玉米穗腐病致病禾谷鐮孢復合種的遺傳多樣性、致病力與毒素化學型分析

王寶寶，郭成，孫素麗，夏玉生，朱振東，段燦星

玉米穗腐病致病禾谷鐮孢復合種的遺傳多樣性、致病力與毒素化學型分析

王寶寶1，郭成2，孫素麗1，夏玉生1，朱振東1，段燦星1

（1中國農業科學院作物科學研究所/國家農作物基因資源與基因改良重大科學工程，北京 100081；2甘肅省農業科學院植物保護研究所，蘭州 730070）

【】明確中國玉米穗腐病致病禾谷鐮孢復合種（species complex，FGSC）的菌群遺傳結構、致病力、毒素化學型及其相互關系，為玉米鐮孢穗腐病防控提供參考信息。從中國玉米主產區采集玉米穗腐病樣本，經單孢分離鑒定，選取代表性的禾谷鐮孢復合種，利用22對SSR和10對VNTR引物，使用Popgen32、NTsys2.1、STRUCTURE2.3.4群體遺傳學研究軟件進行數據分析，結合、-和基因測序構建系統發育樹，分析7個地理區域禾谷鐮孢復合種的遺傳多樣性，采用花絲通道注射接種法測定各鐮孢菌的致病力，利用產毒基因特異性引物進行毒素化學型的檢測。在禾谷鐮孢復合種中共檢測到等位位點數48個，多態性位點數39個，多態性條帶比率為81.25%，每對引物擴增出多態性條帶2—4條；禾谷鐮孢復合種7個地理群體平均Shannon’s信息指數和Nei’s遺傳多樣性指數分別為0.41和0.29，7個地理區域遺傳相似度集中在0.6677—0.8797，遺傳距離為0.1282—0.4039，表明菌群間具有較豐富的遺傳多樣性。依據Nei’s遺傳距離對7個地理種群進行UPGMA聚類分析，可劃分為3個類群；STRUCTURE2.3.4群體結構分析表明，禾谷鐮孢復合種菌群被分為2個大類群最合適，西北地區絕大部分屬于類群A，華中地區和華南地區菌株均屬于類群B，東北地區50%以上菌株屬于類群B。、-和基因序列分析表明禾谷鐮孢復合種由禾谷鐮孢（）、亞洲鐮孢（）、布氏鐮孢（）和南方鐮孢（）構成，上述鐮孢菌中存在142個單核苷酸多態性位點（SNP），通過這些差異序列構建的聚類圖能清楚顯示出各個種內與種間的遺傳分化情況，各鐮孢種內遺傳多樣性十分豐富。禾谷鐮孢致病力最強，平均發病面積百分比為20.79%；亞洲鐮孢、布氏鐮孢和南方鐮孢的平均發病面積百分比分別為15.79%、11.77% 和 8.12%。統計分析表明，不同鐮孢種所引起的穗腐病平均發病面積占比存在顯著差異。禾谷鐮孢毒素化學型為15ADON、3ADON、NIV和3ADON+15ADON+NIV 4種，以15ADON為主；布氏鐮孢毒素化學型為15ADON、3ADON、NIV、3ADON+15ADON和3ADON+15ADON+NIV 5種，以15ADON為主；亞洲鐮孢毒素化學型只有3ADON；南方鐮孢毒素化學型為15ADON、3ADON、15ADON+NIV 3種，15ADON為優勢類型。此外，15ADON、NIV和3ADON毒素類型菌株平均發病面積百分比分別為17.87%、17.20%和12.37%。我國不同地理區域尤其是相鄰區域禾谷鐮孢復合種菌群間存在較為頻繁的基因交流與交換。本研究中禾谷鐮孢復合種的主要毒素化學型為15ADON，致病力由強到弱依次為禾谷鐮孢＞亞洲鐮孢＞布氏鐮孢＞南方鐮孢。整體看來，毒素化學型與菌種類型相關性不顯著，致病力主要與菌種類型有關。

