煙蒜輪作對煙株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

徐新雯，林正全，拓陽陽*，陳玉藍(lán)，李 斌，丁亞茹，李紅麗，王 巖，孫志平

(1.四川省煙草公司涼山州公司德昌分公司，四川 德昌 615500；2.四川省煙草公司涼山州公司寧南分公司，四川 寧南 615400；3.四川省煙草公司涼山州公司，四川 西昌 615000；4.鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院，河南 鄭州 450001)

【研究意義】土壤是作物生長養(yǎng)分的主要來源，健康土壤是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)作物的重要條件之一。土壤健康與否是土壤的物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)以及形成這些性質(zhì)重要過程的綜合體現(xiàn)[1]，健康的土壤具有較高的生物多樣性和較高水平的內(nèi)部養(yǎng)分循環(huán)。土壤微生物參與生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)、有機(jī)物分解、腐殖質(zhì)形成、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等生化過程，其豐度和多樣性對土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定具有重要作用，其變化與土壤結(jié)構(gòu)、養(yǎng)分循環(huán)、病害防治等密切相關(guān)[2]。土壤不健康的一個(gè)重要體現(xiàn)是土傳病害的流行，它是土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡和惡化的結(jié)果。通過采取有效措施改善土壤微生物結(jié)構(gòu)，特別是改變細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，對抗病具有重要作用，如假單胞菌、芽孢桿菌和農(nóng)桿菌有促進(jìn)作物生長和增強(qiáng)抵抗病原菌的功能[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】張凱煜等[4]研究表明有機(jī)肥能提高細(xì)菌數(shù)量及多樣性，不同施肥措施顯著改變了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。涂勇等[5]研究發(fā)現(xiàn)大豆與烤煙套作顯著增加細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，降低烤煙土傳病害的發(fā)生，且病害的發(fā)生與根際土壤細(xì)菌和放線菌的數(shù)量顯著負(fù)相關(guān)，與真菌數(shù)量極顯著正相關(guān)。陽顯斌等[6]研究表明煙蒜輪作與套作根際土壤細(xì)菌含量高于單作烤煙，解磷解鉀菌含量在烤煙中后期也高于單作烤煙，研究只檢測了實(shí)驗(yàn)室可培養(yǎng)微生物，沒有檢測煙田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)?！颈狙芯康那腥朦c(diǎn)】本研究利用高通量測序技術(shù)，分析健康煙田和煙蒜輪作土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，以及大蒜對后期煙草生長過程根際土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化，探討煙田健康土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及大蒜對煙株根際土壤細(xì)菌的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】為尋找煙草土傳病害有效的生物防治措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 煙田概況與取樣

試驗(yàn)田為四川涼山州德昌縣德州鎮(zhèn)鳳凰村4社，經(jīng)度102°11′17″，緯度27°25′40″，海拔1560 m。編號(hào)2_1的為健康煙田(往年平均發(fā)病率5 %，幾乎不發(fā)病)，種煙前空閑，土壤pH值為5.50。2_2為易感病煙田(往年平均發(fā)病率為50 %)，主要是黒脛病及根腐病混合發(fā)病，前茬為大蒜，土壤pH值為5.22。分別于煙草移栽前、旺長期和成熟期采土樣，按5點(diǎn)取樣法，移栽前取5～30 cm土壤，旺長期和成熟期取根際土壤，將土壤混勻取約1 kg，每個(gè)試驗(yàn)田取3個(gè)平行樣，分別編號(hào)。部分土壤風(fēng)干過篩用于土壤理化性狀及酶活的測定，部分裝離心管-20 ℃冷凍保存，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16S多樣性基因測序和分析。土樣基本理化性狀如表1所示。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)測定方法 按照土壤理化分析方法檢測pH值、含水率、有機(jī)質(zhì)、全氮和土壤養(yǎng)分[7]。

1.2.2 土壤微生物DNA提取及基因測序 根據(jù)陳乾錦等[8]研究的DNA提取和測序方法進(jìn)行16S土壤細(xì)菌基因測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22軟件進(jìn)行方差分析。基因測序結(jié)果利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司云平臺(tái)軟件進(jìn)行分析。

表1 煙田理化性質(zhì)

