物的合成涉及植物激素信號轉導、MAPK信號轉導等多種響應途徑;此外，miR171D_1、miR394a、miR396b-5p、miR5139可能參與藍光處理下胚性愈傷組織中功能性代謝產物的代謝過程，miR171D_1、miR319e、miR394a、miR395b_2、miR396e可能參與白光處理下胚性愈傷組織中功能性代謝產物的代謝過程;miR171f_3、miR390e、miR396b-5p通過分別靶定DELLA、BRI1、EBF1/2與EIN3基因參與藍光信號途徑，進而調控龍眼胚性愈傷組織中功能代謝產物的累積。

長鏈非編碼RNA（lncRNAs）參與可變剪切、轉錄干擾、DNA甲基化調控和蛋白修飾等過程，在基因轉錄、翻譯和表觀遺傳等水平上發揮重要的調控作用。為探究lncRNAs在龍眼體胚發生過程所發揮的調控作用，Chen等[54]開展了龍眼體胚發生早期lncRNA高通量測序分析，共鑒定6005個表達的lncRNA，其中4790個在3個階段均有表達，在EC、ICpEC、GE階段特異表達的lncRNA分別有160、154、376個，結合不同階段差異lncRNA成對比較，說明龍眼GE的形成可能需要大量的lncRNA來啟動;對體胚發生早期表達的6005個lncRNA進行注釋，1404個lncRNA屬于506個非編碼RNA家族、4682個lncRNA被預測為靶向蛋白編碼基因，其中靶基因包括順式調控靶基因5051個（5712對），反式調控靶基因1605個（3618對）;KEGG分析發現，龍眼體胚發生早期lncRNAs的差異表達靶基因主要參與“植物- 病原體互作”和“植物激素信號”通路中;在lncRNA-miRNA-mRNA關系預測中，40個lncRNA被預測為15個miRNA的內源miRNA誘捕靶標（eTMs），7個lncRNA被鑒定為潛在的miRNA前體，并且通過miR172a、miR159a.1和miR398a的瞬時表達證實了lncRNA-miRNA- mRNA之間的調控關系;因此，lncRNA作為miRNA的eTMs可能是龍眼早期SE的重要調控機制。

3.3? 龍眼體胚發生過程DNA甲基化研究

植物體胚發生過程伴隨著DNA甲基化水平的變化，DNA甲基化水平對植物體胚發生過程具有重要的調控作用。研究表明，DNA甲基化水平影響植物的體胚發生，在柑橘中具體胚發生能力的愈傷組織比無體胚發生能力的愈傷組織的DNA甲基化水平更低[55]，刺五加中胚性愈傷組織比非胚性愈傷組織的DNA甲基化水平也更低[56]，蒺藜苜蓿中體胚發生依賴一定程度的DNA甲基化水平，去甲基化試劑5-氮胞苷處理會阻止其體細胞胚的產生從而影響植株的再生能力[57]。近年來，龍眼體胚發生過程DNA甲基化相關的研究得到了比較深入的研究。Argonaute蛋白（AGO）是miRNA加工合成途徑中的關鍵蛋白，參與介導DNA的甲基化過程。楊曼曼[58]從龍眼EC中克隆了AGO家族4個成員DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5、DlAGO6的cDNA全長序列，結合其在龍眼體胚發生過程和不同組織部位中的表達模式分析，初步探究了AGO家族可能參與龍眼體胚發生過程及其它生長發育過程的調控[59-60]。陳榮珠[50]進行了龍眼AGO家族的10個成員的全基因組鑒定，分別分布于第1、4、8、10、12、13、14和15號染色體，并對DlAGO4[61]、DlAGO7、DlAGO10[62]和DlAGOMEL1進行克隆與表達模式分析、啟動子功能研究，說明其可能參與調控龍眼體胚發生過程;此外，5-azac結合2，4-D處理龍眼EC有利于球形胚的產生，低濃度5-azac處理促進DlAGO4的表達。5-azac處理龍眼EC的轉錄組分析，揭示了龍眼DNA甲基化水平的降低促進體胚發生相關基因和DlAGO4的上調表達，從而促進龍眼體胚發生。陳曉慧[63]從龍眼EC中克隆lmiRNA介導甲基化通路中的關鍵因子Dicer-like（DCL）的4個成員DlDCL1-4及其啟動子，實時熒光定量分析表明，一定濃度5-azac處理后DlDCL3和DlDCL4的表達量下降，而DlDCL1在0.3 μmol/L 5-azac，DlDCL2在0.5 μmol/L 5-azac處理時表達量最大，說明DlDCLs不同成員均能響應5-azac處理[64-65]。白玉[66]從龍眼EC克隆lmiRNA介導甲基化通路中的關鍵因子DlDRM1[67]和DlDRM2的克隆與表達分析，推測龍眼愈傷非胚性與胚性的轉化可能與DlDRM1基因的表達有關，而DlDRM2在ICpEC中的調控作用最為顯著，5-azac可能通過促進DlDRM1表達，抑制DlDRM2的表達，從而參與龍眼體胚發生過程的調控。