玉米穗腐病；禾谷鐮孢復合種；遺傳多樣性；毒素化學型；致病力

0 引言

【研究意義】玉米是我國重要的糧食作物、飼料作物和能源植物，而穗腐病是玉米生產上最為重要的病害之一，嚴重影響玉米的產量和品質[1]。我國玉米穗腐病致病菌復雜多樣，真菌和細菌均可引起穗腐病，在真菌中，尤以禾谷鐮孢復合種（species complex，FGSC）和擬輪枝鐮孢（）引起的穗腐病分布最廣，危害最重[2]。2018年我國玉米產量25 717.4萬噸（http://www.stats.gov.cn/tjsj/ndsj/2019/indexch.htm），作為食用和飼用消費占2/3以上。穗腐病致病鐮孢菌產生的真菌毒素對玉米籽粒的污染給糧食安全帶來極大隱患。因此，對來自中國玉米主產區不同區域的穗腐病致病禾谷鐮孢復合種進行遺傳多樣性、致病力和毒素化學型分析，可為穗腐病的防控提供基礎信息，為保障玉米安全生產提供風險警示。【前人研究進展】禾谷鐮孢復合種是引起我國玉米穗腐病的優勢種[2-6]，其不僅能侵染玉米引起穗腐病、莖腐病、鞘腐病和苗枯病等[7]，還侵染小麥、大豆和水稻等農作物，引起小麥赤霉病[8]、大豆根腐病[9]和水稻赤霉病[10]等重要病害。更重要的是，禾谷鐮孢復合種能產生多種有害真菌毒素，例如雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）、黃色鐮刀菌素、玉米赤霉烯酮（ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）及其衍生物15ADON和3ADON[4,11]，嚴重影響了玉米籽粒的產量和品質，一旦被毒素污染的玉米產品流入市場，進入食物鏈，將對人畜健康造成嚴重威脅[12-13]。利用分子標記對植物和病原菌進行遺傳多樣性分析，已經取得了良好的結果。GAI等[14]利用ISSR分子標記分析了東北地區40株莖腐病和穗腐病禾谷鐮孢復合種菌株的遺傳多樣性和致病力，通過聚類分析，在遺傳相似系數為0.62時菌株被分為兩組；馬紅霞等[15]采用ISSR引物分析來自11個省的禾谷鐮孢復合種，發現菌株群體內存在豐富的遺傳變異，不同地理種群間存在一定的基因交流，遺傳多樣性與地理來源有關；Yerkovich等[16]采用ISSR分子標記分析了禾谷鐮孢復合種遺傳多樣性（GD=0.999—1.000）；Sneideris等[17]用10對VNTR分子標記分析了57株禾谷鐮孢菌株群體，發現較高的遺傳多樣性；任旭[18]采用VNTR和SSR標記對擬輪枝鐮孢和禾谷鐮孢復合種的部分菌株進行遺傳多樣性分析，明確其具有豐富的基因變異，證實了VNTR和SSR標記的實用性；李新鳳等[19]依據擬輪枝鐮孢的EST序列，開發出25對SSR引物，并證明可用于擬輪枝鐮孢及其近緣種的遺傳多樣性分析。【本研究切入點】目前，在中國報道能引起玉米穗腐病的禾谷鐮孢復合種已達10個種（禾谷鐮孢、亞洲鐮孢、布氏鐮孢、南方鐮孢、九州鐮孢、梨孢鐮孢、擬枝孢鐮孢、黃色鐮孢等）。不同地理區域禾谷鐮孢復合種菌群構成、產毒素潛力及致病力、遺傳變異等方面差異較大。SSR、VNTR分子標記技術在進行鐮孢菌遺傳分析上應用廣泛且成熟，結合運用、-和基因序列分析禾谷鐮孢復合種遺傳多樣性的研究報道較少，將二者結合，互為補充，更能準確地對鐮孢菌進行遺傳分化與多樣性分析。【擬解決的關鍵問題】分析我國7個地理區域（華北、華中、華東、東北、華南、西北和西南地區）禾谷鐮孢復合種的遺傳多樣性、致病力和毒素化學型，為玉米穗腐病的綜合防控、鐮孢菌致病機理相關研究以及玉米品種的抗病鑒定相關工作提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