表2 各樣本OTU聚類和物種分類譜系

*為0.01

2 結(jié)果與分析

2.1 根際土壤細(xì)菌多樣性

如表2所示，移栽前健康土壤樣本(Y2_1)種類比易感病土壤低，說明種植大蒜增加了土壤細(xì)菌豐富度。種植煙草以后細(xì)菌種類都降低，2個(gè)試驗(yàn)田基本一樣，到成熟期有所提高，易感病土壤樣本(C2_2)低于移栽前水平，健康土壤樣本(C2_1)在屬水平以后比移栽前顯著升高，之前水平都比移栽前低，易感病煙田略高于健康土壤?？梢钥闯?，種植大蒜后煙田土壤細(xì)菌群落的自我調(diào)控能力大大提高，雖然沒有調(diào)整到移栽前水平，但比成熟期健康土壤稍高。

各樣本的Alpha多樣性差異檢驗(yàn)如圖1所示。從sobs指數(shù)可以看出，健康土壤在3個(gè)生長時(shí)期之間存在顯著差異性，易感病土壤在3個(gè)時(shí)期之間有極顯著差異，同時(shí)期在健康和易感病煙田只有移栽前樣本之間有顯著性差異。Shannon指數(shù)評價(jià)物種群落組成的均勻度，表示群落多樣性，從香農(nóng)指數(shù)差異分析可以看出，移栽前和旺長期之間有顯著差異，易感病煙田的移栽前和成熟期之間有極顯著差異，健康煙田有顯著差異。Sobs指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)顯示，在同一時(shí)期健康和易感病之間沒有顯著性差異，說明煙草生長時(shí)期對于煙田土壤細(xì)菌總數(shù)和多樣性影響較大，健康與易感病土壤之間有差異但不顯著。Ace指數(shù)和Chao 1指數(shù)反應(yīng)群落物種豐富度，只是計(jì)算方法不同，所以差異性也基本相同，健康煙田旺長期和成熟期之間有極顯著差異，易感病煙田3個(gè)時(shí)期之間有極顯著差異，健康與易感病煙田之間，在移栽前有顯著差異，成熟期有極顯著差異。

2.2 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

如圖2(見封三)所示，8個(gè)樣本細(xì)菌共檢測到35門、88綱、192目、389科、837屬、1848種。在門水平上，變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、Saccharibacteria、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)10個(gè)菌門的相對豐度超過1 %，占總菌數(shù)的97 %以上。相對豐度含量高于5 %的優(yōu)勢菌門有變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、厚壁菌門和酸桿菌門5種，總含量在83.31 %～88.98 %，在健康煙田稍高于易感病煙田。變形菌門和擬桿菌門在種上煙后增加，健康土壤增加的多，放線菌門則減少，健康土壤減少的少。整個(gè)生理期健康土壤的厚壁菌門和芽單胞菌門均比易感病土壤少，種上煙后，健康土壤先減少后增加，易感病煙田一直增加，特別是厚壁菌門增加顯著，Saccharibacteria種上煙草后顯著增加，同一時(shí)期健康土壤相對含量低于易感病煙田。

在綱水平上，相對含量大于1 % 的有21種，占總菌數(shù)的94 % 以上，其中健康煙田相對豐度高于易感病煙田的優(yōu)勢菌綱有：Actinobacteria、Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gemmatimonadetes，健康煙田顯著低于易感病煙田土壤的有：Acidobacteria、Ktedonobacteria。在目水平上有43種菌相對含量高于1 %，占總菌數(shù)的88 %以上，含量在前5的菌有Rhizobiales、Sphingomonadales、Micrococcales、Frankiales和Bacillales，其中種上煙后顯著增加且易感病煙田相對含量比健康煙田高的有Sphingomonadales和Bacillales，分別屬于變形菌門和厚壁菌門。在科水平上有53種菌含量大于1 %，占總菌數(shù)的75 %以上，前5種菌為Sphingomonadaceae、norank_o_Gaiellales、norank_p_Saccharibacteria、Xanthomonadaceae、和Acidobacteriaceae_Subgroup_1，種上煙后顯著增加且高于健康煙田的有Sphingomonadaceae和norank_p_Saccharibacteria。有顯著差異，易感病煙田相對含量高。Acidothemus、Bacillus、norank_o_Saccharibacteria、Candidatus_Solibacter、norank_o_SC-I-84和norank_f_HSB_OF53-F07在屬水平上，有54種細(xì)菌相對豐度大于1 %，占總菌數(shù)的60 %以上，前5種菌屬有Sphingomonas、norank_o_Gaiellales、norank_p_Saccharibacteria、Bacillus、norank_o_C0119，分別屬于變形菌門、放線菌門、Saccharibacteria、厚壁菌門和綠彎菌門。其中Sphingomonas(鞘脂單胞菌屬)、norank_p_Saccharibacteria和norank_o_C0119在種上煙后顯著增加，且在易感病煙田高于健康煙田土壤，Bacillus(芽孢桿菌屬)種上煙后稍有增加，整個(gè)生理期都是易感病煙田高，相對豐度較小的有益菌Bradyrhizobium(慢生根瘤菌屬)和Streptomyces(鏈霉菌屬)則在健康土壤高于易感病土壤。