Chen等[68]在龍眼基因組數據庫鑒定了龍眼DNA甲基化相關基因，利用全基因組亞硫酸氫鹽測序技術（BS-Seq）繪制龍眼EC、ICpE、GE 3個階段基因組中單堿基分辨率的胞嘧啶甲基化圖譜，顯示龍眼體胚發生早期中EC、ICpEC和GE整體5 mC水平分別為24.59%、19.65%和19.74%，表明龍眼體胚早期是一個DNA甲基化降低的過程，在ICpEC階段DNA甲基化水平最低，隨后在形成GE時甲基化水平又有所增加，說明細胞從無組織狀態的EC轉變呈有形態結構的ICpEC過程中甲基化水平降低;龍眼體胚發生甲基化程度不同的主要原因是大量CHH位點甲基化的獲得或丟失造成的;對CHH-DMRs相關基因GO富集分析表明，DNA甲基化可能在影響體胚發生過程中的DNA整合、核酸結合、蛋白轉運等方面發揮著重要作用;此外，5-azac處理龍眼EC可促進其體胚發生。

3.4? 龍眼體胚發生相關基因克隆與表達分析、全基因組鑒定和功能研究

植物體胚發生和發育過程涉及大量特異基因的選擇性表達[6]。王鳳華等[69]采用DDRT法首次從龍眼體胚中分離獲得5條cDNA片段，實時熒光定量分析表明同甜椒和番茄APX同源的基因片段longan1在胚性愈傷組織和球形胚階段特異表達。隨后，研究人員進行了龍眼胚性培養物中體胚發生相關基因克隆及其表達分析的研究：如細胞周期調節基因CDC48[70];Adh、CAT、POD、APX、GPX等抗氧化相關基因，SOD家族20個成員及其中6個成員的啟動子[71]，谷胱甘肽代謝γ-ECS、GSHS、GR、GPX、GST基因[72];胚性相關基因SERK1、LEC1、AGL15、14-3-3、CHI-I、CHI-III及其啟動子[73]，WUS、CLV1、CLV2、CRN[74];激素代謝與信號轉導途徑TIR1、ABP1、ARF1、ACS、ACO、ETR1、ERS基因[75]，ARF家族7個成員[76]，生長素受體基因TIR1及其啟動子[77-78];能量代謝相關基因ATP β subunit、TPI[43];細胞程序性死亡相關基因CP、COX Vb和Caspase[79];WRKY家族10個成員[80]，NBS- LRR家族46個成員[81];DlRemorin1-5[82]、DlGRAS4和DlGRAS54[83]等體胚發生過程差異表達基因，以及43個開花時間相關基因[47];此外，方智振[44]克隆了Ran家族31條全長cDNA，并研究Ran的3'端轉錄多態性、可變剪接體及其在體胚發生過程的表達分析[84-85]，克隆了Ran3A、Ran3B啟動子[86];Tian等[87-88]研究了DlRan3A和DlRan3B表達模式及其啟動子的功能;Chen等[89]研究發現，種子特異表達基因DlMFT在龍眼體胚發生和合子胚發育過程中表達量顯著上升，可能具有促進胚胎發育的作用，而在種子發育過程中表達量顯著下降可能具有抑制種子萌發的功能。Lin等[90]對龍眼體胚發生過程及不同培養條件下多內參基因的篩選，為龍眼體胚發生過程、不同組織部位、外源激素處理等條件下基因的表達調控模式分析和基因功能研究奠定了基礎。