2014—2018年，在中國13個省（直轄市、自治區）（河北、河南、安徽、山東、陜西、重慶、四川、云南、北京、遼寧、廣西、貴州、黑龍江）采集玉米病穗樣本，并用組織分離法對采集到的玉米樣品進行病原菌分離鑒定[2,5-6]，確定菌種的構成。為分析分離致病菌中禾谷鐮孢復合種的遺傳多樣性，從不同省（直轄市、自治區）選取具代表性的禾谷鐮孢復合種45株，根據地理來源將其分為7大類群，分別為華北、華中、華東、東北、華南、西北和西南地區。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：DifcoTMPotato Dextrose Agar 39 g、蒸餾水1.0 L；合成低營養瓊脂（spezieller nahrstoffarmer agar，SNA）液體培養基：KH2PO41.0 g、KNO31.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、蔗糖0.2 g、葡萄糖0.2 g、蒸餾水1.0 L。

真菌基因組DNA提取試劑盒（索萊寶科技有限公司，北京）；超微量核酸蛋白測定儀（Q5000，美國QUAWELL公司）；凝膠成像系統（Tanon 4100，南京）；2×TaqPCR Master Mix、100 bp DNA Ladder（天根生化科技有限公司，北京）；玉米穗腐病圖像采集與數據處理系統（國家農業信息化工程技術研究中心定制）；水平電泳槽（DYCP-36A，北京）；立式壓力蒸汽滅菌器（LS-75HD型，濟南）；錐形瓶（150 mL）、超凈工作臺、顯微鏡、血球計數板、無菌注射器。

1.2 DNA提取

將選取的單菌株轉移到貼有玻璃紙的PDA培養基上，25℃培養5—7 d，刮取菌絲并自然晾干，取3—5 g干菌絲體裝于2.0 mL離心管中。用真菌基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取DNA。用Q5000超微量核酸蛋白測定儀測定提取DNA的濃度。

1.3 分子標記和基因測序引物

使用22對SSR引物、10對VNTR引物（表1）對所選鐮孢菌進行遺傳多樣性分析。25 μL反應體系：DNA 模板2 μL、上下游引物各1 μL，12.5 μL 2×TaqPCR Master Mix，ddH2O補足至25 μL。PCR反應程序：94℃預變性4 min；94℃變性45 s，退火溫度（視不同引物而定）45 s，72℃延伸1 min，36個循環；最后72℃延伸7 min。

表1 本試驗所用引物

續表1 Continued table 1

采用、-以及基因序列（表1）對所選菌株進行分析。的50 μL PCR反應體系：DNA模板2 μL、上下游引物各2 μL、2×TaqPCR Master Mix 25 μL、ddH2O 19 μL。PCR反應程序：94℃預變性 5 min；95℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，36個循環：72℃延伸10 min，4℃保存產物。

-的反應體系同上，PCR反應程序：94℃預變性 4 min；95℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸 1 min，36個循環；72℃延伸7 min，4℃保存產物，DNA擴增片段大小約380 bp。

反應體系同上，PCR反應程序：95℃預變性2 min；95℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，40個循環；72℃延伸7 min，4℃保存產物，DNA 擴增片段大小約800 bp。于1.2%瓊脂糖凝膠電泳后檢驗有條帶的擴增產物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序拼接結果在NCBI的BLAST模塊進行比對分析。

1.4 致病力測定

田間種植：于2019年6月在北京順義田間種植150行玉米自交品系掖478，每行留10株苗，行距60 cm，株距25 cm，重復兩次。

孢子懸浮液的制備：配備合成低營養瓊脂（SNA）液體培養基，并倒入60 mL于錐形瓶中，于立式壓力蒸汽滅菌器中滅菌，在超凈工作臺上分別將培養好的禾谷鐮孢刮取菌絲，轉移至上述錐形瓶中，記下菌株信息，連續光照12 h，25℃下振動培養3—5 d。在顯微鏡下鏡檢，使用血球計數板將濃度調至1×106個分生孢子/mL，待用。待田間玉米花絲吐出7—10 d，用無菌注射器吸取孢子懸浮液，每株玉米主穗通過花絲通道接種法[28]注射菌液2 mL，每個菌株注射接種兩行玉米，去除主穗外的其他穗并在每行玉米行頭做好標記。在玉米蠟熟后期，收集所有接種的玉米果穗，去除苞葉，利用玉米穗腐病圖像采集與數據處理系統（國家農業信息化工程技術研究中心定制），測定每個果穗的發病籽粒區域占整個果穗籽粒表面積的百分比，并計算每個菌株所接種果穗（共計20個）的平均發病面積占比。