圖3 土壤樣本非度量多維尺度分析Fig.3 Non-metric multidimensional scaling of soil samples

2.3 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Beta多樣性分析和差異分析

如圖3所示，Stress值顯示結(jié)果具有代表性，健康煙田和易感病煙田樣本之間具有差異性，種上煙以后，旺長期和成熟期的樣本分別聚在一起。移栽前的2個(gè)煙田分別在2個(gè)區(qū)間，相距較遠(yuǎn)，種上煙以后的區(qū)系結(jié)構(gòu)也有較大的差距，到成熟期相距較近。

移栽前，Nitrospirae(硝化螺旋菌門)有極顯著差異(圖4-A)，易感病煙田土壤相對含量高，但硝化螺旋菌門的相對含量低于1 %，Saccharibacteria有極顯著差異，健康煙田土壤比易感病煙田高48.6 %，Gemmatimonadetes、Bacteroidetes和Latescibacteria具具有極顯著差異，Rhodanobacter和norank_f_Acidobacteriaceae_Subgroup_1_具有顯著差異，Rhodanobacter、Bacillus和norank_o_SC-I-84在易感病煙田高于健康煙田土壤，其它菌屬則是健康煙田土壤高。說明種植大蒜的易感病煙田土壤有益菌增長，且與健康煙田土壤差異顯著。

旺長期，Armatimonadetes具有極顯著差異，Verrucomicrobia、Gemmatimonadetes和Firmicutes具有顯著差異(圖4-B)，norank_o_JG30-KF-AS9和Gemmatimonas具有顯著差異，這些菌都是易感病煙田土壤高。

在成熟期，Nitrospirae具有極顯著差異，易感病煙田土壤相對含量高，Proteobacteria、Firmicutes和Verrucomicrobia具有顯著差異，后2種菌門在易感病煙田土壤相對含量高，變形菌門在健康煙田土壤高。在屬水平上，Terrabacter具有極顯著差異，在健康煙田相對含量高，Bacillus、norank_o_Gaiellales、norank_o_C0119和Bradyrhizobium具有顯著差異，前3種菌屬在易感病煙田土壤相對含量高，慢生根瘤菌屬在健康煙田高。菌屬差異分析顯示種植大蒜后的易感病煙田土壤提高了調(diào)節(jié)和維持有益細(xì)菌豐度的能力。

2.4 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)土壤理化性質(zhì)和酶活的相關(guān)性

由圖5所示，環(huán)境因子對主要門分類水平細(xì)菌群落的冗余分析，第一主軸解釋了細(xì)菌門群落60.47 %的方差變化，第一和二主軸共解釋了82.97 %的方差變化。蔗糖酶INV(P=0.003)、有機(jī)質(zhì)OM(P=0.001)和堿解氮AN(P=0.001)是對門水平細(xì)菌群落具有極顯著正相關(guān)的環(huán)境因子，蛋白酶PR(P=0.012)、總氮TN(P=0.046)和速效磷AP(P=0.022)則是具有顯著負(fù)相關(guān)的環(huán)境因子。其它環(huán)境因子對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也有影響但未達(dá)到顯著水平，大部分細(xì)菌與脲酶URE、pH正相關(guān)，與酸性磷酸酶ACP、速效鉀AK、總磷TP呈負(fù)相關(guān)。

圖4 煙草不同時(shí)期煙田土壤細(xì)菌在門水平和屬水平上的差異分析Fig.4 Difference analysis of bacteria at phylum and genus level in soil of tobacco field