自2017年首次完成龍眼全基因組測序[9]以來，龍眼基因家族的全基因組鑒定與表達分析得到了大量的研究，如ERF基因家族108個成員[91]、AP2/ERF超家族125個成員[92]、Sm基因家族29個成員[93]、Hsf基因家族[94]、GRF基因家族[95]、龍眼HDAC基因家族[96]、BRI家族[97]、漆酶家族成員[98]、Aquaporin基因家族[99]、纖維素合成酶CESA基因家族[100]、SDG基因家族[101]、RNA甲基化相關基因[102]、類受體蛋白激酶CRK家族[103]、MSIL基因家族[104]、4CL基因家族[105]、HD-Zip基因家族[106]等?；邶堁刍蚪M數據庫，龍眼基因家族成員的鑒定及其表達分析得到了廣泛的研究，完善了龍眼體胚發生的分子調控網絡，為龍眼體胚發生相關基因的功能研究奠定了基礎。

林玉玲[107]研究了龍眼體胚發生過程miRNA的表達調控機制，發現在體胚發生過程差異表達的miRNA可能通過與靶基因SOD家族的調控作用，從而影響龍眼體胚發生過程。Lin等[108]進行了龍眼體胚發生過程miRNA內參基因的篩選，為龍眼體胚發生過程miRNA的表達調控機制及其功能研究奠定基礎。王亞婷[109]克隆dlo- miR156a-1、dlo-miR156a-2、dlo-miR166a、dlo- miR397a初級體及其靶基因laccase、β-tubulin，分析dlo-miR156a、dlo-miR166a、dlo-miR397a及靶基因β-tubulin表達模式。林麗霞[76]研究表明dlo-miR160負調控ARF10、ARF16、ARF17，dlo-miR167負調控ARF6和ARF8，dlo-miR390負調控TAS3，TAS3負調控ARF3、ARF4。Lin等[110]研究表明dlo-miR160a、dlo-miR160a、dlo-miR160d分別在魚雷型胚、球形胚和子葉形胚階段表達量出現峰值，可能對龍眼體胚發生中期和晚期階段具有調控作用;eTM-miR160-ARF10/16/17在體胚發生過程中起潛在調控作用，所鑒定的4個miR160的eTM，有2個對miR160a與靶基因的結合可能具有破壞作用，并參與生長素和脫落酸信號轉導途徑。Lin等[111]研究了eTM-miR167- ARF6/8在龍眼體胚發生過程的功能，所鑒定的2個miR167的eTM在球形胚階段表達量最大，但在不完全胚性緊實結構和魚雷型胚階段幾乎不表達;龍眼體胚發生后期，eTM可能通過裂解靶基因ARF8從而對dlo-miR167的表達起負調控作用。TIR1與dlo-miR393互作關系研究發現，dlo- miR393可能通過抑制TIR1-3的轉錄進而影響龍眼體胚發生過程[78]。同時，研究人員對龍眼microRNA分子特性及其表達模式進行了分析，如miR403[112]、miR395[113]、miR166家族成員[114]、miR397家族成員[115]、miR159家族成員[116]、miR171家族成員[117]、miR172家族成員[118]等;張清林等[119]克隆了龍眼體胚發生早期miR166的初級體并進行表達分析;蘇立遙等研究了miR403及其候選靶標對外源激素的響應模式以及在龍眼體胚中的表達模式[120]、eTM和microRNA319及其調控靶標在龍眼體胚發生早期的表達模式[121]。此外，Zhang等[122]研究了龍眼miR166的結構和龍眼體胚發生過程的表達模式及功能，發現miR166與ATHB15在龍眼體胚發生早期呈負調控關系，高水平表達miR166a.2可能有利于維持疏松的龍眼愈傷組織，而高水平表達ATHB15有利于球形胚的形成。