發病面積（m）百分比計算公式：m=（d/e）×100%，其中d為玉米穗部出現穗腐癥狀的籽粒表面積，e為玉米穗部全部籽粒的面積。

平均發病面積（me）百分比計算公式：me=（∑mi）/n×100%，n為接種果穗數，mi中i選值從1到n，是每個玉米穗的發病面積百分比。

1.5 毒素化學型測定

對禾谷鐮孢復合種進行毒素化學型分子檢測，選用引物Tri13a/b。PCR反應程序：94℃預變性4 min；95℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，36個循環；72℃延伸7 min，4℃保存產物，15ADON、3ADON和NIV毒素化學型的菌株擴增片段分別為583、644和859 bp[25]，PCR反應程序同上。分別采用Tri13F/R，擴增片段415 bp，退火溫度57℃進行NIV毒素化學型的重復性檢測[26]；采用Tri303F/R，退火溫度為52℃，擴增片段586 bp，進行3ADON毒素化學型的重復性檢驗[27]；采用Tri315F/R，退火溫度為58℃，擴增片段864 bp，進行15ADON毒素化學型的重復性檢驗[27]，以鑒定特異性引物的有效性。

1.6 數據處理

穗腐病致病力數據先通過玉米穗腐病圖像采集與數據處理系統進行預處理，得到個體的表型數據，利用Excel 2010進行統計分析與處理，計算各組的平均表型值，并進行方差分析。

2 結果

2.1 微衛星引物的SSR擴增

SSR引物在45株禾谷鐮孢復合種中共檢測到等位位點數48個，多態性位點數39個，多態性條帶比率為81.25%，每對引物擴增出的多態性條帶為2—4條。對于不同菌株相同引物擴增出的條帶，同一片段大小記為‘1’，在同一位置沒有擴增條帶的記為‘0’。統計條帶信息，利用NTsys2.1采用非加權對數算術平均法（UPGMA）構建系統發育樹。

2.2 不同地理種群的遺傳多樣性

對中國7個地理種群的禾谷鐮孢復合種菌群進行遺傳多樣性分析（表2）。東北地區菌群的遺傳多樣性最為豐富，多態性位點數為39，有效等位基因數1.79，Shannon’s信息指數為0.62，Nei’s遺傳多樣性指數為0.43。禾谷鐮孢復合種7個地理種群的多態性位點數在10—39，平均Shannon’s信息指數為0.41，平均Nei’s遺傳多樣性指數為0.29，表明禾谷鐮孢復合種具有較豐富的遺傳多樣性。7個地理種群禾谷鐮孢復合種的Nei’s遺傳相似度為0.6677—0.8797，其中東北和西北地區的最高，而華中與西南地區的最低，表明華中和西南地區的菌群表現出較高的遺傳多樣性；遺傳距離為0.1282—0.4039，表明7個區域間的種群分布較為分散（表3）。

表2 禾谷鐮孢復合種的遺傳多樣性

表3 禾谷鐮孢復合種遺傳相似度和遺傳距離

2.3 禾谷鐮孢復合種地理種群的聚類分析

依據統計結果用NTsys2.1對禾谷鐮孢復合種7個地理種群遺傳距離進行UPGMA聚類分析，菌群在相似系數為0.77時，被聚類為3個大的分支，華北地區的菌株單獨聚為一類，東北、西北、西南、華南地區的菌株聚為一大類群，華中和華東地區的同在一分支（圖1）。