相對含量超過1 % 前10種細(xì)菌門與土壤酶活和理化性質(zhì)的spearman相關(guān)性分析具體如表3所示，酶活與細(xì)菌的相關(guān)性，ACP與這10種細(xì)菌門都沒有相關(guān)性，蛋白酶和蔗糖酶對細(xì)菌豐度的影響較大。PR與Saccharibacteria極顯著正相關(guān)，其余是顯著負(fù)相關(guān)，INV對變形菌門和Saccharibacteria極顯著負(fù)相關(guān)，與綠彎菌門極顯著正相關(guān)，與放線菌門和酸桿菌門顯著正相關(guān)，而URE對變形菌門和厚壁菌門顯著正相關(guān)，與綠彎菌門顯著負(fù)相關(guān)。理化性質(zhì)與細(xì)菌的相關(guān)性，pH與前10種細(xì)菌門沒有相關(guān)性，OM、TN、AN和AP對細(xì)菌豐度的影響較大。OM與Saccharibacteria極顯著負(fù)相關(guān)，與變形菌門顯著負(fù)相關(guān)，與芽單胞菌門和放線菌門極顯著正相關(guān)，總氮與Saccharibacteria極顯著負(fù)相關(guān)，與芽單胞菌門極顯著正相關(guān)，與浮霉菌門顯著正相關(guān)，AN與變形菌門和Saccharibacteria極顯著負(fù)相關(guān)，與放線菌門和芽單胞菌門極顯著正相關(guān)，速效磷與Saccharibacteria極顯著負(fù)相關(guān)，與芽單胞菌門極顯著正相關(guān)，與浮霉菌門和疣微菌門顯著正相關(guān)。AK和TP只與厚壁菌門極顯著正相關(guān)。放線菌門與主要相關(guān)的理化性質(zhì)呈極顯著正相關(guān)，變形菌門與INV和理化性質(zhì)極顯著負(fù)相關(guān)，厚壁菌門只與速效鉀和總磷極顯著正相關(guān)，厚壁菌門在易感病煙田一直高于健康煙田土壤，特別是種上煙后，增加顯著，這與養(yǎng)分的變化一致(表4)，而Saccharibacteria與INV和理化性質(zhì)極顯著負(fù)相關(guān)，芽單胞菌門與主要理化性質(zhì)極顯著正相關(guān)，與PR極顯著負(fù)相關(guān)。

PR：蛋白酶，INV：轉(zhuǎn)化酶，URE：脲酶，ACP：酸性磷酸酶，OM：有機(jī)質(zhì)，TN：總氮，AN：堿解氮，AP：有效磷，AK：速效鉀，TP：總磷圖5 細(xì)菌門分類水平與環(huán)境因子的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis(RDA)of bacteria at phylum level and environmental factors

3 討論與結(jié)論

作物土傳病害病原菌是土壤微生物群落的組成部分，健康土壤微生物群落一方面可抑制植物病原菌過度地繁殖，另一方面可酶解產(chǎn)生誘導(dǎo)物質(zhì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生并積累大量次生抗病物質(zhì)，提高作物的抗病性[9]。不健康土壤微生物群落失衡，某些種類微生物大量繁殖，使微生物多樣性降低。土壤微生物多樣性對維持農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的平衡具有重要作用，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，成本降低、準(zhǔn)確性高、靈敏度高，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的土壤微生物基因的直接測序，有助于研究土壤微生物的豐富度和多樣性，為有效防控土傳病害提供數(shù)據(jù)支撐[10]。

表3 細(xì)菌門水平上的群落結(jié)構(gòu)與土壤酶活和理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

表4 移栽前和旺長期土壤養(yǎng)分變化

本研究發(fā)現(xiàn)土壤細(xì)菌的微生物總數(shù)和多樣性在煙草不同生長時(shí)期有顯著差異，在移栽前和成熟期，健康煙田和易感病煙田之間的多樣性達(dá)到顯著差異。前茬作物對土壤細(xì)菌的總數(shù)和多樣性影響較大，種植大蒜的易感病煙田土壤高于健康煙田，與張笑宇等[11]的研究結(jié)果一致。旺長期土壤總數(shù)和多樣性就大幅度下降，且多樣性低于健康煙田，到成熟期又升高，土壤細(xì)菌總數(shù)和多樣性都高于健康煙田，說明易感病煙田種植大蒜后再種煙，對土壤細(xì)菌數(shù)量和多樣性的調(diào)節(jié)能力提高，已趨于健康煙田土壤。在門水平上，優(yōu)勢菌門變形菌門、擬桿菌門和放線菌門在健康土壤含量高于易感病土壤，厚壁菌門和芽單胞菌門則低于易感病煙田土壤，厚壁菌門與健康煙田差異顯著。在屬水平上，非優(yōu)勢菌屬的鏈霉菌屬在健康煙田比易感病煙田高約2倍，具有清理土壤有毒物質(zhì)的鞘脂單胞菌屬[12]則是易感病煙田比健康煙田高約1倍。而優(yōu)勢菌屬中的鞘脂單胞菌屬和芽孢桿菌屬則一直是易感病煙田土壤高，芽孢桿菌屬的差異達(dá)到顯著水平。