李漢生[123]在龍眼EC過表達和抑制表達miR390e，發現miR390e能夠剪切DlBRI1-3從而抑制DlBRI1-3的轉錄，影響龍眼功能性代謝產物的合成。陳裕坤[47]將DlMFT、DlTFL1、DlSHR異源表達于本氏煙，發現龍眼DlMFT能抑制種子的萌發但不影響植物的開花時間，龍眼DlTFL1具有調控植物開花時間的功能;DlSHR不僅影響轉基因植株的根系輻射狀分布，還會影響植物的生長發育過程，如出現生長較慢、開花推遲、根少且粗大、根光滑幾乎無毛、葉和莖部出現一定程度的扭曲、葉表皮毛粗大等表型;qRT-PCR表明過表達DlSHR植株中根輻射狀基因SCR及赤霉素相關的GAI基因表達極顯著增加，DlSHR可能通過控制SCR和GAI等下游基因的表達影響根系的結構及葉片形態。

4? 龍眼胚性愈傷組織受體系統的遺傳轉化研究

龍眼遺傳轉化研究已經開展了近20年，但相關研究進展緩慢。陳裕坤等[124]和田奇琳[125]采用根癌農桿菌侵染龍眼實生幼苗去頂和去頂芽部位獲得陽性轉基因植株。但是，以龍眼胚性愈傷組織為受體材料的轉基因研究目前還未能成功獲得完整的轉基因龍眼植株;曾黎輝[126]利用發根農桿菌侵染龍眼1月齡成熟胚和無菌初生苗，誘導出毛狀根后再培養得到3株轉基因植株，但轉基因植株的表型出現異常。通過組織、細胞形態學研究發現，龍眼胚性愈傷組織的體胚發生主要為單細胞內起源，這可能造成外源基因轉化至胚性細胞中的效率較低[22]。因此，很有必要對龍眼體胚不同發育階段的受體材料進行篩選，并對其遺傳轉化方法進行優化。賴鐘雄[127]采用基因槍轉化法將PBI121質粒轉化至龍眼胚性細胞中，獲得Kan抗性細胞，經GUS檢測表明gus基因已經整合至龍眼胚性愈傷組織中，抗性細胞接種至分化培養基中獲得了胚狀體。張妙霞[128]采用根癌農桿菌介導法將PEAS基因導入龍眼胚性愈傷組織中，獲得5個龍眼抗性細胞系。鄭啟發等[129]用金剛沙對液體懸浮培養的胚性愈傷組織進行創傷，結合根癌農桿菌侵染法，將含有AP1和POD基因的質粒導入懸浮培養系細胞中，最終獲得轉化AP1和POD基因的陽性龍眼胚狀體。徐清鋒[130]采用根癌農桿菌介導法將ACS反義基因轉化龍眼胚性愈傷組織，經GUS染色及PCR檢測獲得陽性轉基因愈傷組織。曾麗蘭[131]利用農桿菌介導轉化系統將龍眼FSD-pro4轉化至龍眼胚性愈傷組織中，經過抗性篩選及PCR鑒定獲得陽性轉基因愈傷組織。張冬敏[132]利用根癌農桿菌侵染法，將DlWUS瞬時過表達于龍眼EC，并初步驗證了龍眼EC過表達DlWUS抑制DlCLV1、DlCLV2、DlCRN的表達。賴瑞聯[133]借助脂質體轉染劑成功將miR393- agomir及其高效阻斷劑miR393-antagomir轉化至龍眼胚性愈傷組織中，初步建立了外源miRNA轉化龍眼胚性愈傷組織的高效體系。因此，已初步建立起以龍眼胚性愈傷組織為轉化系統的轉基因方法，但其轉化效率、轉基因細胞系的體胚發生和植株再生能力等還存在一定的問題，今后在轉基因方法和轉基因體系優化方面還有待深入研究。