圖1 禾谷鐮孢復合種7個地理種群的聚類分析圖

2.4 STRUCTURE群體結構分析

使用結構分析STRUCTURE2.3.4軟件的貝葉斯聚類法對禾谷鐮孢復合種地理種群的群體遺傳結構進行分析，參數Length of Bunrin Period設為25 000，Numbers of MCMC Reps after Bunrin設為1 000 000，將K設置為1—10，K重復次數Number of Iterations設為10，將運行結果轉換成壓縮包文件在網站Structure Harvest（http://taylor0.biology.ucla.edu/structure Harvester/）中利用Evanno等[29]ΔK方法計算LnP（K）值、ΔK值和K的最大可能值，結果圖2所示，LnP（K）值隨著K值增大而增大，表明鐮孢菌群體間存在遺傳分化，當K值為2時，ΔK取最大為150，表明7個地理群體的禾谷鐮孢復合種分為兩個類群最合適。

進一步研究STRUCTURE軟件分析得到的菌群和地理區域間的關系發現，禾谷鐮孢復合種在兩個類群中，西北地區絕大部分屬于類群A，華中地區和華南地區菌株均屬于類群B，東北地區50%以上菌株屬于類群B（圖3）。

圖2 禾谷鐮孢復合種取不同K值時的ΔK值曲線圖

圖3 禾谷鐮孢復合種群體結構圖（當K值為2時）

2.5 基于基因序列構建禾谷鐮孢復合種樹形圖

通過、和基因測序對禾谷鐮孢復合種的3個基因片段序列按相同順序拼接起來，并用MEGA7.0軟件構建樹形圖進行系統發育分析（圖4）。最終，禾谷鐮孢復合種被分為4大類群，分支標記為紅色的以亞洲鐮孢為主，包括廣西、四川、陜西等相鄰地區；分支標記為淺綠色的以布氏鐮孢為主，分布在甘肅、黑龍江、北京等相鄰地區；分支標記為藍色的以南方鐮孢為主，包括貴州、重慶、云南、廣西和陜西等地區；分支標記為黑色（藍色分支的下部）的以禾谷鐮孢為代表，包括黑龍江、河南、遼寧、陜西、山東和北京地區。各地區之間菌種組成不盡相同，禾谷鐮孢和布氏鐮孢多分布在北方冷涼地區，亞洲鐮孢和南方鐮孢多分布于南方溫濕地區，在北方地區也鮮有分布，從樹形圖來看，各鐮孢菌種內部也存在小的分支，表明無論種間、種內遺傳多樣性均較為豐富。各地區間存在著豐富的遺傳變異，尤其是相鄰地區種間存在較頻繁的基因交流與交換。使用MEGA7.0軟件分析3個基因的序列，在全長1 800 bp的片段上，發現了142個單核苷酸多態性位點（SNP）。

2.6 鐮孢菌致病力測定與毒素化學型分析

禾谷鐮孢復合種以15ADON毒素化學型為主，共32株，3ADON次之，共15株，NIV 5株；3ADON主要在西北、華南、西南地區分布，有兩株菌能同時產生15ADON和3ADON，兩株菌能同時產生3種毒素化學型，一株菌能同時產生15ADON和NIV；15ADON、NIV和3ADON平均發病面積百分比分別為17.87%、17.20%和12.37%，能同時產生3種毒素化學型的菌株平均發病面積百分比為16.36%，略高于3種類型總平均發病面積百分比。禾谷鐮孢平均發病面積百分比最大，為20.79%；亞洲鐮孢、布氏鐮孢和南方鐮孢的平均發病面積百分比分別為15.79%、11.77%和8.12%，禾谷鐮孢的致病力在4種鐮孢菌中最強。禾谷鐮孢復合種在東北、華東、西南、華南、華北、華中和西北地區平均發病面積百分比分別為20.85%、18.00%、9.81%、15.22%、13.74%、13.65%和12.33%。禾谷鐮孢毒素化學型為15ADON、3ADON、NIV和3ADON+ 15ADON+NIV 4種，以15ADON為主；布氏鐮孢毒素化學型為15ADON、3ADON、NIV、3ADON+15ADON和3ADON+15ADON+NIV 5種，以15ADON為主；亞洲鐮孢毒素化學型只有3ADON；南方鐮孢毒素化學型為15ADON、3ADON、15ADON+NIV 3種，15ADON為優勢類型（表4）。不同鐮孢種引起的穗腐病平均發病面積占比存在顯著差異（=0.011＜0.05），表明不同鐮孢種之間的致病力存在較大差異（表5、表6）。禾谷鐮孢復合種在7大地理區域的菌群構成、致病力和毒素化學型分布不均勻。