有研究表明，土壤的抗病能力與根際土壤中變形菌門和放線菌門相對豐度呈正相關(guān)[13]，這可能是由于其中部分微生物具有較強(qiáng)的抗病能力。變形菌門細(xì)菌為嗜營養(yǎng)菌菌，能以很多有機(jī)物和植物殘?bào)w為碳源和氮源，所以施用有機(jī)肥可以刺激變形菌門的生長，從而提高作物抗病性[14]。放線菌門可產(chǎn)生多種抗生素和胞外酶，對植物病害具有防御作用[15]。地桿菌屬為放線菌門，是根際土壤的氫氧化細(xì)菌，作為植物的根際促生菌的一種，對農(nóng)作物具有增產(chǎn)的作用[16]。慢生根瘤菌屬是變形菌門的一種根瘤菌，具有固氮作用，可自生固氮，也可與豆科植物共生固氮，但只在植物營養(yǎng)缺乏時(shí)才能進(jìn)行固氮作用[17]。芽孢桿菌屬為厚壁菌門，其中有很多益生菌種，對土壤病原真菌具有強(qiáng)烈的抗性[18]，在防治作物病蟲害和修復(fù)土壤重金屬污染方面有諸多研究，近幾年研究發(fā)現(xiàn)其還能有效控制根結(jié)線蟲[19]。本研究中，移栽前和種上煙后土壤細(xì)菌群落之間差異顯著，健康煙田和易感病煙田土壤之間差異也顯著。移栽前由于前茬作物不同，優(yōu)勢菌門中的芽單胞菌門和擬桿菌門有顯著差異，易感病煙分別比健康煙田高23.6 %和67.5 %，芽孢桿菌屬有極顯(P≤0.001)著差異，在易感病煙田比健康煙田高1倍多，說明種植大蒜有益細(xì)菌門增加，有利于土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的調(diào)整。種上煙草后雖然優(yōu)勢菌門種類不變，但是有差異的菌種與移栽前不同，旺長期厚壁菌門、芽單胞菌門和芽單胞菌屬具有顯著差異，易感病煙田均比健康煙田高約1倍，成熟期則是變形菌門、厚壁菌門、慢生根瘤菌屬和芽孢桿菌屬有顯著差異，地桿菌屬有極顯著差異，變形菌門、慢生根瘤菌屬和地桿菌屬在健康煙田比易感病煙田高9.5 %、64.2 %和92.8 %，厚壁菌門和芽孢桿菌屬在易感病煙田高62.2 %和57.9 %。說明易感病煙田種植大蒜后對煙株根際土壤細(xì)菌調(diào)節(jié)作用維持時(shí)間較長，促進(jìn)煙草根際環(huán)境中有益細(xì)菌的生長，最終使得這一年的發(fā)病率大大降低(僅為6.5 %)。

土壤微生物中有優(yōu)勢菌門與環(huán)境因子的分析表明，蔗糖酶、有機(jī)質(zhì)和堿解氮是影響細(xì)菌群落變化的主要因子，而蔗糖酶活性與有機(jī)質(zhì)具有正相關(guān)性，這與張凱煜[4]等的研究一致，大量的研究結(jié)果證實(shí)土壤氮含量和有機(jī)質(zhì)含量顯著影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，施用有機(jī)肥可以顯著提高土壤細(xì)菌的數(shù)量和多樣性。本研究表明通過大蒜輪作也可以提高有益細(xì)菌的含量和多樣性，易感病煙田的厚壁菌門和芽單胞菌門數(shù)量顯著增加，比健康煙田還高，且厚壁菌門和芽孢桿菌屬與健康煙田土壤含量的差異達(dá)到顯著水平。但是細(xì)菌群落改善對抗病的機(jī)理研究，還需要進(jìn)一步比較分析煙草根際微生物種群的代謝變化才能真正揭示。