5? 展望

龍眼體胚發生不僅是植株體外再生的重要途徑之一，還是研究龍眼分子生物學的優良體系，為龍眼分子生物學研究奠定基礎和提供良好平臺。龍眼體胚發生過程的生理生化變化進一步明確了內源激素代謝與動態平衡對龍眼體胚發生具有重要的作用;研究結果已經表明，不同的培養基成分、不同光質、不同外源添加物和不同培養階段影響龍眼體胚中功能性代謝物的積累，借助生物反應器初步建立了龍眼胚性細胞的大量培養，將來可應用于龍眼功能性代謝物如龍眼多糖、類黃酮、生物堿等的規模生產。龍眼體胚發生早期和中期的蛋白質組學、全轉錄組學和DNA甲基化研究，挖掘了大量體胚發生過程差異表達的蛋白質和基因，從mRNA、miRNA、lncRNA、蛋白質和DNA甲基化水平分析了龍眼體胚發生的分子機制;破譯龍眼基因組為龍眼體胚發生的分子機制研究搭建了重要的基因組信息平臺，體胚發生相關基因克隆、基因家族的全基因組鑒定與表達分析，進一步豐富了龍眼體胚發生的分子機制。但龍眼體胚發生中期至體胚成熟期的分子調控網絡有待完善，龍眼體胚發生的表觀調控網絡有待于進一步解析，龍眼體胚發生過程的代謝組學、cirRNA、單細胞測序、空間轉錄組測序和染色體外環狀DNA（eccDNA）等研究還有待開展（單細胞測序、空間轉錄組測序等部分工作正在進行中）。龍眼體胚發生相關基因的功能研究目前還比較依賴于異源表達模式植物，在龍眼胚性愈傷組織上的轉化以瞬時表達為主，將來可通過優化龍眼體胚轉化方法，將龍眼體胚發生過程顯著差異表達或階段特異性表達的基因轉化至胚性愈傷組織中，獲得過表達與突變體細胞系或株系，可進一步揭示體胚發生關鍵基因在龍眼體胚發生過程的功能及其調控機制。最近，我們實驗室采用PacBio Sequel又完成了‘紅核子龍眼基因組三代測序（待發表），基因組序列原始草圖長度0.49 Gb，初步組裝的ContigN50達到5.71 Mb，共327條Contigs。利用Hi-C技術進一步輔助基因組組裝至染色體水平，通過對Contigs進行排序，最終構建成15條Superscaffolds（包含300條Contigs），總長0.45 Gbp，Contigs N50為4.4 Mb，Superscaffold N50為27.7 Mb，占原始基因組長度的91.69%;隨后對其全基因組構建互作圖譜，符合互作規律，表明該物種Hi-C輔助組裝結果良好。同時，進一步利用Hi-C技術研究龍眼體胚發生早期染色質三維結構，發現在胚性愈傷組織（EC）分化發育成球形胚（GE）過程中，其三維染色質結構發生了大規模重組;從EC分化到不完全胚性緊實結構（ICpEC）過程，染色質結構變得更加致密，B Compartment之間的互作增強，同時該區域的開放性增強，A Compartment染色質間互作減弱。龍眼基因組三代測序提供了更加完整和全面的基因組信息，為進一步揭示龍眼體胚發生的分子機制提供了強有力的技術平臺，特別是龍眼體胚發生過程的Hi-C測序，揭示了龍眼體胚發生過程的基因組動態變化規律，對于揭示植物早期體胚發生的分子機制，提供了新的線索。

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