圖4 禾谷鐮孢復合種RPB2+TEF-1α+β-tubulin基因聚類圖

3 討論

玉米穗腐病是一種在世界各玉米種植區頻繁發生的真菌病害，主要病原真菌為鐮孢菌。禾谷鐮孢復合種可侵染玉米根、莖、穗、葉，引起根腐病、莖腐病、穗腐病、葉斑病等病害，其產生多種真菌毒素嚴重影響玉米籽粒的品質和安全，給生產者造成巨大損失[30-31]。目前，禾谷鐮孢復合種至少包括16個種，我國已鑒定出10個種，本研究中的禾谷鐮孢復合種由禾谷鐮孢、布氏鐮孢、南方鐮孢和亞洲鐮孢組成。禾谷鐮孢在南北方均有分布；布氏鐮孢主要分布在東北、西北和華北等較冷涼地區；亞洲鐮孢多分布于華南地區，在東北、西南和西北地區也有少量分布；南方鐮孢則主要分布在西南、華南等較溫暖地區，與前人相關的研究結果基本一致[5]。本研究首次利用玉米穗腐病圖像采集與數據處理系統（國家農業信息化工程技術研究中心定制）進行穗腐病發病面積調查與數據自動化處理，穗部發病面積占比由該系統通過AI識別測定后自動生成，結果比較精確；而以往玉米穗腐病發病情況調查均由人工觀察估測，同一份材料由不同的人調查或同一個人調查不同材料的發病情況時，不可避免地產生不同程度的誤差。通過該系統測定處理的數據，消除了人為造成的誤差，能真實反映出不同鐮孢菌株所致穗腐病的發病嚴重程度。

馬紅霞等[15]報道在中國春玉米區和夏玉米區禾谷鐮孢復合種的毒素化學型主要為DON和15ADON，溫暖地區如長江流域則以3ADON和NIV為主；本研究組[2]于2018—2019年全面分析了黑龍江地區禾谷鐮孢復合種的毒素化學型，發現禾谷鐮孢與布氏鐮孢均以產DON毒素衍生物為主，僅1株亞洲鐮孢產NIV毒素；Aamot等[32]報道了挪威小麥赤霉病病原菌禾谷鐮孢以3ADON類型占主導；Sneideris等[17]在57株禾谷鐮孢中發現47株能產生15ADON。在本研究中，禾谷鐮孢復合種的毒素化學型較為豐富，禾谷鐮孢、布氏鐮孢和南方鐮孢均能產生15ADON、3ADON和NIV 3種毒素化學型，亞洲鐮孢只發現3ADON型，總體以15ADON和3ADON型占主導，其中15ADON類型的最多，產生NIV的菌株較少，與前人相關研究對比不難發現，優勢產毒類型的菌群已發生一定程度的變化。

有關禾谷鐮孢復合種的致病力分析在小麥上報道較多，在玉米穗腐病上報道很少。Ward等[33]研究發現，小麥赤霉病病原菌禾谷鐮孢產3ADON的菌株與產15ADON的菌株相比，單端孢霉烯含量更高，且繁殖力更強、生長速率更快；李偉等[34]利用30株小麥赤霉病的亞洲鐮孢和1株禾谷鐮孢進行致病力測定及毒素化學型分析，結果表明在長江流域，產3ADON的亞洲鐮孢致病力最強，產15ADON的亞洲鐮孢菌株在小麥品種上表現的致病力很弱；杜青等[35]對廣西地區禾谷鐮孢復合種進行毒素化學型分析未檢測到產3ADON的菌株。本研究表明，對于玉米穗腐病而言，產15ADON毒素化學型菌株比產3ADON毒素化學型菌株的致病力強，結論有所不同，可能與李偉等[34]的研究中產15ADON的菌株樣本量太少（僅1株）有關，也可能與寄主植物本身的特性有關。GAI等[14]對40株禾谷鐮孢菌復合種致病力測定中，得到各菌株的病情指數在58.9—89.3，且致病力不存在地域性差異；但本試驗發現北方區域菌株致病力較南方的強，總體而言，由北向南禾谷鐮孢復合種致病力逐漸減弱。樣本的數量選取對試驗結果影響較大，尤其是遺傳多樣性分析，樣本群體數量足夠大，可能包含的基因越豐富，毒素化學型也更全面，本研究囿于材料等的限制（結合前人的研究，特定菌株在一些地區的玉米穗腐樣本上分離頻率比較低[2,5-6,15]，本試驗也如此，例如南方鐮孢主要在南方地區分布，布氏鐮孢主要在北方地區有分布，一些地區雖然分離了大量的禾谷鐮孢，但為了保證試驗均衡及代表性，去掉了同一地理來源的菌株），在樣本選取上最大限度地保證禾谷鐮孢復合種菌種的多樣化以及每個菌株地理來源的差異性，因此，盡管菌株數量偏少，但所選菌株具有較好的代表性。下一步可以擴大樣品的采集數目并對樣本數量最優選取進行探討，以選出最適合試驗的菌群數。

表4 禾谷鐮孢復合種致病力與毒素化學型

表5 不同鐮孢種引起的穗腐病發病面積占比統計分析

表6 不同鐮孢種致病力方差分析

禾谷鐮孢復合種存在大量的單核苷酸多態性位點，具有高度適應環境的潛力，將遺傳變異與表型變化聯系起來仍然具有挑戰性。Laurent等[36]使用全基因組重測序在單核苷酸水平上研究了6個法國禾谷鐮孢的基因組多樣性，共檢測到242 756個高度可信遺傳變異位點，其中96%為單核苷酸多態性，約80%的禾谷鐮孢編碼蛋白的基因上產生了多態性。本研究通過SSR+VNTR分子標記結合、和基因測序對禾谷鐮孢復合種進行遺傳多樣性分析，通過比較3個基因序列，共發現142個單核苷酸多態性位點，說明禾谷鐮孢遺傳變異具有高度的適應性。與傳統的利用分子標記特異性擴增來分析鐮孢菌的遺傳多樣性相比，利用基因測序，通過這些差異序列構建的聚類圖能清楚顯示出各種內與種間的遺傳分化情況，構建樹形圖更精細，分支更多而精準，甚至還能比較任意兩個菌株的單核苷酸多態性，但其不能覆蓋菌株所有的染色體，將二者結合，進行局部和整體的全面分析，有利于深入研究。

馬紅霞等[15]研究發現，相同地理來源例如同屬春玉米區或夏玉米區的菌株有較近的親緣關系，且不同地理種群間存在基因交流，遺傳多樣性水平與地理來源有關。本研究發現在7大地理區域，菌群構成、致病力和毒素化學型分布都不均勻，華中和華東地區菌群親緣關系較近，西南和東南、東北和西北地區菌群親緣關系較近。Aamot等[32]研究了挪威45株禾谷鐮孢復合種的平均遺傳多樣性指數（H）在0.17—0.43，發現近些年采集的菌株要比前些年收集菌群的遺傳多樣性數值高。隨著人們農業生產活動多元化，致病菌間的基因交流會愈加頻繁，遺傳多樣性水平也會因此上升，是否會導致侵染性更強，需要多年持續跟蹤的研究。

4 結論

禾谷鐮孢復合種包括禾谷鐮孢、布氏鐮孢、亞洲鐮孢和南方鐮孢，其毒素化學型含15ADON、3ADON、NIV及其組合型，以15ADON和3ADON為主，禾谷鐮孢的致病力在4種鐮孢菌中最強，且致病力強弱與毒素化學型有關。基于SSR和VNTR分子標記結合、和基因測序分析，表明在7個地理區域內部或各區域之間，禾谷鐮孢復合種群體各鐮孢菌種間和種內均存在豐富的遺傳變異，相鄰區域間鐮孢菌的基因交流與交換發生頻繁；遺傳多樣性水平與地理來源、菌種構成、毒素化學型以及樣本量均有關。

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The Genetic Diversity, Pathogenicity, and Toxigenic Chemotypes ofSpecies Complex Causing Maize Ear Rot

WANG BaoBao1, GUO Cheng2, SUN SuLi1, XIA YuSheng1, ZHU ZhenDong1, DUAN CanXing1

(1Institute of Crop Sciences/National Key Facility of Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;2Institute of Plant Protection, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070)

【】The objective of this study is to clarify the genetic structure, pathogenicity, toxigenic chemotypes, and their relationship ofspecies complex (FGSC) causing maize ear rot in China, and to provide reference information for prevention and control of Fusarium ear rot of maize.【】The samples were collected from the main maize producing areas in China. Twenty-two pairs of SSR and 10 pairs of VNTR primers, along with,andgene sequences were used for genetic diversity and Popgen32, NTsys2.1, and STRUCTURE2.3.4 software were used to analyze the data and construct the phylogenetic tree. The pathogenicity of FGSC was determined using the silk channel injection inoculation method, and the specific primers were used to detect the toxigenic chemotypes.【】A total of 48 alleles were detected by SSR and VNTR primers, 39 polymorphic sites were found, with a polymorphic band ratio of 81.25% among 45 strains, the polymorphic bands ranged from 2 to 4. The average Shannon’s information index and Nei’s genetic diversity index of the 7 FGSC geographic populations were 0.41 and 0.29, respectively, the genetic similarity in 7 regions was 0.6677-0.8797, and the genetic distance was 0.1282-0.4039, indicating that there existed rich genetic diversity among the flora. Based on the Nei’s genetic distance, 7 FGSC geographical populations were divided into 3 groups by UPGMA clustering. The population structure of FGSC stains could be divided into two different groups by STRUCTURE2.3.4.Most of the strains from Northwest China belonged to group A, those in Central China and South China belonged to group B, and more than 50% of the strains in Northeast China belonged to group B. Based on the sequences of,-and, FGSC was composed of,,, and.There were 142 single nucleotide polymorphisms (SNPs) among thesestrains. The dendrogram constructed by these differential sequences could clearly show the genetic differentiation within and between species. The genetic diversity within eachspecies was rich. Among fourspecies, the pathogenicity ofwas the strongest, with an average diseased ear area of 20.79%. The average diseased areas of,, andwere 15.79%, 11.77%, and 8.12%, respectively. The difference in the percentage of average diseased area was significant betweenspecies. The toxigenic chemotypes ofwere 15ADON, 3ADON, NIV, and 3ADON + 15ADON + NIV,contained 15ADON, 3ADON, NIV, 3ADON + 15ADON, and 3ADON + 15ADON + NIV chemotypes, the toxigenic chemotypesofwere 15ADON, 3ADON, and 15ADON+ NIV, the 15ADON chemotype was the most frequently detected, whilemerely contained 3ADON chemotype. In addition, the average diseased ear areas of 15ADON, NIV and 3ADON type strains were 17.87%, 17.20%, and 12.37%, respectively.【】There existed frequent gene exchanges between different FGSC geographical populations, especially in adjacent regions. 15ADON type is the predominant toxigenic chemotype of FGSC in 7 geographic regions. The pathogenicity ofis the strongest, followed by,,andaccording to the percentage of the diseased area caused by differentspecies. In this study, the correlation between toxigenic chemotypes andspecies is not significant, and the pathogenicity is mainly related tospecies.

maize ear rot;species complex (FGSC); genetic diversity; toxigenic chemotype; pathogenicity

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.23.005

2020-03-26；

2020-05-06

國家重點研發計劃（2016YFD0100103）、農作物種質資源保護與利用專項（2020NWB036-12）、中國農業科學院農業科技創新工程

王寶寶，E-mail：1443094080@qq.com。通信作者段燦星，E-mail：duancanxing@caas.cn

（責任編輯 岳梅）